APOPTOTIC CELL DEATH. L Bongiovanni

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Agnese Lombardo
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1 APOPTOTIC CELL DEATH L Bongiovanni

2 Attenzione Stress cellulare (sostanze tossiche, agenti fisici o chimici) Necrosi o apoptosi Oppure. sovrapposizione dei due processi. necrosi secondaria ad apoptosi

3 Fattori che influenzano il tipo di morte cellulare: Durata e intensità dello stimolo Grado di compromissione del potenziale energetico cellulare Necrosi Apoptosi

4 Caratteristiche dell apoptosi

5 APOPTOTIC CELL DEATH Cell shrinkage Chromatin condensation Formation of cytoplasmic blebs and paoptotic bodies Phagocytosis by macrophages

6 APOPTOTIC CELL DEATH 1. Activation of CASPASES 2. DNA and PROTEIN BREAKDOWN IN KB PIECES Cleavage by Ca2+/Mg2+ - dependent endonucleases into fragments who sizes are multiple of 180 to 200 base pairs 1. MEMBRANE ALTERATIONS and recognition by PHAGOCYTIC CELLS 1. Movement of some phosholipids from inner leaflet to outer leaflet of membrane recognized by Receptors of phagocytes - Detectable by binding of a protein ANNEXIN V 1. Some apoptotic bodies express THROMBOSPONDIN (= adhesive glycoprotein) recognized by phagocytes 2. Apoptotic bodies can become coated with Abs and prteins of Complement (C1q) recognized by phagocytes (opsonization on apoptotic bodies)

7 Meccanismi apoptotici

8 The intrinsic (mitochondrial) pathway of apoptosis.

9 Via intracellulare mancanza di fattori di crescita, ormoni. Stress intracellulari, stress termici, stress ossidativi Radiazioni Danni al DNA: Meccanismo p53-dipendente

10 The extrinsic (death receptorinitiated) pathway of apoptosis

11 Vie extracellulari Stimolazione Death receptors TNF FasL (Fas ligand) TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand ) TNFR1 Fas (Apo-1, CD95) DRs (Death Receptors)

12 Proteine della famiglia Bcl-2 TM (transmemebrane domain): inserimento nelle membrane BH (Bcl-2 homology domain)

13 a. Bax, Bak = monomeri citoplasmatici formazione di oligomeri e inserimento nella membr.mitocondr.durante l apoptosi b. Bcl-2 = sequestro fattori proapoptotici c. BH3-only = sensori dello stress cellulare d. Bid.

14 Clivaggio di Bid in tbid da caspase 8 traslocazione ai mitocondri oligomerizzazione di Bax/Bak e rilascio di cyt C

15 CICD Membrana interna Matrice mitocondriale Cyt C Bcl-2 Cyt C Apaf-1 Pro caspase-9 Attivazione caspase caspase-9 attiva Caspasi esecutrici Membrana esterna apoptosi

16 Via recettoriale Via mitocondriale Attivazione delle caspasi (eccezione: caspasi-12)

activation and recruitment domain) e DED (death

17 Caspasi 13 cistin-proteasi (cysteinil aspartatespecific proteases) omologhe al CED-3 Precursori inattivi Attivazione irreversibile Caspasi iniziatrici: presenza di CARD (caspase activation and recruitment domain) e DED (death effector domain) Inflammatory mediators Apoptosis activator Apoptosis executioner

18 Proteine bersaglio delle caspasi a. Proteine dell involucro nucleare (lamin A) b. Proteine del citoscheletro (Actina, fodrina, Gas2) c. Enzimi riparatori del DNA (PARP) d. Enzimi responsabili della frammentazione del DNA (CAD)

CAD: nucleasi responsabile della frammentazione internucleosomiale del DNA (frammenti multipli di 180-200 pb)

19 CAD: nucleasi responsabile della frammentazione internucleosomiale del DNA (frammenti multipli di pb) Frammentazione del DNA in corso di apoptosi PARP (poliadp-ribosio-polimerasi): trasferimento di ADP-ribosio a frammenti di DNA

20 Regolatori delle caspasi Inibitori dell apoptosi IAPs (Inhibitors of Apoptosis Proteins) BIR (baculoviral IAP repeat): legame e inibizione caspasi RING: attività di E3 (ubiquitina ligasi) XIAP, c-iap1, c-iap2 inibizione caspasi 3, 7, 9 Survivina azione indiretta

INTRINSIC *cerate channels on Apoptotic Pathways EXTRINSIC FasL (expressed on T cells)

Cytochrome c release Binding with Apaf 1 + CAS9 activation Forming a complex APOPTOSOME Activation

Family Bcl-2 Bcl-X antiapoptotic Bim Bim Bad Sensors (proapoptotic) Activation of 2 EFFECTOR Bax

21 INTRINSIC *cerate channels on Apoptotic Pathways EXTRINSIC FasL (expressed on T cells) MITOCHONDRIAL DAMAGE Increase PERMEABILITY Fas Receptor (TNF receptor family) SMAC/ DIABLO Cytochrome c release Binding with Apaf 1 + CAS9 activation Forming a complex APOPTOSOME Activation of DNAase nucleus FLIP FADD CAS8 activation CAS3 activation CAS3 activation Cleavage of DNA Bcl2 Family Bcl-2 Bcl-X antiapoptotic Bim Bim Bad Sensors (proapoptotic) Activation of 2 EFFECTOR Bax and Bak* AIPs (Apoptosis inhibitory proteins) with a caspase-binding domain inhibition of caspases (+++CAS3) Except for SURVIVIN

23 Appartenente alla famiglia delle proteine IAPs Alta espressione durante lo sviluppo embrionale (omeostasi e differenziazione tissutale) Gene quiescente nella maggior parte dei tessuti differenziati (tessuti adulti che esprimono il gene: timo, cellule staminali CD34+ del midollo osseo, epitelio basale del colon, mucosa gastrica, epitelio basale epidermide) Alta espressione nelle neoplasie (correlata con una maggiore aggressività ed invasività)

1) Associazione con la tubulina (regolazione delle dinamiche microtubulari) 2) Localizzaione nei cinetocori dei cromosomi in metafase (corretta

24 1) Associazione con la tubulina (regolazione delle dinamiche microtubulari) 2) Localizzaione nei cinetocori dei cromosomi in metafase (corretta segregazione cromosomica) Mancata funzione survivina difetti di divisione cellulare (centrosomi sovrannumerari, fusi mitotici multipolari, poliploidia)

25 Heat shock proteins: legame al cyt-c, caspasi, APAF-1

26 Bongiovanni et al., 2008

27 Fasi finali del processo apoptotico Fase 1 (FIND-ME): Rilascio di segnali chemiotattici dalle cellule apoptotiche (nucleotidi trifosfato, lisofosfatidilcolina, chemiochina CX3CL1)

28 Fase 2 (EAT- ME/TICKLING) Key eat-me marker = esposizione della fosfatidilserina sulla superficie esterna

citoscheletro ed internalizzazione Fase 4 (PROCESSING)

29 Fase 3 (ENGULFMENT) Attivazione Rac (GTPasi della superfamiglia ras) con riorganizzazione del citoscheletro ed internalizzazione Fase 4 (PROCESSING) Distruzione della cellula apoptotica mediante meccanismo fagolisosomiale

30 CICD = caspase-independent cell death

depolarizzaz membr mitocondr perdita del potenziale di membr rilascio di AIF nel citoplasma trasformazione nella

31 AIF (Apoptosis-Inducing Factor) DOUBLE LIFE/DEATH FUNCTION Mantenimento e/o organizzazione del complesso resp. mitocondriale 1, NADPH ossidoriduttasi, scavenging Caspase-independent cell death a. depolarizzaz membr mitocondr perdita del potenziale di membr rilascio di AIF nel citoplasma trasformazione nella proteina solubile taif b. Traslocazione nucleare parziale, periferica condensazione cromatinica e frammentazione del DNA (reclutamento endonucleasi???)

33 Ruolo di p53 nell apoptosi p53-induced protein with a death domain (PIDD): attivazione caspasi 2 PIG8: legame a Bcl-2 a livello di ER

34 Morphologic features of apoptosis.

35 APOPTOSI Importanza dell apoptosi..in fisiologia. sviluppo embrionale delezione timica di linfociti T autoreattivi turnover cellulare atrofie ormono-dipendenti, senescenza regolazione e spegnimento della risposta immunitaria

36 Esempi di apoptosi fisiologica

37 L apoptosi in patologia Processi Infiammatori Patologie degenerative Patologie Autoimmuni Neoplasie

38 Esempi di apoptosi patologica ( o ) Eliminazione di cellule con danno al DNA (meccanismo protettivo) Danno cellulare in alcune malattie virali Cancerogenesi Malattie autoimmuni (ridotta apoptosi di cellule T autoreattive) Patologie neurodegenerative (Parkinson, Alzheimer) Implicazioni terapeutiche: terapia antitumorale = apoptosi delle cellule neoplastiche

39 Apoptosi indotta dai linfociti secrezione TNF secrezione perforina (linfociti T citotossici, Natural Killer) interazione FasL-FasR formazione pori membrana plasmatica cellula bersaglio inserimento proteasi (granzima) Attivazione caspase-10 o caspasi effettrici

40 Apoptosi indotta dai linfociti T citotossici

41 Cancerogenesi

42 Rimozione degli osteoclasti tramite un processo apoptotico estrogeno-indotto In fase post-menopausale: Riduzione del tasso di estrogeni ridotta apoptosi degli osteoclasti OSTEOPOROSI

Morbo di Alzheimer: mutazioni proteiche (Amyloid precursor protein) Cause di perdita neuronale: 1) Placche di amiloide direttamente neurotossiche 2) Induzione dell apoptosi Formazione di placche di

43 Morbo di Alzheimer: mutazioni proteiche (Amyloid precursor protein) Cause di perdita neuronale: 1) Placche di amiloide direttamente neurotossiche 2) Induzione dell apoptosi Formazione di placche di -amiloide nel cervello 1) Accumulo di fibrille di beta-amiloide attivazione di apoptosi (insieme a stress ossidativo, assenza di fattori neurotropi, basso metabolismo energetico, disfunzione mitocondriale) 2) Presenza di caspase-6 attiva anche negli accumuli precoci neurofibrillari (Guo et al., 2004 ) attivazione delle caspasi in encefali con lievi alterazioni cognitive in assenza di AD manifesta attivazione di meccanismi apoptotici con danno a sinapsi, assoni e dendriti senza causare morte neuronale.

44 Come si identificano le cellule apoptotiche???

45 Valutazione dell apoptosi Esame istologico Microscopia elettronica Elettroforesi: - apoptosi: immagine a scaletta a pioli - necrosi: frammenti di lunghezza variabile (assenza di bande nette) - cellula sana: DNA ad alto PM (no migrazione)

47 Metodica TUNEL ( terminal deoxynucleotidyl transferase end labelling ): marcaggio specifico in situ del DNA frammentato. - aggiunta di nucleotidi marcati alle estremità 3 -idrossiliche dei filamenti rotti di DNA, catalizzata dalla deossinucleotidil transferasi terminale (TdT) Caspasi 3 attiva: riconoscimento della subunità di 17 kda della forma attiva (forma inattiva: 32 kda) Proteine bersaglio delle caspasi: CKs, actina, PARP - fractina: riconoscimento di un frammento di actina liberato attraverso la degradazione operata dalle caspasi

48 APOPTOTIC CELL DEATH

Citofluorimetria: - parametri fisici: dimensione cellulare (ridotta nelle cellule apoptotiche) - Fluorescenza: PI (minore fluorescenza in caso di DNA frammentato) Coloranti fluorescenti: PI,

49 Citofluorimetria: - parametri fisici: dimensione cellulare (ridotta nelle cellule apoptotiche) - Fluorescenza: PI (minore fluorescenza in caso di DNA frammentato) Coloranti fluorescenti: PI, DAPI, Hoechst Annessina V (proteina legante i fosfolipidi con alta affinità per la fosfatidilserina) Markers mitocondriali: coloranti fluorescenti, anticorpo anti-cyt C dimensioni granularità

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