ufc/ml 07/01/2015 1 Pseudomonas putida 0,1 Ampicillina Acqua Streptomicina tempo duplicazione: 42 minuti 0,01 0 30 60 90 120 150 180 Tempo Micrococcus luteus 1,000 0,100 Series1 Series2 Series3 0,010 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 10 Curva di crescita (E.coli) Acqua Streptomicina Ampicillina 1 OD 600 0,1 0,01 0 30 60 90 120 150 180 t / min 1
Le condizioni di crescita batterica differiscono molto tra natura e lab In laboratorio: tempo di duplicazione del batterio Escherichia coli: 20-100 min Nell ambiente esterno: tempo di duplicazione 2-3 giorni (???) Nell ospite (es. tratto intestinale di mammifero): tempo di duplicazione 6-12 ore (???) Condizioni di crescita batterica nell ecosistema Comunità multispecie, adese a superfici solide Condizioni indefinite Fluttuazioni nella temperatura limitazione in sostanze nutritive (oligotrofia) Radiazioni UV Composti tossici predazione Stato di stress cellulare (Laboratorio: colture pure in condizioni ottimali ) Biologia dei biofilm... J. Bacteriol. 25, 277-286 (1933) aus C. E. Zobell: "The effect of surfaces on bacterial activity", J. Bacteriol. 46, 39-56 (1943) 2
BIOFILM Comunita ben strutturata di batteri e cellule eucariotiche racchiuse in una matrice polimerica prodotta dalle cellule stesse, e che cresce su superfici (inerti o biologiche ), soprattutto all interfaccia con una fase liquida Un caso reale di biofilm come osservato in microscopia elettronica Adesione Colonizzazione Maturazione Interazioni fisico-chimiche Pili Capsula o EPS (idrofobicità, carica elettrica) Polisaccaridi (alginato) Meccanismi di segnalazione Flagello Fattori di aggregazione cellulare intercellulare e interspecie Proteine di membrana (curli, ecc ) esterna, parete cellulare, LPS.. 3
Importanza dei biofilm microbici Biofilm come fattore di virulenza: infezioni da biofilm più virulente, più tendenti a cronicizzarsi e più resistenti alle terapie Batteri adesi ad una superficie solida o flocculati sono utilizzati preferenzialmente in bioreattori industriali e nella depurazione delle acque di scarico I biofilm sono ubiquitari I segreti del successo dei microrganismi procarioti Semplicità dell organizzazione cellulare Flessibilità metabolica: utilizzo di una grande varietà di substrati metabolici, biosintesi di macromolecole Adattamento alle diverse condizioni ambientali Condizioni di crescita batterica nell ambiente naturale Fluttuazioni nella temperatura Disponibilità di sostanze nutritive Esposizione a radiazioni UV Composti tossici 4
Quanti geni sono necessari per la vita della cellula batterica? Nel batterio modello Escherichia coli si stima la presenza di 4.200 geni circa Solo un numero molto ridotto (200-300) è essenziale (la loro assenza o mancanza di funzionalità è incompatibile con la vita della cellula in condizioni ottimali ) Esempi di geni essenziali: subunità dell RNA polimerasi, proteine ribosomali, proteine per la sintesi del peptidoglicano, etc. Gli altri geni vengono detti non essenziali, anche se possono essere necessari alla sopravvivenza della cellula in alcune circostanze (es. crescita anaerobia, stress ossidativo da H 2 O 2, etc.) Regolazione dell espressione genica L espressione dei geni può essere costitutiva (continua e a livelli abbastanza costanti) O sottoposta a regolazione (inducibile; innescata da particolari condizioni o stimoli ambientali e cellulari) DNA trascrizione RNA traduzione PROTEINE Livello trascrizionale Livello posttrascrizionale (Repressione della traduzione, stabilità di mrna/proteine) Regolazione attività enzimatica Regolazione espressione genica 5
Regolazione dell espressione genica L adattamento alle differenti condizioni ambientali e fisiologiche si realizza tramite la regolazione dell espressione genica Geni soggetti a regolazione vengono espressi esclusivamente per specifiche necessità della cellula ed in risposta a segnali specifici, evitando così sprechi energetici Tra i geni soggetti a regolazione: geni per l utilizzazione di particolari fonti di carbonio, riparazione del DNA, geni coinvolti nella risposta a stress ambientali Un modello semplice di crescita cellulare: La curva di crescita batterica (E. coli) Adattamento a nuova fase Fine della fase di crescita: stasi cellulare/ morte Crescita su glucosio (fonte preferita di carbonio) Crescita su fonte di carbonio alternativa (disaccaridi e zuccheri complessi, amino acidi, acidi grassi, altri composti organici) Espressione di fenotipi e comportamenti cellulari specifici Mobilità cellulare (espressione del flagello) Crescita su glucosio Crescita su glicerolo Motilità cellulare 6
Regolazione a livello trascrizionale: La forma preferita di regolazione genica La regolazione a livello trascrizionale interessa la grande maggioranza dei geni Vantaggio: massimo risparmio energetico (nessuna produzione di mrna/proteina) Regolazione possibile a diversi livelli: iniziazione, elongazione, terminazione e stabilità del messaggero Possibilità di regolazione positiva o negativa della trascrizione (Attivazione o Repressione) I due livelli funzionali della regolazione trascrizionale RNA polimerasi Regolazione da fattori sigma alternativi (principalmente regolazione positiva) Regolazione da proteine (fattori) accessorie all RNA polimerasi (regolazione sia positiva che negativa) I fattori s dell RNA polimerasi hanno un ruolo chiave nella regolazione della trascrizione 7
Il Promotore perfetto UP element -35 Ext. -10 D +1 AAATAAAATTTTTAAn..nTTGACAnnn nnntgntataatnnattan 14nt 4-6nt 4-6nt 17nt Riconosciuto dalla subunità a Riconosciuti dalla subunità s Fattori sigma differenti sono specifici per la trascrizione di classi funzionali diverse Fattore s Gene Funzione s D (s 70 ) rpod Fattore s principale (housekeeping) s S rpos Adattamento a fase stazionaria s N (s 54 ) rpon Metabolismo/carenza di azoto/carbonio s H rpoh Shock termico s E rpoe Shock termico estremo s F flai Flagello e strutture extracellulari s I feci Assimilazione ferro Il promotore perfetto per s 54 UP element -24-12 D +1 ATAAAATTTTTAA n..nnnnn CTTGGCACNNNNNTTGCa/tnnattA 15-20 nt 4-6nt 4-6nt Riconosciuto dalla subunità a Riconosciuti da s 54 8
Un esempio di fattore sigma alternativo: s S Cellule in crescita Riduzione della velocità di crescita Cellule in fase stazionaria Accumulo di fattori trascrizionali specifici (Sigma S) Cambio nell espressione genica cellulare Cambiamenti nella morfologia e nella fisiologia cellulare σ S Adattamento alle nuove condizioni Mutazioni nel gene rpos in Escherichia coli: Effetti pleiotropici Biofilm Sopravvivenza a stress ossidativo (H 2 O 2 ) WT rpos kate rpos WT Attivazione o Repressione Attivazione (controllo positivo) promotori deboli (=basso livello di trascrizione) non riconosciuti da RNA pol in assenza di una proteina regolatrice (attivatore) Repressione (controllo negativo) promotori forti (=+ alto livello di trascrizione) la proteina regolatrice blocca l interazione RNA pol/promotore 9
Sito di legame Le proteine regolatrici (sia attivatori che repressori) si legano a delle sequenze specifiche sul DNA (Sequenze di legame o sequenze bersaglio) Le sequenze di legame sono in genere parte integrante del promotore Un esempio di sito di legame CONSENSUS: AAATGTGA_6bp_TCACATTT 10