Diminuzione del volume cellulare (perdita di liquidi intracellulari per processi attivi mediati dalle pompe di membrana)

Caratteristiche morfologiche dell apoptosi Diminuzione del volume cellulare (perdita di liquidi intracellulari per processi attivi mediati dalle pompe di membrana) Condensazione e marginalizzazione della cromatina e frammentazione della stessa Formazione di protuberanze (blebs) citoplasmatiche, delimitate da membrana (esposizione di PS) e contenenti frammenti di cromatina condensata e di organelli cellulari -> corpi apoptotici

La cellula in apoptosi subisce modificazioni morfologiche e biochimiche che portano alla sua frammentazione e ne favoriscono la fagocitosi

normali apoptotiche

La scaletta di DNA frammentato di una cellula apoptotica

Normal Cell Cell shrinkage away from neighbouring cells Plasma membrane blebbing Cytoplasmic and nuclear condensation Margination of condensed chromatin Nuclear and cellular fragmentation Apoptotic Bodies Phagocytosis

Differenze morfologiche fra apoptosi e necrosi Membrane breaks down resulting in an inflammatory response Edema Membrane intact until phagocytosed Pyknosis

Morphological Differences between Apoptosis and Necrosis Apoptosis vs Necrosis Nuclei Cytoplasmic Organelles Cell Membrane Cell Volume In Tissues Dense Condensation of Chromatin Morphologically Intact Apoptotic Bodies, Blebbing Cells shrink Single Cells Affected Irregular Chromatin Clumping Disrupted Blebbing and Loss of integrity Cells swell Groups of Cells Affected Tissue Response None Inflammation

Necrosi vs apoptosi Distruzione causata da una bomba (Nagasaki, 1945) Demolizione di un rudere

Le molecole chiave dell apoptosi P53 Caspasi Bcl2 family IAP family Death Receptors

caspasi Cisteina aspartato-specifiche proteasi superfamiglia di 12 membri (nell uomo) alto grado di omologia delle varie caspasi conservazione e aumento della complessità durante l evoluzione: 3 caspasi in c.elegans (Ced-3 prima caspasi identificata), 4 in drosophila, 12 in roditori e uomo

Caratteristiche biochimiche delle caspasi sito attivo ben conservato QAC ys285 XG assoluta richiesta di aspartico (D) in P 1 del substrato suddivisione in base alla sequenze peptidica preferenziale di clivaggio: - gruppo I: caspasi-1, -4, -5, motivo WEHD - gruppo II: caspasi-2, -3, -7, motivo DXXD - gruppo III: caspasi-6, -8, -9, -10, motivo I/L/V/EXD

Esistono diversi tipi di caspasi con diversa funzione caspasi iniziatrici: si sono evolute per collegare distinte pathway di segnalazione a monte con pathway esecutrici a valle -> hanno un lungo prodomain contenente moduli caratteristici per l interazione proteina-proteina. Sono in grado di autoattivarsi caspasi esecutrici: processate ed attivate dalle caspasi iniziatrici. Caratterizzate da un prodomain breve.

Asp Asp Asp prodomain LARGEsubunit linker SMALL subunit 1. taglio tra subunità maggiore e minore (2-step) 2. separazione del prodomain dalla subunità maggiore 3. caspasi attiva: omodimero composto da due monomeri, ciascuno composto da una subunità maggiore e una minore auto-attivazione trans-attivazione attivazione da altre proteasi (tra cui caspasi stesse)

1. taglio tra subunità maggiore e minore (2-step) 2. separazione del prodomain dalla subunità maggiore 3. caspasi attiva: omodimero composto da due monomeri, ciascuno composto da una subunità maggiore e una minore

Caspasi: ruolo nella esecuzione del programma apoptotico La proteolisi è responsabile delle alterazioni morfologiche che caratterizzano la morte cellulare apoptosica. Blocco delle attività delle caspasi (mutationi o inhibitori) ritarda o previene la morte cellulare apoptosica.

Bcl2-related proteins nei mammiferi: almeno 20 membri 3 sottofamiglie: - sottofamiglia Bcl-2: azione anti-apoptotica - sottofamiglia Bax: azione pro-apoptotica - sottofamiglia BH3-only: azione pro-apoptotica + 1 gruppo di proteine apparentate ma dalla funzione ancora poco chiara proteine altamente conservate durante l evoluzione (omologhi di Bcl-2 in c.elegans, drosophila, adenovirus, virus di Epstein-Barr)

Bcl2 omologo di Ced-9 di c.elegans, è stato il primo membro della famiglia identificato traslocato nel linfoma follicolare (cellule B), viene a trovarsi sotto il controllo del promotore della catena pesante delle Ig -> overespressione che conferisce resistenza all apoptosi è il primo oncogene che promuove la sopravvivenza cellulare invece che stimolare la proliferazione

BH1, BH2, BH3, BH4: regioni di alta omologia con Bcl-2 TM: regione transmembrana -> inserzione in membrana di nucleo, ER, mitocondri (ma possono essere anche citoplasmatiche) conferiscono protezione da: deprivazione di citochine, UV, radiazioni, farmaci chemioterapici BH1/2/3: recettore per il BH3 domain dei membri pro-apoptotici

Le proteine appartenenti alle due sottofamiglie con azione pro-apoptotica sono state identificate principalmente in virtù della loro capacità di interagire con Bcl-2 BH1, BH2, BH3: regioni di omologia con Bcl-2 TM: regione transmembrana -> inserzione in membrana di mitocondri e ER (ma possono essere anche citoplasmatiche) molto simili a Bcl-2 per sequenza e struttura

sequenza in larga parte senza omologia con Bcl-2 scarsa omologia fra di loro -> unica regione conservata: BH3 (necessaria per la funzione pro-apoptotica) pro-apoptotiche solo in presenza della sottofamiglia Bax

IAP family IAP = Inhibitor of Apoptosis Protein proteine endogene che funzionano come regolatori intrinseci della cascata delle caspasi legandosi alle caspasi (anche già attivate) ne inibiscono l attività enzimatica e ne promuovono ubiquitinazione e degradazione le prime IAP furono identificate nel baculovirus -> conservate in drosophila e nei vertebrati

BIR domain: baculoviral IAP repeat (70-80 aa), responsabili per l interazione con le varie caspasi. Interazioni con specifiche caspasi sono attribuite ai singoli BIR domains (BIR3-Casp9, BIR2-Casp3/7) RING Finger: Zn-finger domain capace di chelare due atomi di Zn. Si trova di solito in proteine che funzionano come E3-Ub ligasi (adattatori che reclutano un substrato per un enzima E2 specifico -> targeting per la degradazione proteasoma-mediata)

Regolatori negativi delle IAP proteine in grado di legare le IAP sopprimendone l attività antiapoptotica XAF-1, XIAP-Associated Factor-1: legando XIAP blocca la sua azione inibitrice su Casp-3 e reverte la sua azione protettiva verso l apoptosi indotta da chemioterapici. Espresso a buoni livelli in tutti i tessuti, è invece estremamente basso nella maggioranza delle linee cellulari di orgine tumorali usate nella ricerca di laboratorio. La perdita dell espressione di questa proteina nelle cellule trasformate potrebbe contribuire alla maggior resistenza all apoptosi che caratterizza le cellule tumorali.

Smac, second mitochondria-derived activator of caspases. Proteina normalmente residente all interno del mitocondrio e rilasciata nel citoplasma durante il processo apoptotico. E un dimero in grado di legarsi a XIAP, IAP-1/-2 e Survivin Si lega agli stessi BIR domain legati dalle caspasi -> inibisce l azione antiapoptotica delle IAP per competizione o spiazzamento. HtrA2/Omi, proteina normalmente residente all interno del mitocondrio e rilasciata nel citoplasma durante il processo apoptotico. In forma di trimero, svolge la sua azione pro-apoptotica per competizione o spiazzamento. Possiede una seconda funzione pro-apoptica, indipendente dalla prima e legata alla sua attività proteasica (serinoproteasi) verso substrati non ancora identificati.

P53 tumor suppressor mutata nel 50% di tumori umani: è la lesione genetica più frequente le mutazioni osservate nei tumori clusterizzano principalmente nella regione responsabile del legame al DNA conservata nei vertebrati, possiede omologhi anche in drosofila e c.elegans

organizzata in 4 domain funzionali, la sua funzione è finemente regolata a più livelli: -degradazione - fosforilazione - acetilazione è un fattore di trascrizione ed agisce in forma di omotetramero regola la trascrizione di gruppi di geni coinvolti in - arresto del ciclo cellulare - apoptosi

proteina molto instabile, i cui livelli sono mantenuti costantentemente bassi all interno della cellula tramite degradazione mediata dalla proteina Mdm2 i suoi livelli cellulari aumentano per mancata degradazione (inattivazione di Mdm2) aumento in seguito a danno del DNA (UV, raggix, chemioterapici) -> due conseguenze biologiche: - arresto del ciclo cellulare (danno moderato) - apoptosi (danno forte)

Geni target di p53 arresto del ciclo cellulare - p21 (CDK inhibitor) apoptosi -Bax -Puma -Noxa -DR5 - Fas/FasL