Scheda n. 14. Vania Bresolin Cinetica enzimatica. Costruzione di una curva di taratura standard glucosio + fruttosio

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1 Scheda n. 14 Vania Bresolin Cinetica enzimatica Costruzione di una curva di taratura standard glucosio + fruttosio ITAS Santorre di Santarosa Istituto Tecnico, settore Tecnologico Indirizzo Chimica, Materiali e Biotecnologie Opzioni: Biotecnologie Sanitarie Biotecnologie Ambientali Laboratori di Chimica corso Peschiera, Torino tel sito web santorre@santorre.it Progetto: Libro elettronico di laboratorio docenti: Vania Bresolin Patrizia Sgalambro Gianni Saglietto anno scolastico

2 Gli obiettivi di questa esperienza sono: Obiettivi e principi teorici Acquisire abilità manuale nell utilizzo di pipette e micropipette. Misurare allo spettrofotometro le assorbanze di soluzioni a concentrazione nota di glucosio e fruttosio dopo reazione con un reagente che dà origine ad un cromoforo. Costruire una curva di taratura standard che metta in relazione i valori di assorbanza con le concentrazioni note di glucosio e fruttosio. Allo scopo di realizzare gli obiettivi, si preparano diverse soluzione a concentrazione nota dei due monosaccaridi e si fanno reagire le soluzioni a concentrazione nota di glucosio e fruttosio con una soluzione di 3,5-dinitrosalicilato di sodio, colorata di giallo. Il 3,5-dinitrosalicilato di sodio reagisce in modo quantitativo con gli zuccheri e viene da questi ridotto a 3-ammino, 5-nitrosalicilato di sodio rosso, che presenta un massimo di assorbimento della luce a 540 nm. Si costruisce quindi la curva di taratura standard misurando mediante lo spettrofotometro, l assorbanza di soluzioni di concentrazioni differenti di 3-ammino, 5-nitrosalicilato di sodio ottenute a partire da soluzioni a concentrazione nota di D-glucosio e D-fruttosio. Prima misurare allo spettrofotometro le assorbanze delle soluzioni di 3-ammino, 5-nitrosalicilato di sodio è necessario azzerare lo strumento. Questa operazione viene indicata come fare il bianco e richiede che tutte le sostanze coinvolte direttamente o indirettamente nella reazione (reagenti e loro solventi), tranne la specie da determinare, anche se colorate, vengano poste in maniera fittizia ad un valore zero di assorbanza. Lo scopo di questa operazione è quello di fare in modo che, a reazione avvenuta, sia possibile rilevare solo i cambiamenti rispetto alla situazione di partenza. In altre parole, la miscela di reazione utilizzata per determinare il bianco deve contenere tutti i reagenti escluso quello che subirà la reazione, quindi in questo caso tutte le sostanze tranne il glucosio e il fruttosio. La curva di taratura che prepareremo è ricavata da una soluzione che contiene, oltre a glucosio e fruttosio (due zuccheri riducenti), anche saccarosio (uno zucchero non riducente). Il saccarosio non subirà l ossidazione da parte del 3,5-dinitrosalicilato di sodio, ma la sua presenza nella miscela di reazione è importante come bianco. Nelle due esperienze successive, dove verrà studiata l influenza di alcuni parametri sull attività enzimatica, vedremo come questo disaccaride svolga un ruolo determinante dando origine a zuccheri riducenti, pur restando, in parte, inalterato nella miscela di reazione. La curva di taratura glucosio + fruttosio sarà utilizzata per determinare le concentrazioni incognite di glucosio + fruttosio che si verranno a formare dalla reazione dell enzima invertasi (o saccarasi) sul substrato saccarosio. Basterà infatti, dal punto della curva di taratura corrispondente al valore della assorbanza trovata, abbassare una retta sull ascissa per trovare la concentrazione di glucosio + fruttosio della soluzione in esame. La concentrazione di glucosio + fruttosio può anche essere determinata dall equazione della retta di taratura. 2

3 Attrezzatura e materiali Attrezzatura Spettrofotometro Vortex 2 Bunsen 2 Treppiede con reticella spargifiamma 2 Becher da 1 L con apposito portaprovette 4 posti Portaprovette 12 posti 8 Provette 16 x Tappi ad innesto per provette 16 x 160 Pinza di legno Provette 16 x160 e tappi ad innesto per provette Micropipetta da 0,1-1 ml con rispettivi puntali Micropipetta da 1-5 ml con rispettivi puntali Pipetta graduata da 10 ml Palla di Peleo Cuvette Materiali Soluzione 0,01 M di glucosio + fruttosio Soluzione 0,5 M di saccarosio Soluzione tampone acetato 0,05 M ph = 4,7 Soluzione 1% 3,5-dinitrosalicilato di sodio Acqua distillata 3

4 Procedimento L esperienza viene condotta in coppia. Un allievo introduce i reagenti nelle prime quattro provette, il secondo nelle altre quattro. Mettere l acqua nei 2 becher da litro con l apposito portaprovette a 4 posti e scaldare fino ad ebollizione. Intanto disporre 8 provette nel portaprovette a 12 posti e numerarle da 1 a 8 con il pennarello vetrografico. Disporre i reagenti nel seguente ordine: tampone acetato 0,05 M ph = 4,7 saccarosio 0,5 M glucosio + fruttosio 0,01 M acqua 3,5-dinitrosalicilato di sodio 1 %. Introdurre nelle 8 provette (p1-p8) i reagenti nei volumi qui di seguito riportati. Quando sarà necessario verrà anche indicata l operazione da compiere ad un certo momento della sequenza. Reagenti Volumi [ml] nelle provette p1 p2 p3 p4 p5 p6 p7 p8 tampone acetato 0,05 M ph = 4,7 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 saccarosio 0,5 M 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 glucosio + fruttosio 0,01 M / 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 acqua 1,5 1,3 1,1 0,9 0,7 0,5 0,3 0,1 3,5-dinitrosalicilato di sodio 1 % 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Immergere le provette in acqua bollente (inizio reazione) per 5 minuti esatti. (La reazione tra glucosio / fruttosio e il 3,5-dinitrosalicilato di sodio avviene solo in queste condizioni). acqua 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 Chiudere le provette con i tappi ad innesto. Agitare le provette nel vortex per uniformare le soluzioni e raffreddare a temperatura ambiente. Azzerare lo spettrofotometro con il bianco (soluzione nella provetta 1) alla lunghezza d onda di 540nm. Leggere allo spettrofotometro le assorbanze delle soluzioni contenute nelle altre provette e annotare le misure nella sezione dati e calcoli. Costruire il grafico di taratura secondo quanto indicato nella sezione dati e calcoli. 4

5 Dati e calcoli Dati Concentrazione slz GLU+FRU : 0,01 M = 0,01 mol/l = 0,01 mmol/ml V FINALE reazione = 12 ml V slz GLU+FRU aggiunti nelle 8 provette (p1 p8) [ml] N provetta p1 p2 p3 p4 p5 p6 p7 p8 V slz GLU+FRU 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Trascrivere i valori delle assorbanze misurate allo spettrofotometro alla lunghezza d onda di 540 nm. Dati registrati: Assorbanze misurate a 540 nm (A 540nm ) N provetta p1 p2 p3 p4 p5 p6 p7 p8 A 540 nm 0,000 Calcoli Primo parametro da determinare è la concentrazione di glucosio + fruttosio in µmol/ml (C GLU+FRU [µmol/ml]) presente nelle 8 provette. Impostazione dei calcoli C GLU+FRU [µmol/ml] C slz GLU+FRU [mmol/ml] x V GLU+FRU aggiunti [ml] x1000 [µmol/mmol] V FINALE reazione [ml] Le concentrazioni di glucosio + fruttosio nelle 8 provette sono le seguenti: Concentrazioni (C) di glucosio+ fruttosio [µmol/ml] nelle 8 provette (p1-p8) N provetta p1 p2 p3 p4 p5 p6 p7 p8 C GLU+FRU 0,000 Altro parametro da determinare è l equazione della retta di taratura e quindi il coefficiente angolare m di tale retta. Occorre pertanto costruire un grafico. 5

6 Si annotano dapprima in una tabella i valori di assorbanza letti a 540 nm, che verranno poi riportati in ordinate (asse y) e i valori calcolati delle concentrazioni di glucosio + fruttosio espressi in µmol/ml, che verranno poi riportati in ascisse (asse x). C GLU+FRU [µmol/ml]) Assorbanza a 540 nm (A 540nm ) Costruire il grafico utilizzando un apposito programma (Excel oppure Open Office). Riportati i valori sull asse delle x e delle y, si individuano otto punti di coordinate x;y. Tracciare una retta che interpoli i punti segnati sul grafico che parta dall origine degli assi, ossia dal punto (0;0), escludendo, se necessario, valori anomali. Nota La retta deve passare per l origine, ossia per il punto 0;0. Ricordarsi pertanto di impostare intercetta = 0;0. La retta deve avere equazione y = mx, poiché q = 0. Costruito il grafico, annotare nella tabella seguente i parametri della retta di taratura glucosio + fruttosio: Parametri della retta di taratura glucosio + fruttosio m q 0 Equazione della retta di taratura glucosio + fruttosio: 6

7 Approfondimento I dati misurati e i risultati ottenuti nel corso dell anno scolastico dagli alunni della classe quinta sezione M sono riassunti nelle seguenti tabelle: Dati registrati Alunni Assorbanze misurate a 540 nm (A 540nm ) nelle provette p1 p2 p3 p4 p5 p6 p7 p8 Gottardi - Pezua O. 0,000 0,098 0,198 0,318 0,479 0,592 0,766 0,871 Spagnolo - Divolo 0,000 0,140 0,263 0,385 0,496 0,615 0,720 0,874 Piepoli - Berrino 0,000 0,115 0,207 0,299 0,503 0,605 0,714 0,862 Guglielmo - Boni 0,000 0,121 0,237 0,362 0,526 0,624 0,721 0,832 Pezua A. Molaro 0,000 0,135 0,255 0,368 0,501 0,610 0,713 0,864 Bertinotti - Tota 0,000 0,092 0,194 0,336 0,423 0,577 0,667 0,810 Bochicchio - Savino 0,000 0,097 0,236 0,388 0,454 0,614 0,692 0,766 Assorbanze medie nelle otto provette (p1-p8) N provetta p1 p2 p3 p4 p5 p6 p7 p8 A 540nm media 0,000 0,114 0,227 0,351 0,483 0,605 0,713 0,840 7

8 Riportando sull asse delle ascisse (asse x) i valori delle concentrazioni di glucosio + fruttosio calcolate espresse in µmol/ml e sull asse delle ordinate (asse y) i valori medi delle assorbanze misurate alla lunghezza d onda di 540 nm, si ottiene il seguente grafico: A 540nm 0,900 0,800 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 Curva di taratura glucosio + fruttosio - media classe y = 0,7174x R² = 0,9994 0,000 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 C glu + fru [µmol/ml] Parametri della retta di taratura GLU + FRU m q 0,72 0 Equazione retta di taratura: y = 0,72 x 8

9 Bibliografia Biochimica di base in laboratorio Giuliano Ricciotti Italo Bovolenta Editore, ISBN Carbohydrate Analysis: Can We Control the Ripening of Bananas? S. Todd Deal,* Catherine E. Farmer, and Paul F. Cerpovicz Journal of Chemical Education 2002, 79 (4), p 479 9