UNIVERSITA DEGLI STUDI DI PERUGIA FACOLTA DI MEDICINA VETERINARIA Centro di Studio del Cavallo Sportivo Applicazione della biologia molecolare nella valutazione del benessere del cavallo Andrea Verini Supplizi
Definizione di benessere animale Stato dell animale in relazione ai tentativi di far fronte al proprio ambiente Broom (1986)
I fallimenti e le difficoltà nel rapportarsi al proprio ambiente sono indicatori di scarso benessere Tra questi menzioniamo : - la ridotta aspettativa di vita - il peggioramento della crescita e delle funzioni riproduttive - la presenza di traumi e ferite - la maggiore suscettibilità alle malattie - i comportamenti anomali.
Nel cavallo sportivo un esercizio eccessivo in fase di allenamento e durante la competizione può portare all insorgenza di numerosi problemi
E indispensabile quindi, conoscere le modificazioni funzionali indotte nell organismo dall esercizio Alcune sono note ma non del tutto chiariti restano i meccanismi molecolari La conoscenza di tali meccanismi potrebbe essere utilizzata per ottenere migliori prestazioni salvaguardando l integrità dell animale.
Approcci per l analisi l molecolare del benessere animale Gemomica funzionale (Espressione genica) Proteomica (Profili proteici) Metabolomica (Profili Metabolici)
Analisi dell espressione genica: tecniche basate sull ibridazione tecniche basate sulla PCR tecniche basate sul sequenziamento
I VANTAGGI DELLA TECNICA cdna-aflp permette l utilizzo di una piccola quantità di RNA e la comparazione simultanea di diversi campioni non è limitata dall informazione sulla sequenza del gene ridotto numero di falsi positivi rispetto ad altre tecniche di RNA fingerprinting permette di avere una corrispondenza tra la quantità di mrna presente nel pool originario e l intensità delle bande presenti nel gel di poliacrilammide
OBIETTIVI IERI e OGGI Ottimizzare la tecnica del cdna-aflp RNA-fingerprinting Analizzare i profili trascrizionali di cavalli da condizioni di stress endurance in differenti Individuare e sequenziare interi cdna di geni coinvolti nella risposta allo stress FUTURO? - Individuazione di geni candidati - Selezione assistita da marcatori molecolari - Prevenzione della sindrome da overtraining su base molecolare
Sperimentazione Cavalli da endurance sottoposti a diversi carichi di lavoro Allenamento su treadmill Gara di Endurance
TREADMILL Competition Exercise Test modificato da Rueca e coll. (CETm) Fase Andatura Velocità (m/s) Tempo (min) Distanza (m) Inclinazione ( ) 1 Passo 1,7 6 612 3 2 Trotto 3,7 7 1554 3 3 Galoppo 10,7 2 1284 3 4 Trotto 3,7 14 3108 3 5 Passo 1,7 6 612 3 6 Canter 9,2 5 2760 3 7 Passo 1,7 20 2040 0
Passo Galoppo Prelievi Basale = cavallo a riposo, prima dell esercizio Canter = dopo il canter 60 = 60 dopo la fine del test 24h = 24h dopo la fine del test 48h = 48h dopo la fine del test
GARA DI ENDURANCE (160 KM ) Prelievi Basale = cavallo a riposo prima della gara; Arrivo = subito dopo la gara; 24h = 24h dopo la fine della competizione; 48h = 48 dopo la fine della competizione;
cdna-aflp Estrazione RNA ed isolamento dell mrna Retrotrascrizione dell mrna a cdna Digestione con 2 enzimi di restrizione e ligazione adattatori Amplificazioni selettive dei frammenti PAGE di prodotti ottenuti
A B 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Gel elettroforesi cdna-aflp da linfociti di cavalli sottoposti ad esercizio su treadmill: (1) basale; (2) canter; (3) 60 ; (4) 24h; (5) 48h. Trascritto risultato omologo alla prostaglandina GH-sintetasi 2 di cavallo
RISULTATI TREADMILL 2 TRASCRITTI MODULATI CON 16 COMBINAZIONI DI PRIMERS B C 60 24 48 Gene umano (SIAH2) omologo a seven in absentia (sina) di Drosophila (n. accesso: gi15341819 gb BC013082.1 BC013082) B C 60 24 48 Prostaglandina G/H-sintetasi 2 (n. accesso: gi 2586066 gb AF027334.1 AF027334) Data Base of National Center for Biotechnology Information, allineamento ottenuto tramite BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
RISULTATI DELLA GARA DI ENDURANCE 92 TRASCRITTI MODULATI CON 55 COMBINAZIONI DI PRIMERS N. 55 FRAMMENTI CLONATI E SEQUENZIATI N. 12 cloni non hanno trovato similarità con sequenze presenti in banca dati N. 19 cloni sovrapponibili a sequenze umane di cui non si conosce la funzione N. 2 cloni hanno trovato similarità con fattori trascrizionali umani N. 2 cloni hanno trovato similarità con sequenze di cavallo non significative N. 8 cloni hanno trovato similarità con sequenze significative di altri mammiferi N. 12 cloni sovrapponibili a SINE o LINE (Short o Long Interspersed Nucleotidic Element)
RT-PCR e RACE-PCR Verifica dell andamento dell espressione individuata con i cdna-aflp tramite reverse transcriptasepolimerase chain reaction (RT-PCR) Isolamento dell intero cdna tramite rapid amplifications of cdna ends (RACE-PCR)
RT-PCR L RT-PCR è una amplificazione dell mrna che si vuole retrotrascivere a cdna utilizzando primers specifici del gene in esame. L L RT-PCR ha confermato il profilo di espressione del cdna-aflp del gene RBBP
RACE (Rapid Amplification of cdna Ends) Tale metodica può essere utilizzata per ottenere DNA complementari (cdna) completi del gene di interesse La conoscenza della sequenza interna permette la produzione di primer gene specifici (GSP) per la sintesi ed amplificazione dell intero cdna Porzione cdna isolato
CONCLUSIONI La tecnica cdna-aflp può essere usata con successo nello studio della espressione genica in cavalli sottoposti a condizioni stressanti La RACE ci ha permesso di clonare l intero cdna per i geni di IL-8 RBBP HSP90 EIF4G3 Ricerche sono in corso per individuare altri geni coinvolti nella risposta allo stress e per confermare in risultati ottenuti