XIX CORSO NAZIONALE PER TECNICI DI LABORATORIO BIOMEDICO Riccione, 22-25 Maggio 2012 Analisi della Malattia Minima Residua Dr.ssa Anna Gazzola Laboratorio di Patologia Molecolare, Sezione di Emolinfopatologia, Dipartimento di Ematologia e Scienze Oncologiche "L. and A. Seràgnoli", Ospedale S. Orsola Malpighi, Università di Bologna
MALATTIA MINIMA RESIDUA (MRD): Malattia Minima Residua: il più basso livello di malattia dimostrabile in un particolare paziente utilizzando metodi correnti Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche DRUG Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva.
PERCHE STUDIARE LA MRD? L ANDAMENTO MOLECOLARE DELLA MALATTIA PRECOCE IDENTIFICAZIONE DELLA RICADUTA STRATIFICAZIONE DEI PAZIENTI IN BASE AL RISCHIO SCELTA DELLA TERAPIA VALUTARE LA RISPOSTA AL TRATTAMENTO
MALATTIA MINIMA RESIDUA IN ONCOEMATOLOGIA Nonostante i considerevoli miglioramenti della terapia in onco-ematologia, un notevole numero di pazienti recidiva. Necessità di diagnosticare una recidiva quanto più precocemente possibile, per consentire il trattamento in presenza di una massa tumorale più ridotta possibile Il metodo di rilevazione riveste una importanza notevole (sensibilità e specificità)
Metodi per lo studio della MRD METODO MORFOLOGIA IMMUNOFENOTIPO CITOGENETICA FISH CITOFLUORIMETRIA PCR SENSIBILITA 1-5 % 1-5% 1% 10-3 10-3 /10-5 10-4 /10-6
Metodi per lo studio della MRD METODO MORFOLOGIA IMMUNOFENOTIPO CITOGENETICA FISH PCR - Scarsa utilità per la MRD - Bassa sensibilità e specificità SENSIBILITA 5% 1-5% 1% 10-3 % >0,0001%
Metodi per lo studio della MRD METODO MORFOLOGIA IMMUNOFENOTIPO CITOGENETICA FISH CITOFLUORIMETRIA PCR SENSIBILITA 1-5 % 1-5% 1% 10-3 10-3 /10-5 10-4 /10-6
Citofluorimetria Diverse combinazioni immunofenotipiche Espressione antigenica aberrante vs controparte normale 4 marker vs 8 markers (S: 10-4 ) LIMITI: Sensibilità dipende dai tipi di aberrazioni fenotipiche Anticorpo utilizzato Mancanza di standardizzazione Stabilità fenotipo tumore associato
PCR:POLYMERASE CHAIN RAECTION Consente di amplificare esponenzialmente in vitro una sequenza specifica di DNA La PCR può essere utilizzata anche se la quantità dei tessuti è minima, in tessuti fissati, criopreservati Questa sequenza puo èssere rappresentata da un qualsiasi gene di interesse Elevata sensibilità e specificità Saggi paziente-specifici
PCR:POLYMERASE CHAIN RAECTION PCR QUALITATIVA RQ-PCR vs
PCR:POLYMERASE CHAIN RAECTION PCR QUALITATIVA Semplice Economico No analisi della cinetica del tumore Aspecifici Efficienza di amplificazione variabile e dipendente da vari fattori Impossibilità di stabilire la quantità di sequenza bersaglio RQ-PCR (tecnologia taqman) Accurata quantificazione del prodotto di PCR Elevata accuratezza No amplificazioni aspecifiche o falsi positivi Nessuna manipolazione post- PCR Velocità Confrontabilità oggettiva dei risultati Costoso Complesso
Per effettuare una valutazione della MRD è necessario identificare un marker molecolare associato alla malattia che ne permetta il monitoraggio
Per effettuare una valutazione della MRD è necessario identificare un marker molecolare associato alla malattia che ne permetta il monitoraggio Tumore-specifico Stabile nel corso della malattia
Marker molecolari in oncoematologia Riarrangiamento IGH Riarrangiamento TCR Traslocazioni cromosomiche o overespressione oncogene o proteina di fusione
Riarrangiamento (V/D/J) IGH & TCR Unicità di ogni riarrangiamento (scelta casuale dei frammenti V/ D/J inserzione e/o delezione casuale di nucleotidi nei punti di giunzione Regione giunzionale IGH /TCR considerata DNA-fingerprints delle cellule maligne Target tumore-specifico Virtualmente applicabile a tutti i pazienti Studio MDR paziente-specifico Approccio accurato specifico e sensibile (10-5 ) LIMITI Metodica complessa (sequenziamento per definire la regione giunzionale/disegno di primers paziente-allele-specifici Elevati costi Sensibilità può cambiare in base al tipo di riarrangiamento (+/- simile a cellule normali)
Traslocazioni cromosomiche Stabile associazione con cellule neoplastiche (indipendentemente dai cambimenti biologici dovuti a selezione clonale) Può essere studiata mediante numero limitato di primers Non richiede sequenziamento e sintesi di primers paziente-specifico Regione di fusione dell aberrazioni cromosomica come MRD targets (RNA vs DNA) LIMITI Permette lo studio solo di un limitato subset di pazienti Risultati falso-positivi, Traslocazioni non tumore-specifiche [t(14;18)].
Traslocazioni e riarrangiamenti nei linfomi Patologia Traslocazione Geni coinvolti Linfoma follicolare t(14;18) BCL2/IGH Linfoma mantellare t(11;14) BCL1/IGH Linfoma di Burkitt t(8;14) MYC/IGH ALCL t(2;5) ALK/NPM
Indipendentemente dall approccio usato l analisi della MRD necessita standardizzazione e uniformità internazionale Molti gruppi europei uniti con lo scopo di delineare linee guida comuni per l analisi dei dati
la nostra esperienza
FONDAZIONE Fondazione ITALIANA Intergruppo Italiano LINFOMI Linfomi-ONLUS Sede legale : piazza Turati 5, 15100 - Alessandria Segreteria: c/o S.O.C. Ematologia Azienda Ospedaliera Santi Antonio e Biagio e Cesare Arrigo, Via Venezia 16, 15100 Alessandria Tel. 0131-206129-206156; Fax 0131-261029; e-mail: segreteria@iilinf.it ; sito web: www.iilinf.it FIL-MRD-Network Standardizzazione italiana dello studio della Malattia Minima Residua nel Linfoma Follicolare e nel Linfoma Mantellare
Standardizzazione dello studio della Malattia Minima Residua nel Linfoma Follicolare Standardizzazione PCR qualitativa (nested-pcr) Standardizzazione della PCR quantitativa (RQ-PCR) Analisi risultati mediante criteri ESG-MRD-ALL Van der Velden et al. Leukemia 2007 21, 604 611
Standardizzazione dello studio della Malattia Minima Residua nel Linfoma Mantellare Standardizzazione della MRD mediante l'utilizzo del riarrangiamento delle IGH paziente-specifico (PRC qualitativa e RQ-PCR) Basso rate di successo della standardizzazione della t(11;14) Analisi di clonalità Disegno primers pts-specifici Analisi MRD Denaturazione/rinaturazione DENATURAZIONE/RINATURAZIONE
prospettive future
Next Generation Sequencing Estendere la valutazione della MRD a tutti i pazienti Eliminare difficoltà di saggi pazientespecifico Aumentare le informazioni