Prof. Maria Nicola GADALETA

Prof. Maria Nicola GADALETA E-mail: m.n.gadaleta@biologia.uniba.it Facoltà di Scienze Biotecnologiche Corso di Laurea in Biotecnologie Sanitarie e Farmaceutiche Biochimica e Biotecnologie Biochimiche DISPENSA N. 2 T SPETTROFOTOMETRIA

Spettrofotometria La spettrofotometia è una tecnica che permette, attraverso l uso di apparecchi noti come spettrofotometri, di condurre analisi qualitative (spettro di assorbimento) e quantitative (attraverso l equazione di Lambert e Beer) di molecole in soluzione che assorbono luce di una determinata lunghezza d onda (λ).

Schema di un spettrofotometro Sorgente di radiazioni policromatiche UVvisibile

Su quali principi si basano le tecniche spettrofotometriche?

Radiazioni e loro interazioni con la materia Le radiazioni elettromagnetiche sono onde caratterizzata da una lunghezza d onda (λ), da un ampiezza e da una frequenza (υ). Si possono considerare come un treno di particelle chiamati quanti o fotoni. Il fotone rappresenta l unità particolata delle radiazioni. Il quanto è la quantità di E contenuta in un singolo fotone. lunghezza d onda (λ) ampiezza

Lo spettro elettromagnetico LUNGHEZZA D ONDA (m) 1fm 1pm 1nm 1µm 1mm 1m 10-14 10-12 10-10 10-8 10-6 10-4 10-2 1 10 2 RAGGI GAMMA RAGGI X ULTRA- VIOLETTO INFRA- ROSSO MICRO- ONDE ONDE RADIO ENERGIA VISIBILE 400 nm 770 nm

Tutte le onde elettromagnetiche (indipendentemente dalla loro λ e ν) si propagano nel vuoto con la stessa velocità.la velocità della luce: 3 x 10 8 m sec -1 La radiazione elettromagnetica trasporta una quantità di energia inversamente proporzionale alla sua lunghezza d onda (lambda) Ē = h υ = h c λ υ = c λ La λ della radiazione è in relazione con l Energia contenuta in un quanto Ē = energia in un quanto (espresso in Kcal) h = cost. di Plank = 6.62 x 10-27 erg sec υ = freq. della radiazione (in Hertz) c = veloc. luce nel vuoto (~ 3 x 10 8 m sec -1 ) λ = lunghezza d onda

Assorbimento dell Energia (E) delle radiazioni Nell atomo e nelle molecole allo stato fondamentale gli elettroni occupano i livelli energetici più bassi previsti dalle leggi della quantomeccanica. Assorbendo E passano a livelli energetici più alti: si ha cioè una transizione elettronica. Le variazioni di E provocate dall assorbimento delle radiazioni non avvengono con andamento regolare e continuo, ma secondo multipli interi di una unità discreta di E chiamata quantum caratteristica di ogni sostanza assorbente.

Affinché una radiazione induca una transizione elettronica in un atomo o in una molecola, la sua Ē deve corrispondere esattamente alla differenza tra i 2 stati energetici dell atomo (o della molecola). Ē = h υ = h c λ 1) In un atomo gli ē possono compiere salti di Ē solo tra i diversi livelli di orbitali Spettro a righe Energia dell ē Livello energetico 4p 3d 3p 4s 3s 2p 2s Atomo del sodio Transizione della linea D del Sodio 1s

2) In una molecola gli ē di legame possono anche vibrare o ruotare attorno agli assi di legame. Le molecole assorbono quindi anche radiazioni che permettono queste variazioni di sottolivelli energetici vibrazionali e rotazionali. Ē totale = Ē elettronica + Ē vibrazionale + Ē rotazionale U.V. e visibile I.R. M.O. Livelli energetici in una molecola

Energia richiesta per la rottura dei legami π H R : : C = O σ w Rottura di un legame σ Rottura di un legame π Rottura di legami π alternati (es butadiene) λ < 120 nm λ 180 nm λ = 217 nm La natura del composto e la sua struttura molecolare determinano il tipo di radiazione assorbita. La qualità della radiazione (λ) assorbita dipende dalla qualità dei cromofori e quindi dal tipo di molecola (analisi qualitativa; vedi spettro di assorbimento). La quantità della radiazione assorbita dipende dal n di cromofori e quindi concentrazione della molecola (analisi quantitativa). Aumentando il n di doppi legami della molecola aumenta la λ delle radiazione assorbita perché diminuisce l E richiesta per la transizione elettronica (composti colorati, assorbono nel visibile; vedi licopene o pigmento rosso del pomodoro).

da: De Marco

Composti in cui vi è un alto numero di doppi legami alternati o coniugati aumenta il numero di elettroni π che possono interagire tra loro e sovrapporsi al sistema (vedi Butadiene). da: De Marco Per questo motivo essi hanno maggiore spazio in cui muoversi, e quindi un maggior numero di possibili livelli energetici. Possono pertanto subire transizioni che richiedono minore energia, e per le quali saranno quindi sufficienti radiazioni di λ maggiore. Per il butadiene ad es. l energia efficace è pari a 217 nm. (cioè il butadiene ha uno spettro di assorbimento con massimo a 217 nm). Si può grosso modo affermare che aumentando il numero di doppi legami coniugati aumenta la λ della luce assorbita. Composti in cui vi è un alto numero di legami coniugati (cioè di elettroni π delocalizzati) assorbono radiazioni visibili e sono quindi colorati. Ad es. il licopene, il pigmento rosso dei pomodori, ha un massimo di assorbimento a 485 nm, dovuto alla presenza di 11 legami coniugati etilenici.

Analisi qualitativa: Spettri di assorbimento Ogni sostanza o molecola ha un suo Spettro di Assorbimento (in base ai gruppi cromofori). Spettro di assorbimento: è il complesso di radiazioni monocromatiche che un composto è in grado di assorbire. Si rappresenta graficamente riportando la quantità di luce assorbita (A) in funzione d λ. da: Baynes

Analisi qualitativa: spettri di assorbimento di NAD + e di NADH NAD + (forma ossidata) NADH (forma ridotta) Per quantizzare il NAD, si può seguire la sua riduzione poiché a 340 nm assorbe solo la forma ridotta (NADH).

Analisi quantitativa delle molecole in soluzione: Legge di Lambert e Beer Consideriamo un raggio di luce monocromatica che attraversa una soluzione, avremo che: I O = I t + I A + I R I O = intensità della luce incidente I t = intensità della luce trasmessa I A = intensità della luce assorbita I R = intensità della luce riflessa (trascurabile nelle soluzioni limpide) I o I R I t Trasmittanza (T): quantità di luce trasmessa I A Trasmittanza = It I O = 10 -εcl DO = A = -logt= log 1 T = log Io It = ε l c Densità ottica (DO) o Assorbanza (A): quantità di luce assorbita 0 T 1 A 0

Legge di Lambert e Beer A = ε l c l = cammino ottico = 1 cm c = concentrazione della soluzione in esame ε = coefficiente di estinzione La legge di Lambert e Beer esprime la diretta proporzionalità tra l assorbimento della luce(a,assorbanza) la concentrazione della soluzione presa in esame( c,espressa in M o in mm ecc. o in % se si tratta di macromolecole in soluzione come nel caso di DNA,RNA,PROTEINE) e lo spessore del campione in soluzione (l)attraversato dalla radiazione E valida per regioni dello spettro del visibile e dell ultravioletto. La legge di Lambert-Beer è valida solo a λ di massimo assorbimento della specie in esame (λ max ):per questa ragione,prima di una analisi quantitativa,è necessario conoscere lo spettro della sostanza in esame.

Grafici di Trasmittanza e Assorbanza in funzione di C % Trasm ittanza Assorbanza (A) 100 75 50 25 0 1.5 1.1 0.7 0.3-0.1 Grafico della Trasmittanza C1 C2 C3 C4 C5 Concentrazione Grafico dell'assorbanza C1 C2 C3 C4 C5 Concentrazione T = 10 -εcl La trasmittanza non è funzione lineare della concentrazione (varia in modo esponenziale). DO = A = -logt DO = A = ε l c La DO è funzione lineare della concentrazione. Questa è la ragione per cui si preferisce misurare A o DO.

ε ε = esprime l assorbimento che subisce un raggio di luce monocromatico nell attraversare una soluzione a concentrazione unitaria e cammino ottico di 1 cm ε M ε mm Se c = 1 e l = 1 cm ε = DO = molare = concentraz. M = moli/l = mmolare = concentraz. mm = mmoli/l Per molecole con peso molecolare molto elevato come DNA e proteine si preferisce: ε % = percentuale = concentraz. in % v/v o p/v ε mg/ml = specifico = concentraz. in mg/ml Il valore di ε viene definito indicando le λ a cui è stato determinato Es. Dire che l NADH ha ε 25 340 nm = 6.22 mm -1 cm -1 Equivale a dire che: una soluzione a concentrazione unitaria 1 mm, analizzata in una cuvetta con cammino ottico = 1cm, a λ max per l NADH = 340 nm, a T = 25 C assorbe 6.22 Unità di DO

Poiché DO λ max = εlc ε = DO lc c = Molare = 1mole = 1mole litro 10 3 cm 3 ε = DO = DO = DO lc cm 1mole 1mmole cm -2 10 3 cm 3 ε viene espressa in DO cm 2 mmoli -1

ε è un coefficiente caratteristico della specie assorbente e dipende da 1) Temp., 2) λ incidente, 3) ph, 4) forza ionica, 5) composizione del medium NADH ε M 340 nm = 6.22 x 10 3 cm 2 mmoli -1 (M -1 cm -1 ) 1 cm ε mm 340 nm 1 cm = 6.22 cm 2 µmoli -1 (mm -1 cm -1 )

Massima Assorbanza Assorbanza 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 300 350 400 450 Lunghezza d'onda (nm) Conc 1 Conc 2 La legge di Lambert e Beer è valida solo ad una λ che corrisponde alla λ max di assorbimento della sostanza in esame. Infatti, nelle zone di massima Assorbanza si ha la massima A per la stessa C, quindi la sensibilità del metodo è max. Anche la specificità è la max possibile. A λ più basse o a λ più alte ci sono sovrapposizioni che impediscono la linearità dell equazione.

FOTOMETRI e SPETTROFOTOMETRI Fotometri consentono di lavorare solo nel visibile e a determinate λ. Spettrofotometri lavorano anche nell UV e danno spettri continui permettendo di ottenere più facilmente luce monocromatica Le sorgenti luminose possono essere una lampada ad idrogeno o deuterio per l'ultravioletto ed una al tungsteno per il visibile.

Selettori di lunghezza d onda FILTRI MONOCROMATORI: RETICOLI, PRISMI Filtri sono molto semplici fanno passare alcune λ e ne assorbono altre: possono essere di vetro, di tipo Wratten, a interferenza, cut off o composti. Monocromatori sono dei sistemi ottici capaci di fornire in maniera continua radiazioni monocromatiche a partire da una radiazione policromatica. Sono sistemi più precisi dei filtri possono essere prismi o reticoli. I prismi si basano sul principio della rifrazione. Sono di vetro per il visibile e di quarzo o silice per l ultravioletto. I reticoli si basano sul principio fisico della diffrazione: possono essere di trasmissione o di riflessione. Hanno le caratteristiche di disperdere la luce in maniera lineare a tutte le λ diversamente dal prisma in cui la monocromaticità del raggio emergente varia con la lunghezza d onda.

Un prisma disperde la luce bianca nelle sue componenti colorate prisma schermo La luce bianca non è altro che una mescolanza di tutti i colori Le radiazioni nell attraversare i diversi mezzi hanno una velocità diversa che è funzione della λ per cui il raggio viene scomposto nelle singole componenti monocromatiche. Quella con lunghezza d onda maggiore (es. rosso) viene rifratta meno di quella di lunghezza d onda minore (es. violetto) per cui la monocromaticità del raggio incidente sulla cuvetta non è sempre la stessa alle diverse λ.

I raggi che emergono dal monocromatore vengono convogliati da lenti o, negli strumenti più moderni, da specchi perchè meno costosi e con minor perdita di radiazione. Le fenditure (beam splitter) contribuiscono ad ottenere una luce monocromatica. Le cuvette: quando si lavora nell'ultravioletto si devono utilizzare cuvette di quarzo o di silice perchè sono trasparenti a lunghezze d'onda superiori ai 180 nm, quando invece si lavora nel visibile si possono utilizzare quelle di vetro o plastica poichè assorbono le radiazioni al di sotto dei 340 nm. Per tarare lo strumento bisogna predisporre una cuvetta di riferimento otticamente identica a quella di misura e con il medesimo solvente. La cellula fotoelettrica. Le fotocellule convertono i quanti della radiazione luminosa in energia elettrica che può poi essere amplificata, rilevata e registrata.

Come si può usare la spettrofotometria Analisi qualitativa: spettri di assorbimento 2 O.D. (A) in funzione di λ Analisi quantitativa: si basa sulla Legge di L. e B. e occorre conoscere l ε Se non si conosce l ε? Si può costruire una retta di taratura con quantità note e crescenti della sostanza in esame 1.5 ε = O.D. = pendenza della retta O D 1 (con l = 1 cm e alla λ usata) 0.5 0 0 1 2 3 4 5 [concentrazione]

Determinazione della concentrazione delle proteine totali Analisi quantitativa 1) Metodo spettrofotometrico: dosaggio delle proteine nell UV a λ max del triptofano (280 nm ) da: Baynes

Gli AA non assorbono nel visibile ma nell estremo U.V. (< 220 nm) a causa del doppio legame del gruppo COOH. Gli spettrofotometri più comuni in commercio non sono attrezzati per lunghezze d onda così basse. Tre AA aromatici (Trp, Tyr, Phe) assorbono nell U.V. intorno a 280 nm e la loro presenza nelle proteine(assumendo una presenza percentuale più o meno simile di questi AA in tutte le proteine) permette alle proteine di essere dosate spettrofotometricamente a 280 nm.il dosaggio spettrofotometrico può essere usato per: 1) soluzioni di proteine perfettamente limpide 2) soluzioni che non contengono altre sostanze che assorbono tra 250 e 290 nm. Metodo molto semplice, con scarsa specificità, discreta sensibilità e scarsa precisione:molto usato nelle tappe avanzate della purificazione di proteine. Le soluzioni di proteine purificate possono spesso essere contaminata da acidi nucleici che presentano il massimo di assorbimento a 260 nm. Si applica la seguente formula che tiene conto dei fattori di correzione: Formula di Warburg e Christian 1.45 x A 280 0,74 x A 260 = [prot] mg/ml

SPETTRI DI ASSORBIMENTO DEGLI AMMINOACIDI Gli amminoacidi non assorbono nel visibile Tutti gli amminoacidi assorbono nell estremo U.V. < 220 nm a causa del doppio legame del gruppo COOH Tre amminoacidi assorbono nell U.V. intorno a 280 nm; Trp Tyr Phe BANDA DEL TRIPTOFANO Queste caratteristiche si riflettono nelle proteine che possono essere dosate attraverso lettura spettrofotometrica a 280 nm.

Princìpi dei metodi colorimetrici: Misurano l assorbimento di un complesso colorato (cromoforo) che si forma per una reazione specifica delle sostanze che si vuole dosare con uno specifico reattivo. La formazione del complesso avviene in condizioni standard, secondo un rapporto stechiometrico con la sostanza usata per far sviluppare il colore. Si misura l assorbimento del campione rispetto a quello di un bianco, contenuto nella cuvetta di riferimento, costituito da tutti i reagenti tranne la sostanza che si vuole dosare Si costruisce una retta di taratura riportando in grafico i valori di O.D. di quantità note della sostanza da misurare che hanno reagito con lo stesso reattivo per dare il complesso colorato (almeno 5 punti) Dalla retta di taratura si ricava la quantità della sostanza nella soluzione incognita Vantaggi In questo caso le proteine possono essere in forma non pura (anche in un omogenato) perché quantità relativamente limitate di materiale danno valori di estinzione proporzionalmente elevati.

Metodo del Biureto (solfato di Cu ++ ) Il biureto è la molecola più piccole capace di formare il complesso colorato con il solfato di rame (occorrono 2 legami peptidici adiacenti). Reattivo del Biureto: Cu forma legami di coordinazione tra i gruppi NH dei legami peptidici quando sono deprotonati. La reazione avviene in ambiente alcalino. Più proteine ci sono più legami peptidici Più complesso colorato si forma Il reattivo del Biureto è costituito da Solfato di Cu++, Tartrato di K e Na (per stabilizzare il complesso) NaOH (per creare ambiente alcalino). Presenta il max di assorbimento è 540 nm (colore blu violetto).sensibilità:mg

Metodo di Lowry Si basa sulla reazione del reattivo del Biureto e in più si ha la riduzione in condizioni alcaline del reattivo fosfotugstenico, fosfomolibdico (reattivo di Folin Ciocalteu) da parte della tyr e del trp presenti nelle proteine. Il prodotto ha colore blu, si misura assorbimento a λ = 660 nm. Vantaggi: Sensibilità e riproducibilità molto elevata Svantaggi: reazione piuttosto lunga e complessa Metodo di Bradford (Biorad protein assay) Il reagente è costituito da Comassie Brillant Blue e acido fosforico. In presenza di proteine il Comassie forma complessi non covalenti con le proteine (colorazione blu) λmax da 465 nm a 595 nm.sensibilità:macro 20-120 µg; Micro 1-20 µg. Vantaggi: sensibilità elevata come il Lowry, più semplice e rapido del Lowry. Complesso più stabile del Lowry (1 hr).

La scelta della tecnica va fatta tenendo conto delle esigenze di sensibilità, precisione e riproducibilità che l analisi richiede, nonché della economicità in termini di costo di reattivi e di tempo. Metodo Sensibilità Interferenze chimiche Variazioni da prot. a prot. Velocità Complessità Bradford 1µg leggere significative rapido semplice Lowry 1µg grandi significative moderata moderata Biureto 100µg moderate basse moderata semplice Kjeldahl 1µg moderate basse lento complesso Ass. 280 10µg moderate significative rapido semplice

Dosaggio colorimetrico di proteine col metodo Bradford Preparare una soluzione di BSA a concentrazione 1 mg/ml per costruire la retta di taratura. Poiché la BSA è molto igroscopica e quindi assorbe acqua dall ambiente durante la pesata per utilizzarla come soluzione standard a concentrazione nota bisogna preventivamente dosarla con il metodo spettrofotometrico utilizzando la formula di Warburg e Christian. Quella ottenuta sarà la reale concentrazione di albumina della soluzione che utilizzeremo come soluzione a concentrazione nota (Xmg/ml). Retta taratura Camp Camp PROVE 0 1/1 2/2 3/3 4/4 5/5 6/6 7/7 8/8 H 2 O (µl) 80 75 70 65 60 55 50 78 76 BSA Xmg/ml (µl) - 5 10 15 20 25 30 - - Proteine mitoc. (µl) - - - - - - - 2 4 Reattivo Biorad dil. 1:5 (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 OD 595 0 OD 595 0 media OD BSA (µg) 0 ---

Retta di taratura con BSA 2 1.5 X OD 1 0.5 0 5 [X] 10 15 20 0 1 2 3 4 5 [concentrazione]

Lo stato eccitato è meno stabile per cui gli atomi (o le molecole) eccitati, tendono a tornare allo stato fondamentale di partenza. Per far questo perdono Energia sotto varie forme: cedendo l E alle particelle vicine (calore) emettendo radiazione fluorescente effettuando reazioni fotochimiche