TERRENI DI COLTURA: classificazione in base alla funzione TERRENI SELETTIVI: sono terreni di crescita adatti alla moltiplicazione di uno specifico microrganismo o di un numero ristretto di microrganismi e che sfavoriscono la crescita degli altri microrganismi campione contenente il microrganismo da studiare (un alimento, del suolo, un tampone faringeo o cutaneo, un campione fecale, etc ) Il terreno selettivo sfavorisce (o impedisce) la crescita dei batteri che non voglio isolare Quali agenti selettivi sono solitamente sfruttate le esigenze nutrizionali (capacità di metabolizzare specifici substrati), la capacità di resistere alla presenza di antibiotici o altre molecole antimicrobiche, la capacità di sopravvivere a bassi ph o elevate concentrazioni di sali o zuccheri Esempi Salmonella-Shigella Agar (SS-agar): utile all isolamento dei batteri patogeni Gram negativi dei generi Salmonella e Shigella; questo terreno inibisce la crescita della maggior parte dei batteri a causa dell'elevata concentrazione di sali biliari e di citrato di sodio Bifidobacterial Selective Medium: utile all isolamento dei bifidobatteri; contiene come agenti selettivi il sale litio cloruro, l acido propionico e alcuni antibiotici a cui i bifidobatteri sono naturalmente resistenti 1 2
TERRENI DISCRIMINATIVI: rendono possibile alle colonie di un dato microrganismo di svilupparsi assumendo un aspetto tale da essere riconosciuto e distinto a prima vista dalle colonie degli altri microrganismi ESEMPIO Agar sale mannite: contiene lo zucchero MANNITOLO (come unica fonte di carbonio) e rosso fenolo (indicatore di ph); permette di discriminare gli stafilococchi patogeni (Staphylococcus aureus) dagli altri stafilococchi (per es. Staphylococcus epidermidis) LA CRESCITA DEL MICRORGANISMO DA UNA COLORAZIONE GIALLA poichè la fermentazione del mannitolo produce acidi che fanno virare il colore dell indicatore di ph (rosso fenolo) al giallo; esempio: S. aureus LA CRESCITA DEL BATTERIO NON CAMBIA IL COLORE DEL TERRENO: il batterio non fermenta il mannitolo; le colonie batteriche rimangono del colore iniziale del terreno; esempio: S. epidermidis 3 TERRENI (COLTURE) DI ARRICCHIMENTO: sono terreni liquidi in cui la presenza di particolari sostanze o di particolari condizioni fisiche favorisce la crescita in numero delle specie da arricchire, mentre allunga la fase di latenza delle specie competitrici ESEMPIO Terreno di coltura al selenio per l isolamento delle salmonelle dalle feci Batterio che voglio isolare (per es. Salmonella typhi) Altri microrganismi presenti nel campione In questo esempio, dopo circa 6/8 ore il numero di cellule del batterio di interesse sarà di molto cresciuto rispetto al numero di cellule degli altri microrganismi (il batterio di interesse è stato arricchito!) 4
PREPARAZIONE DEI TERRENI DI COLTURA - pesata dei vari costituenti - dissoluzione in acqua - sterilizzazione in autoclave Idrolizzato di proteine del latte, della carne o della soia con pepsina per BATTERI nutrizionalmente poco esigenti Terreno di coltura BRODO MALTO o AGAR MALTO Terreno di coltura NUTRIENT (terreno COMUNE) peptone 5 g estratto di carne 1 g estratto di lievito 2 g sodio cloruro acqua dist. 1000 ml 5 g estratto di malto saccarosio estratto di lievito acqua dist. 20 g 40 g 5 g 1000 ml per LIEVITI E MUFFE 5 TERRENO MRS (per lattobacilli) de Man Rogosa Sharpe (MRS) per LATTOBACILLI Peptone from casein 10.0g; Sono microrganismi esigenti dal punto di vista nutrizionale (detti per questo FASTIDIOSI); affinché possano essere coltivati, quindi, necessitano di un terreno colturale più ricco in nutrienti meat extract yeast extract D(+)-glucose dipotassium hydrogen phosphate Tween 80 di-ammonium hydrogen citrate sodium acetate magnesium sulfate manganese sulfate 8.0g; 4.0g; 20.0g; 2.0g; 1.0g; 2.0g; 5.0g; 0.2g; 0.04g; agar-agar (not present in MRS broth) 14.0g acqua dist. N.B.: meglio usare il termine MICROBIOTA! 1000 ml 6
CONCETTO DI STERILITÀ STERILIZZAZIONE: distruzione di ogni organismo vivente, (comprese le endospore di Bacillus e Clostridium) In un laboratorio di microbiologia la sterilità DEVE essere assoluta. Nelle industrie alimentari è un concetto statistico (si pensi alle leggi di BIGELOW, che rappresentano la cinetica della distruzione termica dei microrganismi) Il più usato ed efficace mezzo per sterilizzare è il CALORE PERCHÉ? Principalmente perché le proteine (e quindi anche gli enzimi) denaturano Lo strumento principale di sterilizzazione in microbiologia è: L AUTOCLAVE: sterilizza attraverso il vapore sotto pressione (assai più efficace del CALORE secco) 7 L AUTOCLAVE - Il ciclo di sterilizzazione prevede una sovrapressione di 1 atm ( 121 C) per un tempo di15 min (oppure 20 min x ¾ atm 116 C; oppure 30 min x ½ atm 111 C) - P/T minori e tempi maggiori per limitare il danno ai composti organici (imbrunimento, caramellizzazione) - il vapore deve poter entrare in contatto con le soluzioni (tappi di cotone; bottiglie aperte) N.B.: Molti zuccheri e gli antibiotici devono essere sterilizzati per filtrazione (cut-off del filtro di 0,45 o 0,22 µm) perché altrimenti il 8 calore dell autoclave distruggerebbe queste molecole 8
Pipetta Lavorare in sterilità Spatola Ansa Becco Bunsen Si lavora con fiamma ossidante (azzurra, più calda, più stabile), NON si lavora con la fiamma riducente (gialla, instabile) riducente ossidante 9 LA SEMINA DEI TERRENI DI COLTURA Consiste nel trasferire sterilmente le cellule del microrganismo allo studio in un brodo colturale o in una piastra di terreno colturale agarizzato SEMINA DI TERRENO SOLIDO Semina per STRISCIO (non adatta per metodi quantitativi!) INOCULO IN BRODO Semina per SPATOLAMENTO Trasferimento in sterilità di cellule nel terreno liquido con ansa o pipetta Semina per INGLOBAMENTO O INCLUSIONE 10
Semina a striscio per l isolamento di una coltura pura (compiuta con ansa su piastra contenente terreno colturale agarizato) https://www.youtube.com/watch?v=0heifcimbfy 11 INCUBAZIONE DEI MICRORGANISMI I brodi o i terreni agarizzati seminati devono essere posti ad una TEMPERATURA, per un TEMPO e nelle CONDIZIONI ottimali per permettere la crescita del microrganismo con cui si sta lavorando Esempi: Geobacillus stearothermophilus G+, anaerobio facoltativo, termofilo Incubazione a 60 C per 8-12 h Bifidobacterium bifidum G+, anaerobio stretto, mesofilo Incubazione a 37 C per 36-48 h Giara di anaerobiosi Agitatore 12
Gas-pakper l'allevamento colturale di batteri anaerobi: si notino la giara a chiusura ermetica, la busta generatrice di anaerobiosi e la cartina indicatrice di anaerobiosi 13 13 Determinazione della carica microbica MISURAZIONE DIRETTA CONTA TOTALE AL MICROSCOPIO (con camere di conta) CONTA VITALE (piastramento di diluizioni seriali) MISURAZIONE INDIRETTA - Misura della torbidità (spettrofotometro) - Misura della conducibilità (conduttimetro) - Misura della variazione di ph (per es. per un batterio lattico che cresce con metabolismo fermentativo producendo acido lattico) 14