17 CORSO NAZIONALE PER TECNICI DI LABORATORIO BIOMEDICO RICCIONE 25-28 maggio 2010 NOVITA IN TEMA DI HPV Stefania Casazza S.C. Anatomia Patologica E.O. Galliera GENOVA
RAZIONALE Numerosi studi epidemiologici,clinici e di biologia molecolare hanno evidenziato una stretta correlazione tra la neoplasia cervicale e l infezione da Human Papilloma Virus (HPV). E stata ampiamente dimostrata la capacità di questi virus a indurre la trasformazione in senso displastico-neoplastico nelle cellule infettate, soprattutto a livello genitale femminile. Il problema clinico strettamente attuale è poter individuare precocemente le donne che presentino un infezione virale attiva che risultino cioè ad alto rischio di sviluppare lesioni neoplastiche. Sottoporre queste donne ad un follow-up clinico e strumentale personalizzato
HUMAN PAPILLOMA VIRUS Sono stati caratterizzati oltre 120 tipi di papilloma virus umano (HPV) che possono infettare la cute e le mucose. Di questi almeno 40 infettano la cervice e la mucosa dei genitali. Circa il 75% della popolazione entra in contatto con uno o più HPV nel corso della vita.
HPV: CICLO VITALE Gli HPV penetrano nell epitelio attraverso microabrasioni e raggiungono, infettandole, le cellule dello strato basale. Si replicano all interno del nucleo delle cellule dell epitelio squamoso stratificato, sfruttando la differenziazione cellulare.
Human Papilloma Virus (HPV) Famiglia di virus a DNA (Papovaviridae) il cui genoma comprende delle regioni che codificano per proteine precoci (E, early) e regioni che codificano per proteine tardive (L, late). Le proteine precoci più studiate sono le E6 ed E7 la cui iper-espressione risulta essere la maggior causa del processo di trasformazione cellulare.
HPV Genoma Virale: Funzioni durante il ciclo cellulare L1 Producono proteine capsidiche L2 Legano il DNA virale e auto-assembla E1 E2 E4 E5 E6 E7 E1/E2: replicazione del genoma virale E4: destabilizza il citoscheletro 1 st proteine virali prodotte Coinvolti nella trasformazione cellulare Causano le alterazioni precancerose Sopprimono la regolazione del ciclo cellulare Inibiscono l apoptosi
E1 HPV Genoma Virale URR: Regione di regolazione principale E: precoce L: tardiva URR Replicazione del genoma virale PAL p97 Replicazione del genoma virale Proteine capsidiche virali p670 Group: Group I (dsdna) Family: Papillomaviridae Genus: Papillomaviridae Species: Human papillomavirus Genome: 8,000 base pairs 8 open reading frames Encode for 10 proteins Size: 55nm in diameter Replicazione del genoma virale Proteine capsidiche virali PAE E2 Codificazione proteinica per la fase finale di replicazione Replicazione del genoma virale
HPV: patogenesi HPV a Basso Rischio (LR-HPV): 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 90% condilomi genitali 4-25% lesioni cervicali CIN I (L-SIL) HPV ad Alto Rischio (HR-HPV): 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,52, 56, 58, 59, 68, 73, 82 25% CIN I 70% CIN 2-3 (H-SIL) Oltre 85-98% carcinomi cervicali
HPV - HR Gli HPV-HR tipo 16 e 18 risultano di gran lunga quelli più frequentemente implicati nella genesi del carcinoma cervicale: sono responsabili rispettivamente del 60% e del 10% di tutti i tumori cervicali (seguiti poi dagli HPV tipo 31, 33 e 45!!).
La maggior parte delle donne contrae un infezione da HPV entro pochi anni dall inizio dei rapporti sessuali. Il 75-80% di queste infezioni risultano TRANSIENTI, regrediscono spontaneamente (coinvolgimento attivo del sistema immunitario). In circa il 20% dei casi l infezione PERSISTE più a lungo e può essere riscontrata anche a molti anni di distanza (infezione latente). Circa il 40% delle infezioni persistenti da HPV-HR PROGREDISCONO in lesioni precancerose di alto grado (HSIL). Solo l 1% di infezioni persistenti con tipi virali ad alto rischio esitano in carcinoma, dopo un intervallo medio di 15 anni.
Possibile evoluzione dell infezione da HPV REGRESSIONE PERSISTENZA INTEGRAZIONE PROGRESSIONE
Fattori che favoriscono la PERSISTENZA dell infezione da HPV Immunodepressione Infezione da HPV-HR (specie tipo 16 e 18) Elevata carica virale di HPV Co-infezione di vari tipi di HPV Il grado della lesione presente a livello cervicale Infezione contemporanea da parte di Herpes Virus, Chlamydia
INTEGRAZIONE DEL GENOMA VIRALE Entro cellule non permissive l integrazione del genoma virale degli HPV-HR induce un espressione deregolata delle oncoproteine virali E6 ed E7 che interagiscono, inattivandole, con le proteine regolatrici del ciclo cellulare (principalmente la P53 e prb): alterazioni nella maturazione e nella proliferazione cellulare, acquisizione e mantenimento fenotipo displastico-neoplastico.
Gli oncogeni virali interferiscono con I geni soppressori del carcinoma cervicale Oncoproteine E6 Cromosoma E7 Espresse nel carcinoma cervicale in seguito all integrazione nel cromosoma della cellula ospite lega p53 lega prb
Alto Rischio vs. Basso Rischio Alto Rischio Basso Rischio 16, 18, 45 6, 11 E6 E7 E6 E7 Integrazione nel DNA della cellula ospite Proteine che interrompono lo schema riproduttivo cellulare Forte legame con la proteina p53 e prb Incapaci di integrarsi nel DNA della cellula ospite E6 non degrada p53 E7 lega debolmente la prb, senza inattivarla
OBIETTIVI Individuare le donne affette da infezioni virali persistenti, indotte da HPV-HR, in cui sia già avvenuta l integrazione del genoma virale. Classificare e stratificazione le lesioni da ritenersi ad alto potenziale di trasformazione e progressione in senso neoplastico, anche quelle non ancora clinicamente e/o citologicamente definibili (ASC-US / L-SIL) Follow-up delle lesioni LSIL/HSIL per monitorare la progressione. Monitorare l efficacia del trattamento per displasia cervicale (individuazione precoce malattia residua ) Definizione di mirati e personalizzati protocolli di trattamento e follow up delle pazienti con controlli clinico-patologici (colposcopia) più appropriati al singolo caso.
STRUMENTI DIAGNOSTICI
DIAGNOSTICA CITOLOGICA DEGLI HPV Sensibilità del Pap-test nell identificazione delle lesioni pre-neoplastiche della cervice uterina: 70% (con 20% di falsi negativi) Se affiancato a metodiche di biologia molecolare (DNA e mrna test): sensibilità fino al 98% L introduzione della citologia su strato sottile migliora la performance del Pap-test: Riduzione strisci inadeguati Aumento accuratezza diagnostica Rende possibile l esecuzione simultanea (sullo stesso campione) sia dell indagine morfologica che molecolare.
DNA TEST- HPV
Metodiche d indagine che consentono di identificare e/o genotipizzare il DNA degli HPV (LR/HR) a partire da campioni sia citologici che istologici. I tests commerciali disponibili sono molteplici, con caratteristiche estremamente varie di complessità, costi, affidabilità, livello di automazione ed accuratezza.
IBRIDAZIONE IN SOLUZIONE (Hybrid Capture HC2) Evidenziazione di 13 HPV-HR e 5 HPV-LR, probes a RNA che formano ibridi RNA/DNA molto stabili catturati da anticorpi coniugati ad un complesso di fosfatasi alcalina. Il segnale è amplificato di 3000 volte e viene evidenziato su un substrato chemioluminescente e misurato con un luminometro.
PCR (Amplificazione genica) Amplificazione enzimatica in vitro di una definita sequenza di DNA (target) Primers regione altamente conservata L1(Test screening ): MY09/MY11: identificano oltre 30 tipi di HPV (450 bp) GP5+/GP6+: (140 bp) Primers regioni conservate di E6/E7 (Test tipizzazione ): pu-1m/pu-2r: identificano HPV-HR tipo 16,18,31,33,35,45,52,58 (233-268 bp) pu-31b/pu-2r: identificano HPV-LR tipo 6,11 (248 bp)
MARCATORI DI PROGRESSIONE DELLA MALATTIA DA HPV
GENOTIPIZZAZIONE HPV Nel follow up delle pazienti trattate per CIN2+ può rappresentare un valido strumento per discriminare precocemente le pazienti persistentemente positive per uno specifico tipo di HPV-HR, specie HPV16 e HPV 18. Linear Array HPV Genotyping test (Roche): PCR (primers MY09/MY11) Denaturazione ampliconi e ibridazione su Array (strip) marcate con sonde specifiche per 37 tipi di HPV
TECNICHE DI SEQUENZIAMENTO
MICRO ARRAY I Microarray di DNA (matrici ad alta densità) sono costituiti da un insieme di microscopiche probe di DNA fissate ad una superficie solida come vetro, plastica, o chip di silicio formanti un array (raggruppamento). Si fa avvenire l'ibridazione fra la sonda presente sulla matrice e il DNA target che può essere identificato semplicemente rilevando la posizione dove è rimasto legato.
CARICA VIRALE Diversi studi hanno dimostrato che pazienti con alta carica virale di HPV-HR hanno un rischio aumentato di sviluppare il cancro della cervice. La PCR Quantitativa Real Time rappresenta l approccio migliore per la quantificazione degli acidi nucleici. La tecnica si basa sul monitoraggio continuo dei prodotti durante l amplificazione: elevata sensibilità, alta riproducibilità e rapidità di esecuzione.
RNA TEST - HPV
mrna E6/E7 HPV-HR TEST L analisi trascrizionale degli oncogeni E6/E7 rappresenta un indicatore diretto dell espressione deregolata delle relative proteine entro la cellula ospite. PreTect HPV Proofer (NorChip) NucliSENS EasyQ HPV (Biomerieux) APTIMA (Gen-Probe)
NucliSENS EasyQ - HPV (Biomerieux) E un test di amplificazione e di rilevazione in tempo reale degli acidi nucleici per la determinazione dell mrna di E6/E7 degli HPV-HR 16,18,31,33,45 Estrazione DNA/RNA Amplificazione Rilevamento
CONSERVAZIONE RNA I campioni citologici conservati in PresrvCyt devono essere conservati almeno a -20 C (max 6 settimane) I campioni citologici lisati in Lysis Buffer (tiocianato di guanidina e Triton X-100) sono stabili a T ambiente (max 24 h) o a -70 C (max 4 mesi)
ESTRAZIONE DNA/RNA (MiniMAG o EasyMAG)
ESTRAZIONE DNA/RNA (MiniMAG o EasyMAG) Al campione cervicale conservato nella soluzione di PreservCyt viene aggiunto il Lysis Buffer: rilascio degli acidi nucleici e inattivazione di tutte le RNasi e DNasi. Al lisato si aggiunge la SILICE MAGNETICA: gli acidi nucleici si legano alle particelle magnetiche. Lavaggi in tamponi Eluizione DNA/RNA
AMPLIFICAZIONE Il test contiene un cocktail di 6 coppie di primers per la rilevazione degli mrna target di HPV 16,18,31,33,45 e U1A (gene housekeeping). Amplificazione Real-Time NASBA: si basa su un processo isotermico (41 C) ripetitivo di annealing dei primer, sulla formazione di DNA a doppia catena contenente un sito promotore T7 e sulla trascrizione di molteplici copie delle sequenze target dell RNA (ampliconi)
RILEVAZIONE Il processo di rilevazione impiega 6 Sonde Beacon target-specifiche. Sonda Beacon: è una sequenza oligonucleotidica, associata ad un fluoroforo e ad un quencher, in grado di riconoscere e ibridare con uno specifico RNA target. In assenza dell ibrido la sonda forma una struttura a molletta : il fluoroforo è vicino al quencher e non si libera fluorescenza.
RILEVAZIONE Se si forma l ibrido si ha l apertura del Beacon ed emissione di fluorescenza, segnalando la presenza dell RNA target. L analisi cinetica (grafico) dei segnali fluorescenti da parte di un analizzatore rivela la trascrizione dell U1A e di ciascuno dei 5 RNA target degli HPV. Uno specifico programma interpreta i grafici come positivi/negativi per gli RNA specifici.
NASBA Principle
Caratteristiche del test Riproducibilità: 96-100% Sensibilità clinica 98% Specificità: 92% Valore Predittivo Positivo (PPV) ASCUS/L-SIL verso H-SIL: 40% mrna Test 14-16 % DNA Test Valore Predittivo Negativo (NPV) 96-98% circa per entrambi i Test
La ricerca dell'mrna delle oncoproteine E6/E7 degli HPV-HR nelle lesioni ASCUS e L-SIL evidenzia una percentuale di pz infettati da HPV più bassa (6% e 25%) rispetto a quella rilevata da DNA-test (32% e 55%). La percentuale aumenta con l'aumentare del grado della lesione (oltre il 60%) per entrambi i test.
CONCLUSIONI 1. Valido strumento diagnostico per la rilevazione latente delle lesioni ad alto grado nei casi ASCUS/LSIL 2. Determinazione combinata di genotipizzazione di 5 tipi HPV-HR e relativa attività oncogenica. 3. Nuovi Algoritmi nella gestione del TRIAGE ASCUS/L-SIL : colposcopia solo se mrna test positivo! (se negativo : follow-up secondo LINEE GUIDA NAZIONALI) 4. LIMITE DEL TEST: SOLO 5 GENOTIPI DISPONIBILI!!
PROTEINA P16 Proteina ad attività tumore-soppressore che regola il ciclo cellulare (fase G1-S) Iperespressione di P16 nelle cellule cervicali displastiche è direttamente correlata all ipertrascrizione dell oncogene virale E7 degli HPV-HR. Rilevabile mediante indagini di IIC (MoAb)
IPER-ESPRESSIONE P16 INK4a L'iper-espressione della P16ink4a può essere utilizzata quale marker molecolare di lesione cervicale precancerosa e cancerosa associata ad HPV-HR Permette di riconoscere lesioni di basso grado HPV-HR ad alto rischio di progressione (marker indiretto di progressione maligna).
Foto p16
Grazie!