GENSCREEN HIV1/2 version 2

GENSCREEN HIV1/2 version 2 1 micropiastra - 96 test 72278 5 micropiastre - 480 test 72279 PER LA RILEVAZIONE DEGLI ANTICORPI ANTI-HIV1 E ANTI-HIV2 NEL SIERO/PLASMA PER TECNICA IMMUNOENZIMATICA IVD Controllo di qualità del produttore Tutti i prodotti fabbricati e commercializzati dalla società Bio-Rad sono soggetti ad un sistema di garanzia di qualità dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione dei prodotti finiti. Ogni lotto del prodotto è oggetto di un controllo di qualità e viene messo in commercio solo se risulta conforme ai criteri di accettazione. Tutta la documentazione relativa alla produzione e al controllo di ogni lotto viene conservata. 45

SOMMARIO 1 - INTERESSE CLINICO 2 - PRINCIPIO DEL KIT GENSCREEN HIV1/2 VERSIONE 2 3 - COMPOSIZIONE DEL KIT GENSCREEN HIV1/2 VERSIONE 2 4 - VALIDITA - CONSERVAZIONE 5 - MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO 6 - CAMPIONI 7 - PRECAUZIONI 8 - RICOSTITUZIONE DEI REATTIVI 9 - MODALITA D USO 10 - NOTE 11 - CALCOLI E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI 12 - CONTROLLO SPETTROFOTOMETRICO DELLA DISTRIBUZIONE DEL CAMPIONE E DEL CONIUGATO 13 - PRESTAZIONI 14 - LIMITI DEL TEST 15 - REFERENZE BIBLIOGRAFICHE 46

1 - INTERESSE CLINICO La sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) è una patologia infettiva d'origine virale che si traduce in un profondo deficit dell'immunità cellulare. Due tipi di virus apparentati al gruppo dei Lentivirus sono stati isolati dai linfociti di pazienti affetti da AIDS o dai suoi prodromi. Il primo, chiamato HIV1 è stato isolato in Francia e poi negli Stati Uniti. Il secondo, chiamato HIV2, è stato isolato da due malati di origine africana e si è rivelato responsabile di un nuovo focolaio di AIDS in Africa occidentale. Le informazioni sulla variabilità genetica dei ceppi di virus HIV vennero acquisite sequenziando i geni GAG, POL ed ENV dei ceppi rappresentativi di ogni sottotipo. I virus HIV1 sono divisi in due gruppi: gruppo M, che include 9 sottotipi (da A ad I) e gruppo O. Il virus HIV2 include 5 sottotipi; la distribuzione geografica dei differenti sottotipi è ora abbastanza ben definita. Alcune varianti HIV1 hanno solo il 70% d omologia per i geni GAG e POL con i ceppi principali isolati e solo il 50% per il gene ENV; queste differenze possono spiegare la mancata diagnosi di infezione in alcuni pazienti. I differenti ceppi del virus HIV2 presentano delle comunanze antigeniche con il virus della scimmia SIV per quanto riguarda tutte le proteine (proteine dell involucro e proteine interne: eterologia 30%), ma presentano meno del 40% d omologia con le proteine dell involucro del virus HIV1. Il test GENSCREEN HIV1/2 versione 2 permette la rilevazione simultanea degli anticorpi anti-hiv1 e anti-hiv2. 2 - PRINCIPIO DEL KIT GENSCREEN HIV 1/2 VERSIONE 2 GENSCREEN HIV1/2 versione 2 è una tecnica immunoenzimatica basata sul principio sandwich a due passaggi, per la determinazione dei vari anticorpi associati ai virus HIV1 e/o HIV2 nel siero o plasma umano. GENSCREEN HIV1/2 versione 2 si basa sull uso di una fase solida, rivestita con antigeni purificati (proteine ricombinanti GP 160 e P25 del virus HIV1 e peptide mimante l epitopo immunodominante della glicoproteina dell involucro del virus HIV2), e di un coniugato antigeni-perossidasi (peptidi mimanti gli epitopi immunodominanti delle glicoproteine dell involucro dei virus HIV1 e HIV2 e proteina nucleocapsidica ricombinante). L attuazione del test comprende le seguenti tappe di reazione: 1) I sieri da studiare e i sieri di controllo vengono distribuiti nei pozzetti sensibilizzati delle micropiastre. Se sono presenti anticorpi anti-hiv1 e/o anti-hiv2, questi si legano agli antigeni fissati sulla fase solida. Il deposito del campione è validato da un cambio di colore, da porpora a blu (SDP=Sample Deposition Proof). 2) Gli antigeni HIV1 e HIV2 purificati, marcati con perossidasi, vengono aggiunti dopo lavaggio. A loro volta si legano alle IgG e/o IgA e/o IgM legate alla fase solida. 3) La presenza dell enzima immobilizzato sui complessi è rivelata per incubazione, in presenza del substrato, dopo eliminazione della frazione del coniugato rimasta libera. 4) Dopo arresto della reazione, la lettura si effettua allo spettrofotometro a 450 / 620-700nm. L assorbanza misurata per un campione permette di stabilire la presenza o l assenza di anticorpi anti-hiv1 e/o anti-hiv2. 47

3 - COMPOSIZIONE DEL KIT GENSCREEN HIV1/2 versione 2 Tutti i reattivi sono destinati all esclusivo uso diagnostico in vitro. ETICHETTA NATURA DEI REATTIVI PRESENTAZIONE 72278 72279 R1 Microplaque : 12 strisce di 8 pozzetti sensibilizzati 1 piastra 5 piastre con antigeni HIV1 e HIV2 purificati R2 Soluzione di lavaggio concentrata 10 volte 1 flacone 2 flaconi 100 ml 2 x 250 ml R3 Siero di controllo negativo (umano) 1 flacone 1 flacone 1 ml 1 ml R4 Siero di controllo soglia (umano) 1 flacone 1 flacone 2,5ml 2,5 ml R5 Siero di controllo positivo (umano) 1 flacone 1 flacone 1 ml 1 ml R6 Diluente per campioni 1 flacone 2 flaconi 14 ml 2 x 10 ml R7a Coniugato 1 flacone 2 flaconi Antigeni HIV1 e HIV2 purificati, marcati con qb 12.5 ml qb 2 x 30 ml perossidasi, liofilizatto R7b Diluente per coniugato 1 flacone 2 flaconi 12,5 ml 2 x 30 ml R8 Tampone per substrato della perossidasisodio 1 flacone 2 flaconi citrato e Sodio acetato soluzione 60 ml 2 x 60 ml ph 4,0 contenente H 2 0 2 (0,015%) e DMSO (4%) R9 Cromogeno Soluzione : 1 flacone 2 flaconi dcontenente tetrametilbenzidina (TMB) 5 ml 2 x 5 ml R10 Soluzione d arresto : 1 flacone 3 flaconi Acido solforico 1N 28 ml 3 x 28 ml Pellicole adesive per micropiastre 4 12 4 - VALIDITA - CONSERVAZIONE Il kit deve essere conservato tra +2 C e +8 C. Ogni elemento del kit GENSCREEN HIV1/2 versione 2 conservato tra +2 C e +8 C può essere utilizzato, dopo una prima apertura, fino alla data di scadenza indicata sulla confezione eccetto istruzioni specifiche : R1 : Dopo l apertura del sacchetto sotto vuoto le strisce conservate tra +2 C e +8 C nella confezione originale (richiusa con cura) sono stabili per 4 settimane. R2 : Dopo diluizione, la soluzione di lavaggio si conserva per 15 giorni tra +2 C e +8 C. R7a + R7b : i reattivi conservati tra +2 C e +8 C sono stabili per 4 settimane dopo apertura e ricostituzione. R8 + R9 : Dopo la ricostituzione, i reattivi conservati al buio sono stabili per 6 ore a temperatura ambiente (18-30 C). 5 - MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO Acqua distillata Sodio ipoclorito (candeggina) e sodio bicarbonato. Pipette, multipipette automatiche o semi-automatiche, regolabili o fisse, in grado di misurare e dispensare 25 µl, 75 µl, 80 µl e 200 µl. Cilindri graduati di 25 ml, 100 ml, 1000 ml. Contenitore per residui infetti. Bagno-maria o incubatore per micropiastre termostatato a 37 C ± 1 C (*). Dispositivo di lavaggio manuale, semiautomatico o apparecchio di lavaggio per micropiastre (*). Apparecchio di lettura per micropiastre con filtri a 450 nm e 620-700 nm (*). 48

Carta assorbente. (*) Consultare i nostri servizi tecnici per informazioni precise sulle apparecchiature convalidate dai nostri servizi tecnici. 6 - CAMPIONI Prelevare un campione di sangue secondo la prassi in uso. Il test viene eseguito su siero o su plasma non diluiti (prelevati con EDTA, eparina, citrato, anticoagulanti a base di ACD). Separare il siero o il plasma dal coagulo o dai globuli rossi appena possibile, per evitare ogni emolisi. Emolisi estese possono danneggiare le prestazioni del test. I campioni che presentano degli aggregati, prima di essere testati, devono essere purificati per centrifugazione. Le particelle o gli aggregati di fibrina in sospensione possono dare dei risultati falsamente positivi. NON RISCALDARE I CAMPIONI I campioni saranno conservati a +2-8 C se lo screening sarà effettuato entro i 7 giorni o potranno essere conservati congelati a -20 C. Il plasma deve essere velocemente riscaldato per pochi minuti in un bagnomaria a 40 C (per evitare precipitazione di fibrina). Evitare congelamenti/scongelamenti ripetuti. Campioni che sono stati congelati e scongelati piu' di tre volte non possono essere usati. Se i campioni devono essere trasportati, devono essere imballati secondo le norme in uso per il trasporto degli agenti etiologici. NON USARE SIERO O PLASMA CONTAMINATO, IPERLIPEMICO O IPEREMOLIZZATO NOTA BENE: campioni contenenti fino a 90 g/l di albumina, 200 mg/l di bilirubina, campioni lipemici contenenti fino all'equivalente di 36 g/l di trigliceridi, e campioni emolizzati contenenti fino a 20 mg/l di emoglobina, non intaccano i risultati. 7 - PRECAUZIONI La qualità dei risultati dipende dal rispetto delle norme di buona pratica di laboratorio seguenti : Non usare i reattivi dopo la data di scadenza. Non mescolare reagenti di lotti diversi nel corso di uno stesso dosaggio. Nota: È possibile utilizzare altri lotti di soluzione di lavaggio (R2, indicata 10 x in blu sull'etichetta), di tampone substrato (R8, indicato con TMB buf. in blu), di cromogeno (R9, identificato con TMB 11x. in viola) e di soluzione di arresto (R10, indicata con 1N in rosso) diversi da quelli inclusi nel kit con riserva di utilizzare un solo e unico lotto nel corso dello stesso dosaggio. Detti reattivi possono essere utilizzati con altri prodotti della nostra ditta. Contattare il nostro servizio di assistenza tecnica per informazioni dettagliate. La soluzione di rivelazione (tampone substrato + cromogeno) deve essere di colore rosa. La presenza di una colorazione diversa nei minuti successivi alla ricostituzione indica che il reagente è inutilizzabile e deve essere sostituito. Per questa preparazione utilizzare preferibilmente recipienti e materiale in plastica mono-uso distribuiti in commercio o recipienti in vetro precedentemente lavati con acido cloridrico 1N, risciacquati con acqua distillata e asciugati. Conservare la soluzione al riparo dalla luce. Prima dell uso, attendere 10 minuti perchè i reattivi siano in equilibrio con la temperatura del laboratorio. Ricostituire con cura i reattivi. Verificare l esattezza e la precisione delle pipette ed il buon funzionamento degli apparecchi utilizzati. Non modificare la procedura del test. Lavaggio: è indispensabile rispettare scrupolosamente le procedure di lavaggio per avere la massima performance del test. Consigli di igiene e sicurezza I controlli positivo e soglia sono stati inattivati al calore. Il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione del controllo negativo è stato controllato e trovato negativo agli anticorpi anti-hiv1 e anti-hiv2, all antigene HBs e agli anticorpi anti-hcv. Il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione del controllo positivo e del siero soglia è stato testato e trovato negativo all antigene HBs e agli anticorpi anti-hcv. Nessun metodo può garantire in maniera assoluta l assenza del virus HIV, dell epatite B o C o di altri agenti infettivi. Considerare questi reattivi e i campioni dei pazienti come potenzialmente infetti e manipolarli con le precauzioni d uso. Considerare il materiale direttamente in contatto con campioni e reattivi così come le soluzioni di lavaggio come prodotti contaminati. L autoclavaggio a 121 C almeno per 1 ora è il miglior metodo di inattivazione dei virus HIV e del virus dell epatite B. NON INTRODURRE IN AUTOCLAVE SOLUZIONI CONTENENTI IPOCLORITO DI SODIO. 49

La scheda dei dati di sicurezza è disponibile a richiesta. Il trattamento, delle soluzioni e del materiale contaminati, con la candeggina alla concentrazione finale del 5% di ipoclorito di sodio per 30 minuti, permette ugualmente l inattivazione dei virus HIV e del virus dell epatite B. Evitare qualsiasi contatto del tampone substrato, del cromogeno e della soluzione d arresto con la pelle e le mucose (rischio di tossicità, di irritazione e di scottature). D altra parte, la manipolazione e l eliminazione dei prodotti chimici devono essere effettuate secondo le norme di buona pratica di laboratorio. Alcuni reattivi contengono sodio azide come conservante. La sodio azide può formare nelle tubature del laboratorio azidi di piombo o di rame. Queste azidi sono esplosive. Per evitare l accumulo di azidi, sciacquare con gran quantità d acqua le tubature, se le soluzioni contenenti azidi sono eliminate, dopo la loro inattivazione, utilizzando il lavandino. 8 - RICOSTITUZIONE DEI REATTIVI Nota : prima dell uso, permettere ai reattivi di raggiungere la temperatura ambiente (18-30 C). 50 Reattivo 1 (R1) : Micropiastra 12 strisce di 8 pozzetti sensibilizzati con antigeni purificati. Ogni piastra di 12 strisce è contenuta in un sacchetto sigillato lungo una linea. Tagliare il sacchetto con le forbici o con il bisturi 0,5-1 cm sopra la linea. Aprire il sacchetto e rimuovere la micropiastra. Riporre nel sacchetto le strisce non utilizzate. Risigillare il sacchetto con cura e riporlo tra +2 C e +8 C. Reattivo 2 (R2): Soluzione di lavaggio concentrata 10 volte Tampone Tris NaCl ph 7,4 contenente l 1% di Tween 20 e di sodio mertiolato 0,01% massimo. Diluire 10 volte la soluzione con acqua distillata. Si ottiene così la soluzione di lavaggio pronta all uso. Preparare 800 ml per una piastra di 12 strisce. Reattivo 3 (R3) : Siero di controllo negativo (pronto per l uso) Siero umano non contenente anticorpi anti-hiv1 e anti-hiv2, anti-hcv e l antigene HBs, contenente sodio azide 0,1%. Reattivo 4 (R4) : Siero soglia (pronto per l uso) Siero umano contenente una quantità molto bassa di anticorpi anti-hiv, negativo all antigene HBs e agli anticorpi anti-hcv, inattivato al calore; contenente sodio azide 0,1%. Reattivo 5 (R5) : Siero di controllo positivo (pronto per l uso) Siero umano positivo agli anticorpi anti-hiv, negativo all antigene HBs e agli anticorpi anti HCV e inattivato al calore; contenente sodio azide 0,1%. Reattivo 6 (R6) : Diluente per campioni (pronto per l uso) Soluzione di siero di vitello (in tampone Tris con 0,1% di cloroformio, di Proclin e di un indicatore colorato che conferma il deposito dei campioni). Reattivo 7a (R7a) : Coniugato liofilizzato Antigeni purificati HIV1 e HIV2 marcati con perossidasi. Contiene BSA e 0,1% Proclin Battere delicatamente il flacone sul tavolo di lavoro per rimuovere qualsiasi sostanza possa aderire al tappo di gomma. Rimuovere con cura il tappo e versare il contenuto di un flacone di diluente per coniugato nel flacone di coniugato liofilizzato. Chiudere con tappo e lasciare riposare per 10 minuti, agitandolo e capovolgendolo ogni tanto per rendere più facile la dissoluzione. Reattivo 7b (R7b) : Diluente per coniugato Soluzione colorata di latte scremato (in tampone Tris con 0,1% di cloroformio e di Proclin). Reattivo 8 (R8) : Tampone substrato Soluzione pronta all uso di acido citrico e di sodio acetato ph 4,0 contenente 0,015% di acqua ossigenata e 4% di dimetilsolfossido (DMSO). Reattivo 9 (R9) : Soluzione di cromogeno concentrata Soluzione contenente tetrametilbenzidina (TMB). Diluire 1:11 volte la soluzione nel tampone per substrato (Es: 1 ml di Reattivo R9 + 10 ml di Reattivo R8). Stabilità per 6 ore al buio. Réactif 9 (R9) : Solution de chromogène concentrée Solution contenant du tétraméthylbenzidine (TMB). Diluer 11 fois la solution dans le tampon substrat (ex : 1 ml de réactif R9 +10 ml de réactif R8). Stabilité 6 heures. Reattivo 10 (R10) : Soluzione d arresto Soluzione di acido solforico 1N pronta per l uso.

9 - MODALITA D USO Seguire con precisione la procedura proposta. Utilizzare i sieri di controllo negativo, positivo e soglia per ogni serie di determinazioni per validare la qualità delle analisi. Applicare le norme di buona pratica di laboratorio : 1. Stabilire con cura il piano di distribuzione e di identificazione dei campioni. 2. Preparare la soluzione di lavaggio diluita. 3. Togliere la piastra suppporto e le strisce (R1) dall involucro di protezione. 4. Mettere direttamente, senza lavaggio preliminare della micropiastra, successivamente : 4.1 25 µl di diluente in ogni pozzetto 4.2 75 µl di siero di controllo negativo (R3) in A1 75 µl di siero di controllo soglia (R4) in B1, C1 e D1 75 µl di siero di controllo positivo (R5) in E1 75 µl del primo campione in F1 75 µl del secondo campione in G1, ecc... A seconda del sistema utilizzato, è possibile modificare la posizione dei controlli. Omogeneizzare la miscela con almeno 3 aspirazioni con una pipetta da 75 µl o tramite agitazione della micropiastra dopo lo step di distribuzione con la pipetta. E anche possibile mettere 100 µl di un campione precedentemente diluito 3:4 (ex: 150 µl di siero + 50 µl di diluente). N.B.: La distribuzione del campione può essere controllata visivamente in questo passaggio: dopo aver aggiunto il campione, il diluente vira da porpora a blu (vedere sezione 12 per il controllo automatico - CONTROLLO SPETTROFOTOMETRICO DELLA DISTRIBUZIONE DEL CAMPIONE E DEL CONIUGATO). 5. Quando possibile coprire con pellicola adesiva. Premere bene su tutta la superficie per assicurare la tenuta. 6. Incubare la micropiastra nel bagno-maria termostatato o in incubatore a secco per micropiastre per 30 ± 5 minuti a 37 ± 1 C. 7. Rimuovere la pellicola adesiva. Aspirare il contenuto di ogni pozzetto in un contenitore per residui infetti (contenente candeggina) e aggiungere immediatamente in ogni pozzetto almeno 0,370 ml di soluzione di lavaggio. Rispettare un tempo di contatto di almeno 30 secondi. Aspirare di nuovo. Ripetere il lavaggio almeno due volte (3 lavaggi). Il volume residuo deve essere inferiore a 10 µl (se necessario, asciugare la piastra capovolgendola su carta assorbente). Se si dispone di un dispositivo di lavaggio automatico, rispettare la medesima procedura (vedere NOTE 10). 8. Distribuire rapidamente in ogni pozzetto 100 µl della soluzione di coniugato 2 (R7a + R7b). Agitare il coniugato prima dell uso. NB: la distribuzione del coniugato che è colorato di verde può essere controllata visivamente in questo passaggio (vedere sezione 12 per il controllo automatico - CONTROLLO SPETTROFOTOMETRICO DELLA DISTRIBUZIONE DEL CAMPIONE E DEL CONIUGATO). 9. Quando possibile Sigillare con pellicola adesiva nuova ed incubare per 30 ± 5 minuti a temperatura ambiente (18-30 C). 10. Rimuovere la pellicola adesiva, vuotare tutti i pozzetti per aspirazione e lavare 5 volte come in precedenza. Il volume residuo deve essere inferiore a 10 µl (se necessario, asciugare la piastra capovolgendola su carta assorbente). 11. Dispensare rapidamente in tutti i pozzetti 80 µl di soluzione di rivelazione dell'attività enzimatica (R8 + R9) preparata in precedenza. Lasciare che la reazione si sviluppi al buio per 30 ± 5 minuti a temperatura ambiente (18-30 C). Durante questa incubazione, non utilizzare alcun film adesivo. N.B.: A questo stadio della manipolazione è possibile controllare visivamente la distribuzione della soluzione di rivelazione, che presenta una colorazione rosa. Vi è una differenza evidente tra la colorazione di un pozzetto vuoto e quella di un pozzetto contenente la soluzione di rivelazione rosa. (fare riferimento al paragrafo 12 per la verifica automatica VERIFICA SPETTROFOTOMETRICA DEL DEPOSITO DEI CAMPIONI E DEI REAGENTI). 12. Aggiungere 100 µl della soluzione di arresto (R10) seguendo la stessa sequenza e lo stesso ritmo di distribuzione come per la soluzione di rivelazione. Omogeneizzare la miscela di reazione. N.B.: A questo stadio della manipolazione è possibile controllare visivamente la distribuzione della soluzione di arresto, che è incolore. 51

La colorazione del substrato, rosa (per i campioni negativi) o blu (per i campioni positivi), scompare dai pozzetti che diventano incolori (per i campioni negativi) o gialli (per i campioni positivi) in seguito ad addizione della soluzione di arresto. 13. Asciugare accuratamente la parte inferiore delle piastre. Attendere almeno 4 minuti dopo la distribuzione della soluzione di arresto e leggere la densità ottica a 450/620-700 nm per mezzo di un lettore di piastre, entro i 30 minuti successivi all'arresto della reazione. 14 Assicurarsi, prima della trascrizione dei risultati, della concordanza tra la lettura ed il piano di distribuzione e di identificazione delle piastre e dei campioni. 10- NOTE ATTENZIONE : EVITARE CONTAMINAZIONI IN CORSO DI MANIPOLAZIONE * IN CASO DI CONTAMINAZIONI (schizzi ecc.) Gli schizzi non acidi devono essere puliti completamente con una soluzione al 5% (minimo) di ipoclorito di sodio (candeggina). Gli schizzi acidi devono essere puliti a secco. La zona schizzata deve essere in seguito lavata con una soluzione al 5% (minimo) di ipoclorito di sodio (candeggina). Il materiale utilizzato per la pulizia deve essere gettato nel contenitore per residui infetti, poi eliminato secondo le regole adatte allo scopo (vedere Precauzioni 7). NON USARE MAI LO STESSO CONTENITORE PER DISTRIBUIRE IL CONIUGATO E LA SOLUZIONE DI RIVELAZIONE CONTROLLARE LA SOLUZIONE DI RIVELAZIONE ENZIMATICA (tampone substrato e cromogeno) PRIMA DELLA DISTRIBUZIONE. Deve essere incolore. La comparsa di una colorazione blu pochi minuti dopo la ricostituzione indica che il reattivo è inutilizzabile e deve essere sostituito. In effetti, il tampone substrato, il cromogeno, la soluzione di rivelazione e la soluzione d arresto possono essere contaminati da ioni metallici. Per questo motivo si consiglia l uso di contenitori e di materiali di distribuzione in plastica, o di vetreria precedentemente lavata con acido cloridrico 1N ed in seguito risciacquata accuratamente con acqua distillata ed asciugata. LAVAGGIO : Seguire attentamente le procedure di lavaggio descritte per ottenere le massime prestazioni del test. Procedure di lavaggio con lavatore LP35: Dopo accensione del LP35, validare il parametro di lavaggio. Scegliere un n di test (tra 1 e 20) e validare. Scegliere la procedura base n 82 e poi plate mode. Imputare almeno 04 come tempo di contatto e 05 come tempo di lavaggio del fondo. Fatto l aggiustamento, il lavatore torna alla configurazione washing mode 11- CALCOLI E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI La presenza o l assenza degli anticorpi anti-hiv1 e/o anti-hiv2 è determinata confrontando per ogni campione l assorbanza registrata con quella del valore soglia calcolato. 1. Calcolo dell assorbanza media del controllo soglia: (DOR4) DO (B1) + DO (C1) + DO (D1) DOR4 = 3 2. Calcolo del valore soglia Il valore soglia è determinato dal rapporto : DOR4 VS = ------------------------- 10 3. Convalida del test Il siero di controllo negativo deve essere inferiore al 70% del valore soglia : DOR3 < 0,7 VS La media dei sieri di controllo soglia deve essere superiore a 0,80 : DOR4 > 0,8 Opzione: Il rapporto DOR5 deve essere superiore o uguale a 1,3. DOR4 (Questa norma opzionale dovrà essere applicata quando la linearità del lettore utilizzato è al di sopra di 3,000). 4. Interpretazione dei risultati I campioni con valori di assorbanza inferiori al valore soglia sono considerati negativi secondo il test GENSCREEN HIV1/2 versione 2. Tuttavia i risultati situati subito al di sotto del valore soglia (VS-10%<DO<VS) devono essere interpretati con 52

prudenza (è consigliabile ritestare in doppio i campioni corrispondenti quando i sistemi utilizzati e le procedure di laboratorio lo permettono). I campioni con valori di assorbanza uguali o superiori al valore soglia sono considerati inizialmente positivi secondo il test GENSCREEN HIV1/2 versione 2. Devono essere ritestati in doppio prima dell interpretazione finale. Se dopo la ripetizione del test per un campione l assorbanza dei due duplicati è inferiore al valore soglia, il risultato iniziale è non-riproducibile ed il campione è dichiarato negativo secondo il test GENSCREEN HIV1/2 versione 2. Il motivo delle reazioni non-riproducibili è spesso da porre in relazione alle seguenti cause : lavaggio insufficiente delle micropiastre, contaminazione dei campioni negativi con siero a titolo anticorpale elevato, contaminazione della soluzione di rivelazione con agenti chimici ossidanti (candeggina, ioni metallici, ecc.), contaminazione della soluzione d arresto. Se dopo ripetizione del test l assorbanza misurata su uno dei due duplicati è uguale o superiore al valore soglia, il risultato iniziale è riproducibile ed il campione è dichiarato positivo secondo il test GENSCREEN HIV1/2 versione 2 e trattato come indicato al paragrafo 14. 12 - CONTROLLO SPETTROFOTOMETRICO DELLA DISTRIBUZIONE DEL CAMPIONE E DEL CONIUGATO Controllo della distribuzione del campione Dopo la dispensazione del diluente per campioni (R6) e dei campioni, è possibile verificare la presenza dei campioni da testare nei pozzetti per mezzo di una lettura spettrofotometrica a 620 nm: la densità ottica di un pozzetto contenente il campione è superiore a 0,150 (una DO più bassa indica una dispensazione scarsa di campione). Controllo della distribuzione del coniugato Dopo la dispensazione del coniugato (R7a + R7b), è possibile verificare la sua presenza all interno dei pozzetti per mezzo di una lettura spettrofotometrica a 620 nm: la densità ottica di un pozzetto contenente il coniugato è superiore a 0,100 (una DO più bassa indica una dispensazione scarsa di coniugato). Verifica del deposito della soluzione di rivelazione : È possibile verificare la presenza della soluzione di rivelazione rosa mediante lettura automatica a 490 nm: un pozzetto contenente la soluzione di rivelazione deve avere una densità ottica superiore a 0,100 (una DO inferiore indica una cattiva distribuzione della soluzione di rivelazione). Vi è una differenza evidente tra la colorazione di un pozzetto vuoto e quella di un pozzetto contenente la soluzione di rivelazione rosa. 13 - PRESTAZIONI Sono stati effettuati studi di sensibilità con il test GENSCREEN HIV1/2 versione 2 su campioni positivi di pazienti con AIDS o AIDS Related Complex (ARC) e sui pannelli di sensibilità con campioni documentati di pazienti infettati di recente con il virus HIV. La sensibilità verso HIV1 valutata su 413 campioni di pazienti con AIDS o AIDS Related Complex (ARC), positivi all HIV1 sottotipo M e confermati con tecnica Western Blot oltre a 31 campioni di HIV1 sottotipo O e confermati mediante tecnica Western Blot HIV1 è stata stimata pari al 100% La sensibilità verso il sottotipo O testata altresì su 4 campioni HIV1 sottotipo O non determinati in tecnica Western Blot è stata giudicata soddisfacente con 3 campioni risultati positivi. La sensibilità verso HIV2 è stata del 100%. E stata valutata su 119 campioni diluiti o non diluiti da campioni positivi confermati da Wester-Blot. La sensibilità all HIV1 sottotipo M è stata valutata su 29 panel di sieroconversione in commercio (BBI, NABI, Bioclinicals partners) come pure sul panel di sensibilità dell INTS. I risultati sono conformi alla situazione in materia. Sul panel dell INST, risultano positivi sia i 45 campioni di sieroconversione sia i 13 di per-sieroconversione. La specificità del test su una banca del sangue di donatori è stata stimata del 99,98% per 5025 campioni esaminati. Sono stati osservati 3 risultati positivi su 212 in pazienti affetti da patologie diverse o non correlate all epatite B (donne in gravidanza, fattore reumatoide, IgG anti-nucleari, o altre infezioni virali). L accuratezza del test GENSCREEN HIV1/2 versione 2 è stata determinata con l analisi di 4 campioni: 1 campione negativo (campione 1), 2 campioni bassi positivi anti-hiv1 (campioni 2 e 3) e un campione alto positivo anti-hiv1 (campione 4). La riproducibilità intra test è stata valutata testando questi 4 campioni 30 volte nella stessa sessione, la 53

riproducibilità inter test è stata valutata testando questi 4 campioni 3 volte su 2 micropiastre effettuate in due sezioni diverse ogni giorno per 5 giorni. I risultati sono mostrati nelle tabelle seguenti : Tabella 1 : Riproducibilità intra test n = 30 Campione 1 Campione 2 Campione 3 Campione 4 media dei rapporti * 0,12 3,34 9,05 19,6 deviazione standard (DS) 0,04 0,45 0,30 0,73 Rapporti * CV (%) 31,5% 13,6% 3,3% 3,7% * rapporti = DO / VS Tabella 2 : Riproducibilità inter test n = 30 Campione 1 Campione 2 Campione 3 Campione 4 media dei rapporti * 0,12 3,43 9,27 19,35 deviazione standard (DS) 0,02 0,41 0,89 1,93 Rapporti * CV (%) 19,3% 12,1% 9,65% 10,0% * rapporti = DO / VS 14 - LIMITI DEL TEST Un titolo molto basso di anticorpi non può essere rilevato durante il primo stadio dell infezione, di conseguenza un risultato negativo indica che il campione controllato non contiene anticorpi anti-hiv rilevabili con il test GENSCREEN HIV1/2 versione 2. Tuttavia, questo risultato non esclude una possibile infezione HIV1/HIV2. La variabilità di HIV1 (sottotipo M e sottotipo O) e di HIV2 non permette di escludere la possibilità di avere reazioni falsamente negative. Nessun test conosciuto può offrire una garanzia completa di assenza del virus HIV. Tecniche ELISA altamente sensibili possono produrre risultati falsamente positivi. Per verificare la specificità della reazione, ogni risultato positivo (in accordo con i criteri di interpretazione del test GENSCREEN HIV1/2 versione 2) dovrebbe essere sottoposto ad un test di conferma (Western Blot). Il riscaldamento dei campioni può influenzare la qualità dei risultati. Il metodo colorimetrico di verifica del deposito dei campioni e/o dei coniugati e/o della soluzione di rivelazione non consente di verificare l'esattezza dei volumi distribuiti ma soltanto di evidenziare la presenza di campioni e/o dei coniugati e/o della soluzione di rivelazione. Il tasso di risposte errate ottenute con tale metodo è collegato alla precisione del sistema utilizzato (dei CV con cumuli di pipettaggio e di lettura superiori al 10% possono deteriorare significativamente la qualità di detta verifica). Nel caso di lavaggio inefficace in seguito alla fase di incubazione del coniugato, la verifica automatica della distribuzione della soluzione di rivelazione (mediante lettura a 490 nm delle densità ottiche dei pozzetti) può dare risultati errati con densità ottiche superiori a 0,100 in assenza di soluzione di rivelazione. Tuttavia questo fenomeno non è stato osservato nel corso delle valutazioni condotte su 939 campioni testati. 15 - REFERENZE BIBLIOGRAFICHE Vedere versione francese 54