C.L. Medicina e Chirurgia Università di Chieti-Pescara Anno Accademico 2015-2016 Tecniche per la valutazione della attività in vitro degli antibiotici: Antibiogramma Giovanni DI BONAVENTURA, PhD Dipartimento di Scienze Sperimentali e Cliniche Scuola di Medicina e Scienze della Salute Università G. d Annunzio di Chieti-Pescara
Tests di antibiotico-sensibilità Obiettivi I tests di sensibilità agli antibiotici permettono la valutazione del profilo di sensibilità di un ceppo microbico, presunta causa della malattia, verso uno o più antibiotici. I tests vengono eseguiti in vitro, ossia in condizioni standardizzate per garantire la riproducibilità e la accuratezza dei risultati. I risultati di questi tests debbono essere adeguatamente interpretati per guidare la scelta dell antibiotico da adottare. A tal fine contribuiscono, ovviamente, anche le informazioni cliniche e l esperienza professionale. Obiettivi: - INDIVIDUALE: predire il successo od il fallimento in vivo della terapia antibiotica mirata. - EPIDEMIOLOGICO: monitorare la evoluzione della antibiotico-resistenza, per la definizione della terapia empirica, per l aggiornamento dello spettro di azione clinico della molecola, per l adozione di adeguate misure di controllo e/o per verificarne l efficienza.
Tests di antibiotico-sensibilità Standardizzazione La intrinseca variabilità biologica della sensibilità microbica agli antibiotici rappresenta la principale limitazione dei tests di sensibilità. E dunque necessario controllare tutti i fattori tecnici mediante rigorosa standardizzazione di tutte le fasi analitiche e post-analitiche (purezza e concentrazione dell inoculo batterico, composizione del terreno, reattivi, condizioni di incubazione, metodi di lettura e di interpretazione dei risultati). Informazioni dettagliate ed aggiornate al riguardo della esecuzione dei tests di sensibilità e della interpretazione dei risultati vengono fornite dalla CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute), già NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards), e dall EUCAST (European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing).
Tecniche per la determinazione in vitro della antibiotico-sensibilita Le metodiche che possono essere utilizzate dal Microbiologo Clinico per valutare la sensibilità microbica agli antibiotici sono: FENOTIPICHE (basate sulla attività antimicrobica ed utilizzo dei breakpoints) QUANTITATIVE (determinazione di MIC) - Microdiluizione in brodo (gold standard) Manuale od automatizzato - Agar diluizione (gold standard) - Epsilometer test (E-test) (manuale) QUALITATIVE (classe di sensibilità) - Kirby-Bauer o diffusione in agar (manuale) GENOTIPICHE (basate sulla ricerca di un gene di resistenza o di un suo prodotto) meca, blaz, vana, vanb, PBP2a, Verranno trattate soltanto alcune tra le tecniche fenotipiche. Per le altre, si rimanda al C.I. «Medicina di Laboratorio»
Tecniche per la determinazione in vitro della antibiotico-sensibilità Condizione essenziale per l esecuzione di un antibiogramma accurato ed attendibile è l impiego di una coltura PURA, ossia derivata da una singola colonia (popolazione clonale). Una coltura pura di un microrganismo potrà essere ottenuta a seguito di sub-coltura della crescita primaria (ossia quella ottenuta dalla semina del campione clinico) mediante tecnica di semina per isolamento. Coltura PURA (monomicrobica) Coltura non PURA (polimicrobica) Tecnica di semina per isolamento
Kirby-Bauer Esecuzione 1. Allestimento di una sospensione batterica standardizzata (1 x 10 8 CFU/ml) da una coltura pura 2. Semina della sospensione alla superficie di un terreno standardizzato 3. Apposizione di dischetti antibiotizzati 4. Incubazione (37 C, 18-24h) 5. Lettura (misurazione degli aloni di inibizione) ed interpretazione (S, I, R) dei risultati
A seguito della applicazione del dischetto, la molecola antibiotica diffonde nell agar in direzione centrifuga, creando un gradiente dinamico di concentrazioni antibiotiche. Il microrganismo inizia a dividersi e cresce verso una massa critica. Si formerà un alone di inibizione dovuto alla inibizione della crescita batterica indotta dall antibiotico fino a che ( testa dell alone) la densità cellulare sarà tale da assorbire la molecola nelle immediate vicinanze, in tal modo mantenendone le concentrazioni a livelli subinibenti e, quindi, permissivi per la crescita batterica. Kirby-Bauer Principio
La lettura del risultato consiste nella misurazione del diametro del alone di inibizione formatosi attorno al dischetto. Considerando il gradient di concentrazione formatosi (tende a diminuire in direzione centrifuga), la sensibilità del ceppo batterico alla molecola saggiata sarà diretta funzione del diametro misurato: S = k d Kirby-Bauer Lettura dei risultati
Saggi fenotipici Kirby Bauer Pros & Cons - Semplicità di esecuzione, non richiede strumentazione accessoria - Fornisce un risultato (classi di sensibilità), facilmente interpretabile dal Clinico - flessibilità, nella selezione delle molecole da saggiare - Economico (il meno costoso tra i tests di sensibilità) - Non automatizzabile - Non consente la crescita di tutti i microrganismi esigenti
Microdiluizione in brodo Esecuzione e lettura risultati L antibiotico (a concentrazioni scalari 2-fold) viene solubilizzato in brodo di crescita. A seguito di semina dell inoculo standardizzato, il sistema viene incubato a 37 C per 16-20 h, quindi viene letta la MIC. MIC (Concentrazione Minima Inibente) è una misura quantitativa dell attività di un antibiotico verso un determinato batterio. Definita come la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica visibile. Si esprime in µg/ml (mg/l). 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 + -
Agar diluzione Esecuzione e lettura risultati L antibiotico (diluizioni scalri 2-fold) viene incluso in agar. MIC: minima concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita microbica visibile (colonie).
Saggi fenotipici tests di brodo/agar diluizione Pros & Cons - Elevata riproducibilità ( gold standard ) - Quantitativa: genera valori di MICs (anche MBC nel caso della diulizione in brodo) - economica (reagenti, strumentazione) - Consente di verificare la accuratezza di sistemi automatizzati in caso di risultati discordanti - Laborioso (tempi) - Richiede elevato know-how - Tecnica manuale, possibili errori in fase pre-analitica (es. preparazione diluizioni seriali di antibiotico)
Sistemi automatizzati Fino agli anni 70 i tests di antibiotico-sensibilità venivano condotti esclusivamente mediante metodiche manuali. La possibilità di automatizzare tali tests: i) riduce significativamente i tempi di esecuzione dell indagine e, quindi, il tempo richiesto per la refertazione dei risultati; ii) minimizza gli errori legati all operatore; iii) aumenta la sensibilità di lettura. Nel 1974 venne per la prima volta introdotto un Sistema automatizzato (Autobac I; Pfizer Diagnostics). Attualmente, la maggior parte dei laboratori clinici utilizza un sistema automatizzato per la valutazione della attività antimicrobica degli antibiotici.
Sistemi automatizzati Esecuzione In questo sistema non è possibile testare, per ciascuna molecola, un range di concentrazioni ma soltanto i valori bkp-s e bkp-r. Pertanto, il risultato indicherà soltanto la posizione del valore di MIC rispetto ai bkps (MIC<bkpS; bkps<mic<bkpr; MIC>bkpR), ma non il valore esatto di MIC.
Phenotypic tests Sistemi automatizzati Pros & Cons - Riduzione del lavoro - Rapida refertazione dei risultati, tempestivo avvio della terapia antibiotica - Possibilità di organizzare i risultati in databases, utili per la consultazione retrospettica dei trends di isolamento e di resistenza. - Scarsa flessibilità: possibilità di saggiare pannelli standardizzati (commercializzati) di antibiotici - Difficoltà di analisi per microrganismi a lenta crescita - Risultato non sempre dettagliato : frequente valutazione della attività mediante l utilizzo dei soli valori di concentrazione corrispondenti ai breakpoints
Tests di antibiotico-sensibilità KB BD ETest Sistema automatizzato Semplicità +++ + +++ +++ Risultati S/I/R MIC MIC MIC Accuratezza + +++ ++ ++ Flessibilità +++ +++ +++ + Tempi + +++ + + Automazione + + + +++ Costo/test + + +++ +++
Interpretazione dei risultati: breakpoints I risultati ottenuti in vitro (endpoints) - diametri degli aloni di inibizione (Kirby-Bauer), valori di MIC (brodo/agar diluizione, E-test) - debbono essere interpretati mediante valutazione comparativa con valori soglia o breakpoints. I breakpoints vengono stabiliti, per ciascuna combinazione specie-antibiotico, da Comitati Nazionali od Internazionali quali CLSI ed EUCAST. Attraverso il confronto con i breakpoints, l endpoint può essere tradotto in una delle cosiddette categorie terapeutiche : S (sensibilità) I (sensibilità intermedia) R (resistenza) S I R bkp1 bkp2 I breakpoints sono fissati in funzione di un complesso insieme di parametri: microbiologici (es. distribuzione dei valori di MIC o degli aloni di inibizione dei ceppi selvaggi, cioè privi di meccanismi di resistenza acquisiti; cut-off epidemiologici, introdotti da EUCAST); farmacologici (es. dosaggio terapeutico del farmaco, concentrazioni sieriche ottenibili); clinici (es. studi di efficacia clinica per stabilire la correlazione tra risultati in vitro ed outcome clinico).
EUCAST breakpoints Brodo-diluizione Agar-diluzione Kirby-Bauer
Microdiluizione in brodo / E-test Interpretazione dei risultati
Categorie terapeutiche: definizioni Per un dato antibiotico, in accordo con le linee guida CLSI/EUCAST, un ceppo batterico verrà refertato quale sensibile, intermedio o resistente: Sensibile Il ceppo viene inibito nella crescita od ucciso da concentrazioni di antibiotico raggiungibili in vivo (sieriche, tessutali)*. Un infezione sostenuta da un ceppo batterico isolato può essere trattata appropriatamente con il dosaggio usuale dell antibiotico testato e raccomandato per il tipo di infezione clinica. Indica una elevata probabilità di successo terapeutico. Intermedio (a sensibilità intermedia) Il ceppo mostra una MIC borderline rispetto ai livelli raggiungibili in vivo (sierici e tessutali) di antibiotico* la cui efficacia potrebbe dunque essere minore di quella registrata per gli isolati sensibili. Tuttavia, questa categoria suggerisce l efficacia clinica nei siti corporei dove gli antibiotici sono fisiologicamente concentrati (chinolonici e -lattamici nelle urine) o quando l antibiotico può essere utilizzato a concentrazioni più alte di quelle normali in assenza di significativi effetti collaterali ( lattamici). Rappresenta una buffer zone (zona cuscinetto) che dovrebbe evitare/ridurre rilevanti errori interpretativi (falsa sensibilità) a seguito di errori di natura tecnica, soprattutto nel caso di molecole con un ristretto margine di farmacotossicità. Indica un effetto terapeutico incerto. Resistente Il ceppo non viene inibito/ucciso dalle concentrazioni sistemiche raggiunte in vivo (sieriche, tessutali) dall antibiotico*. Questa categoria predice una elevata probabilità di fallimento terapeutico. * a seguito di somministrazione di una dose terapeutica «usuale»
Interpretazione critica dell antibiogramma: Attività battericida E necessario considerare la attività battericida di un antibiotico, SOPRATTUTTO in questi casi particolari: infezioni gravi: osteomieliti, endocarditi, meningiti, polmoniti focolaio di infezione situato in distretti anatomici difficilmente accessibili all antibiotico Concentrazione Minima Battericida (MBC): la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di uccidere almeno il 99.9% (1 germe su 1.000 elude l azione antibiotica) delle cellule formanti la popolazione iniziale.