Pathologica (2002) 94:257-262 Springer-Verlag 2002 BIOLOGIA MOLECOLARE M.P. Martegani A. Gasbarri A. Bartolazzi L. Ruco Calcifying fibrous pseudotumour of pleura: a case report Introduzione Recenti evidenze sperimentali dimostrano che una specifica traslocazione t(x;18)(p11.2;q11.2) è presente nella quasi totalità dei sarcomi sinoviali [1, 2]. Questa traslocazione rappresenta pertanto un utile marcatore per le forme monofasiche ed indifferenziate di questi tumori che possono offrire difficoltà diagnostiche con le tecniche istomorfologiche convenzionali [3-7]. È interessante notare che, nonostante il coinvolgimento del cromosoma X in questa traslocazione, il rapporto tra maschi e femmine affetti da sarcoma sinoviale è approssimativamente pari ad uno. La traslocazione t(x;18) determina la fusione del gene SYT situato in 18q11 con un gene SSX situato in Xp11 [8, 9] (Fig. 1). Il gene SYT è normalmente espresso in diversi tipi cellulari, sia nei tessuti embrionali che nell adulto [10]. La proteina codificata da SYT è ricca in prolina, glutamina e glicina, ha una localizzazione nucleare e si ritiene possa agire da attivatore trascrizionale [11, 12]. I geni SSX costituiscono una famiglia di geni, di cui al momento sono noti cinque membri denominati SSX1-5. Questi geni, composti da almeno sei esoni, sono caratterizzati da una elevata omologia di sequenza [13-15]. Diversamente da quanto riportato per SYT, l espressione dei geni SSX nei tessuti normali è limitata al testicolo e, in misura minore, alla tiroide [3, 15]. Di particolare interesse è invece il fatto che assortimenti di questi geni sono espressi in maniera preferenziale nel melanoma e in una larga varietà di carcinomi [16]. M.P. Martegani ( ) A. Gasbarri A. Bartolazzi L. Ruco Anatomia Patologica, Ospedale S. Andrea, II Facoltà di Medicina, Università La Sapienza, Via di Grottarossa 1035-1039, I-00189 Roma, Italia e-mail: luigi.ruco@uniroma1.it Tel.: +39-06-80345423 Fax: +39-06-80345001 Sulle funzioni dei geni SSX sono disponibili pochissime informazioni in letteratura. Le proteine SSX contengono una regione N-terminale con omologia al dominio KRAB (KRuppel Associated Box, vedi Fig.1). Questa regione è presente in una famiglia di proteine che hanno una potente attività di repressione della trascrizione [11, 13]. Nella regione C-terminale di queste molecole è stata inoltre individuata una regione con attività di repressione della trascrizione, denominata SSX-RD (SSX repression domain) [17]. L espressione dei geni SSX, ristretta al testicolo e ad alcuni tipi di tumore, è simile al pattern di espressione di altri geni codificanti proteine definite cancer-testis antigens (CTA). Questi geni sono stati identificati in conseguenza dell effetto immunogenico dei loro prodotti proteici nei pazienti portatori di neoplasie maligne (ad esempio, GAGE, MAGE, BAGE, etc.). Una caratteristica molto interessante del gruppo di geni codificanti antigeni CTA fino ad oggi identificati, al quale anche i geni SSX appartengono, è la loro comune localizzazione in una regione ristretta del cromosoma X. Il significato dell attivazione selettiva di questi geni durante il processo di trasformazione neoplastica è tuttora ignoto, ma una dettagliata conoscenza dei meccanismi che regolano questa funzione potrebbe fornire elementi importanti per comprendere gli aspetti fisiopatologici che sono alla base di molte patologie neoplastiche, permettendo di identificare potenziali bersagli per nuove strategie terapeutiche di tipo oncologico. Come effetto della traslocazione t(x;18) i trascritti chimerici SYT/SSX codificano proteine in cui gli ultimi otto amminoacidi di SYT sono sostituiti dagli ultimi 78 aminoacidi di SSX1,SSX2 o SSX4. La proteina di fusione risultante è lunga 457 aminoacidi [9, 13]. Sono comunque state descritte diverse varianti molecolari di trascritti di fusione SYT/SSX, queste forme varianti solitamente differiscono per la diversa posizione del punto di giunzione tra SYT e SSX e quindi determinano lunghezze diverse dei due componenti che formano il trascritto chimerico (Fig. 2).
258 Fig. 1 Rappresentazione schematica della proteina SYT, delle proteine SSX1, SSX2, SSX4 e della proteina chimerica SYT/SSX, in cui gli ultimi 8 aminoacidi di SYT sono sostituiti dagli ultimi 78 aminoacidi di SSX1, SSX2 o SSX4. Le frecce rappresentano il punto di giunzione. L.N., Dominio di localizzazione nucleare di SYT; KRAB, Kruppel associated box; SSX-RD, dominio con attività repressiva Sono state anche riportate alcune varianti di splicing di questi trascritti sia nella porzione derivata da SYT che in quella derivata da SSX; recentemente è stato descritto un nuovo gene di fusione, in cui SYT è fuso con una forma di SSX4 priva dell esone 5, il rispettivo trascritto era co-espresso con SYT/SSX4 ed è stato denominato SYT/SSX4v [18]. Le proteine di fusione SYT/SSX hanno localizzazione nucleare e hanno mostrato di possedere proprietà di attivazione della trascrizione, analogamente ai prodotti dei geni wild type. Studi con mutanti di delezione hanno mostrato che il dominio di localizzazione nucleare di SSX coincide con il suo dominio di repressione al C-terminale (SSX-RD), mentre per l ingresso nel nucleo di SYT, sembra necessario un dominio codificato da una sequenza aminoacidica compresa all interno degli aminoacidi 51-90. Entrambi questi segnali di localizzazione nucleare sono mantenuti nella proteina di fusione. Le proteine SYT e SSX sono sprovviste di domini di legame al DNA riconoscibili, pertanto è presumibile che la Fig. 2 Schema della struttura di alcuni trascritti chimerici SYT/SSX. A e B rappresentano le forme classiche di questi trascritti chimerici, mentre le altre sono alcune delle forme meno comuni riportate in letteratura. Il rettangolo grigio nel trascritto D indica un inserto di 87 nucleotidi, mappati sul cromosoma X. Il trascritto F è una forma di SYT/SSX4, in cui SYT presenta un esone variante, rappresentato da un rettangolo grigio. Nelle forme A-E la numerazione dei nucleotidi si riferisce al gene SYT (GenBank # HSSYT ) ed ai geni SSX1 e SSX2 (GenBank # X86174 e X86175). Nelle forme F e G la numerazione si riferisce alla sequenza pubblicata in GenBank # AF257500
259 funzione regolatrice della trascrizione avvenga tramite interazioni proteina-proteina con altri fattori trascrizionali nucleari. Le proteine chimeriche SYT/SSX sono probabilmente coinvolte nella deregolazione della trascrizione di geni bersaglio, anche se al momento non si hanno informazioni su quali possano essere i geni regolati in maniera specifica dalle proteine SYT e SSX, tramite interazioni dirette o indirette con fattori di trascrizione. La diagnosi molecolare del sarcoma sinoviale Nel sarcoma sinoviale, a causa della traslocazione t(x;18), vengono espressi diversi prodotti dei geni chimerici SYT/SSX. La presenza di queste molecole anomale può essere sfruttata per migliorare l accuratezza diagnostica di questi tumori, in particolar modo per le lesioni monofasiche e indifferenziate. La dimostrazione della presenza dei trascritti dei geni di fusione, ottenuta tramite analisi con tecniche di RT-PCR, può consentire di confermare la diagnosi morfologica di sarcoma sinoviale. Fino ad oggi, utilizzando tecniche di RT-PCR con primer oligonucleotidici specifici per le regioni fiancheggianti la giunzione tra SYT e SSX, sono stati identificati trascritti di fusione prevalentemente del tipo SYT/SSX1 e SYT/SSX2. Questi trascritti sono espressi in maniera specifica in circa il 97% dei sarcomi sinoviali. Finora sono stati descritti solo due casi di espressione di SYT/SSX4 [19, 20], mentre non sono mai stati riportati casi in cui SYT è fuso a SSX3 o SSX5. Generalmente, per individuare il prodotto di fusione SYT/SSX, espresso dal sarcoma sinoviale, si esegue una RT- PCR, utilizzando primer oligonucleotidici che possiamo definire convenzionali (Tab. 1 e Fig. 3), posti uno in una regione di SYT a monte del punto di fusione con SSX e l altro nella regione non tradotta al 3 dei geni SSX. Il prodotto di questa PCR è riamplificato con una PCR nested, utilizzando una coppia di primer più interni, specifici di volta in volta per SYT/SSX1 e per SYT/SSX2 (Fig. 3). I primer utilizzati per sondare la presenza di SYT/SSX1 e SYT/SSX2 possono anche individuare la presenza di SYT/SSX4, in quanto la sequenza di questo prodotto di fusione differisce molto poco da quelle dei precedenti [20]. Tuttavia, non tutti i casi di sarcoma sinoviale risultano esprimere SYT/SSX1, SYT/SSX2 o SYT/SSX4, suggerendo la possibilità che l approccio alle diagnosi molecolare non sia stato ancora ottimizzato. Una spiegazione di questo mancato riconoscimento potrebbe derivare dal mancato appaiamento di uno o entrambi i primer alle rispettive sequenze complementari. È possibile che uno o entrambi i primer non possano appaiarsi alla loro regione complementare sul cdna perché il punto di giunzione tra i due geni è in una posizione differente da quella prevista e la regione complementare di un primer non è più presente sul trascritto chimerico. Un altra possibilità è che, a causa di processi di splicing alternativo, vengano a mancare uno o più esoni contenenti le regioni complementari necessarie all appaiamento dei primer [21]. Per risolvere almeno in parte questo problema, è necessario scegliere accuratamente gli oligonucleotidi da utilizzare come primer in RT-PCR nested. In un recente lavoro [22] è stato proposto un protocollo ottimizzato per verificare la presenza di prodotti di fusione in alcuni casi di sarcoma sinoviale precedentemente negativi per SYT/SSX all analisi standard. Il metodo proposto si basa su una RT-PCR nested (vedi Fig. 3), in cui gli oligonucleotidi utilizzati come primer esterno ed Tabella 1 Primer oligonucleotidici utilizzati per l amplificazione dei prodotti di fusione SYT-SSX Primer convenzionali Sequenza Fonte SYT-3 5 -CAACAGCAAGATGCATACCA-3 Crew e coll. 1995 [13] SSX-A 5 -CACTTGCTATGCACCTGATG-3 Fligman e coll. 1995 [3] PCR interna per SSX1 A SYT-4 5 -AGACCAACACAGCCTGGACCA- 3 Fligman e coll. 1995 [3] SSX1-4 5 -GGTGCAGTTGTTTCCCATCG- 3 Fligman e coll. 1995 [3] PCR interna per SSX2 SYT-4 5 -AGACCAACACAGCCTGGACCA- 3 Fligman e coll. 1995 [3] SSX2-4 5 -TCTCGTGAATCTTCTCAGAGG- 3 Crew e coll. 1995 [3] Primer ottimizzati Sequenza Fonte SYT343+ 5 -GGTGGGGGTCCTCCTGCACCG- 3 Brodin e coll. 2001 [18] SSX-A 5 -CACTTGCTATGCACCTGATG-3 Fligman e coll. 1995 [3] B PCR interna SYT-5 5 -CCTCCAGAAGGCATGAACC- 3 Brodin e coll. 2001 [18] SSX1-3 5 -CTCGTCATCTTCCTCAGGGTC- 3 Brodin e coll. 2001 [18]
260 Fig. 3 Schema amplificazioni. Rappresentazione schematica del trascritto chimerico SYT/SSX e posizione dei primer utilizzati per l analisi in RT-PCR Metodo convenzionale: A, per le reazioni B e C; B, nested-pcr per SYT/SSX1; C, nested-pcr per SYT/SSX2. La presenza eventuale di SSX4 può venire comunque evidenziata data l omologia di sequenza sia nella reazione B che nella C (vedi [20]). Metodo ottimizzato: D, ; E, nested-pcr per tutti gli SSX. I dettagli delle condizioni di PCR sono illustrati nella Tabella 2. Le reazioni sono state eseguite per 30 cicli interno, specifici per SYT (denominati SYT343+ e SYT5), sono posti molto a monte del punto di fusione tra i due geni, il primer esterno per SSX (denominato SSXA) è complementare ad una sequenza non tradotta subito a valle dei geni SSX, mentre il primer interno per SSX (denominato SSX1-3) è situato nella regione al 3 del gene, all interno dell esone 6. Mediante l utilizzazione di questo metodo, è stato possibile individuare prodotti di fusione SYT/SSX in 2 su 9 casi di sarcoma sinoviale, in precedenza considerati negativi per la traslocazione, tramite l analisi in RT-PCR convenzionale. Dei due casi rivelatisi positivi con il metodo ottimizzato, uno esprimeva il trascritto SYT/SSX2, evidentemente sfuggito all analisi precedente, mentre l altro esprimeva un nuovo prodotto di fusione variante, in cui il punto di giunzione tra SYT e SSX si trovava in una posizione diversa. In questo caso, il risultato era un trascritto chimerico in cui SYT era più corto di 132 bp e SSX più lungo di 144 bp, come dimostrato dall analisi di sequenza. Comunque, dal punto di vista teorico, l utilizzo di primer specifici per la regione presente al 3 di SSX, come nel metodo ottimizzato, potrebbe fallire nell individuare altre varianti. È stata infatti descritta una forma variante di SYT/SSX1, mancante dell esone 6 di SSX1 [21], che utilizzando il protocollo ottimizzato sopra descritto non sarebbe stata individuata, in quanto il primer specifico per SSX non avrebbe potuto appaiarsi alla sua sequenza complementare posta proprio sull esone 6. Questo fatto dimostra che a tutt oggi è necessario porre molta attenzione nel caratterizzare molecolarmente i casi di sarcoma sinoviale in cui non è possibile dimostrare la presenza di alcun trascritto di SYT/SSX in RT-PCR, mediante l uso di primer convenzionali. È infatti possibile che molti, se non tutti i casi di sarcoma sinoviale che risultano negati- vi all analisi convenzionale di SYT/SSX, esprimano in realtà dei geni di fusione nuovi o inattesi. Questo è giustificato dal fatto che una completa e definitiva caratterizzazione dei geni coinvolti in questa traslocazione, in particolare delle potenziali varianti di splicing alternativo dei trascritti specifici, non è al momento disponibile. Fino ad oggi sono state descritte diverse varianti molecolari e di splicing di SYT/SSX [3, 13, 18, 22, 23], molte di queste possono sfuggire all analisi in RT-PCR effettuata con i primer di uso comune riportati in letteratura. L ottimizzazione dell analisi in RT-PCR e la conseguente migliore caratterizzazione molecolare di vecchie e nuove varianti del gene di fusione SYT-SSX, potrà contribuire a comprendere meglio il ruolo funzionale svolto dalla traslocazione t(x;18) nel sarcoma sinoviale, così come le funzioni specifiche dei diversi domini di SYT ed SSX coinvolti in questa alterazione genica. Considerazioni clinico-patologiche Ricerche precedenti su altri tipi di sarcoma con traslocazioni cromosomiche, come il sarcoma di Ewing e il rabdomiosarcoma alveolare, hanno mostrato che forme alternative del prodotto di fusione espresso possono influenzare alcune caratteristiche biologiche e cliniche della neoplasia, come l età alla diagnosi, il sito primario di insorgenza, il tasso di proliferazione delle cellule neoplastiche e l evoluzione clinica [24-26]. Questi studi hanno rafforzato il concetto che le proteine di fusione codificate da queste traslocazioni sono così importanti nei sarcomi che anche minime differenze strutturali possono avere un effetto diretto individuabile a livello
261 cellulare, istologico e clinico [27]. Questo schema viene confermato e rinforzato nel sarcoma sinoviale dagli studi che correlano il comportamento clinico del tumore con il tipo di gene di fusione espresso. In letteratura sono riportati alcuni studi che correlano l espressione di uno specifico gene di fusione SYT/SSX con le caratteristiche biologiche del tumore. L espressione del trascritto di SYT/SSX1 è risultata associata ad un intervallo libero da malattia più breve ed a un tasso di proliferazione tumorale più elevato rispetto ai casi che esprimevano il trascritto di SYT/SSX2 [28-30]. Inoltre, esistono diversi studi che hanno esplorato l esistenza di una correlazione fra varianti di SYT/SSX e tipo istologico della neoplasia, la maggior parte di questi riporta che la forma bifasica di sarcoma sinoviale è associata all espressione del gene di fusione SYT/SSX1 mentre SYT/SSX2 è stato riscontrato prevalentemente nelle forme monofasiche [3, 31-34]. A causa del basso numero di casi studiati finora, non è possibile stabilire una relazione tra espressione di SYT/ SSX4 e caratteristiche biomorfologiche dei sarcomi sinoviali. Generalmente, la presenza di SYT/SSX1 è più frequente di quella delle altre forme. Di 287 casi positivi per SYT/SSX riportati in letteratura, circa il 64% esprime SYT/SSX1 e circa il 36% esprime SYT/SSX2 [17]; in due soli casi è stata dimostrata la presenza di SYT/SSX4 [19-20]. Recentemente è stato individuato un caso in cui SYT/SSX4 era co-espresso con una forma variante denominata SYT/SSX4v, in cui mancava l esone 5 di SSX [18], dimostrando la possibilità che almeno due diverse forme di trascritti SYT/SSX possono essere presenti contemporaneamente nello stesso tumore. Nonostante il significato biologico di questo riscontro non sia ancora stato chiarito, modelli di sarcoma sinoviale coesprimenti forme diverse di SYT-SSX potrebbero essere utilizzati per studiare il ruolo funzionale che queste molecole svolgono specificamente durante la crescita e progressione neoplastica. In questo contesto, è interessante notare che i membri della famiglia multigenica SSX presentano elevata omologia eppure solo SSX1, SSX2 e SSX4 sono stati fino ad ora trovati fusi a SYT come effetto conseguente alla traslocazione t(18:x), presente nei sarcomi sinoviali. Analogamente a quanto descritto in precedenza, il significato biologico di questo evento non è ancora stato chiarito. La difficoltà di identificare l espressione di prodotti di fusione SYT/SSX differenti da quelli già descritti potrebbe essere attribuita a varie cause. È possibile che esistano delle differenze nei siti di ricombinazione dei vari geni SSX che rendono più frequente il riarrangiamento di SSX1 e SSX2 rispetto agli altri membri della famiglia SSX, oppure che la presenza di trascritti SYT/SSX1 e SYT/SSX2 sia così elevata nei campioni di tumore da mascherare la presenza di varianti più rare nelle analisi in RT-PCR. I trascritti chimerici SYT/SSX rappresentano marcatori diagnostici altamente sensibili. La presenza di questa fusione nel sarcoma sinoviale si avvicina al 100%, quando l analisi viene condotta con metodi adeguati. È quindi opportuno sottolineare che, mediante l applicazione di protocolli di RT-PCR ottimizzati (Tab. 2), si potrà contribuire non solo a ridurre ulteriormente i casi di sarcoma sinoviale negativi per SYT/SSX riportati in letteratura, ma soprattutto potranno essere individuati nuovi potenziali marcatori prognostici e terapeutici per questa neoplasia. Ringraziamenti Il presente lavoro rientra in un progetto di ricerca finanziato dall AIRC, Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro. M.P.M. e A.G. sono titolari di una borsa di studio FIRC, Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro. Tabella 2 Protocolli di RT-PCR per l amplificazione dei prodotti di fusione SYT -SSX Metodo standard Primer Condizioni sperimentali A B C PCR interna per SYT-SSX1 PCR interna per SYT-SSX2 SYT3 SSXA SYT4 SSX1-4 SYT4 SSX2-4 MgCl 2 1.5 mm dntp 0.6 mm MgCl 2 1.5 mm dntp 0.6 mm MgCl 2 1.5 mm dntp 0.6 mm 60 1 min 63 1 min 63 1 min Metodo ottimizzato Primer Condizioni sperimentali D E PCR interna SYT343+ SSXA SYT5 SSX1-3 MgCl 2 2 mm dntp 1 mm MgCl 2 2 mm dntp 1 mm 50 1 min 56 1 min
262 Bibliografia 1. Limon J, Dal Cin P, Sandberg AA (1986) Translocations involving the X chromosome in solid tumors: presentation of two sarcomas with t(x;18)(q13;p11). Cancer Genet Cytogenet 23:87-91 2. Turc-Carel C, Dal Cin P, Limon J et al (1987) Involvement of chromosome X in primary cytogenetic change in human neoplasia: nonrandom translocation in synovial sarcoma. Proc Natl Acad Sci USA 84:1981-1985 3. Fligman I, Lonardo F, Jhanwar SC et al (1995) Molecular diagnosis of synovial sarcoma and characterization of a variant SYT-SSX2 fusion transcript. Am J Pathol 147:1592-1599 4. Hiraga H, Nojima T, Abe S et al (1998) Diagnosis of synovial sarcoma with the reverse transcriptase-polymerase chain reaction: analyses of 84 soft tissue and bone tumors. Diagn Mol Pathol 7:102-110 5. Poteat HT, Corson JM, Fletcher JA ( 1995) Detection of chromosome 18 rearrangement in synovial sarcoma by fluorescence in situ hybridization. Cancer Genet Cytogenet 84:76-81 6. 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