Standard di qualità nel laboratorio di seminologia e fecondazione in vitro. Biogenesi, Reproductive Medicine Centre, Istituti Clinici Zucchi, Monza

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1 Standard di qualità nel laboratorio di seminologia e fecondazione in vitro Giovanni Coticchio Biogenesi, Reproductive Medicine Centre, Istituti Clinici Zucchi, Monza Introduzione L identificazione e implementazione di standard di qualità per il laboratorio di embriologia e seminologia rispondono all esigenza di guidare gli embriologi nei loro compiti professionali. Essi rappresentano allo stesso tempo un supporto organizzativo per il rispetto di obblighi normativi locali, nazionali e internazionali e per l ottenimento di risultati in ultima analisi più favorevoli per le coppie infertili (Magli et al., 2008; Mortimer and Mortimer, 2005). Gli argomenti discussi nel presente scritto intendono illustrare aspetti importanti della struttura, organizzazione e funzione del laboratorio di embriologia e seminologia. La materia del total quality management non è descritta nei suoi specifici contenuti, ma sono forniti alcuni esempi dell utilità della sua applicazione. Layout del laboratorio Il laboratorio dovrebbe possedere localizzazione, dimensioni e design appropriati alla tipologia e volume del lavoro svolto. In particolare, esso dovrebbe essere strettamente adiacente alla sala operatoria per rendere più spedite ed efficienti le fasi di recupero degli oociti e transfer degli embrioni. Gli spazi del laboratorio di embriologia 1

2 dovrebbero essere separati dalle postazioni di lavoro informatiche, dagli ambienti dedicati alla crioconservazione, dal laboratorio di seminologia e da altri di laboratori (per esempio di ricerca). La collocazione della strumentazione e delle apparecchiature dovrebbe essere definita in modo da ridurre i percorsi attraverso cui il materiale biologico (oociti ed embrioni) viene trasferito dagli incubatori alle cappe/microscopi e viceversa. L accesso dovrebbe essere strettamente limitato al personale addetto. Analoga restrizione dovrebbe essere applicata per le aree di lavoro di crioconservazione e per quelle ospitanti le postazioni di accesso alle banche dati informatiche e cartacee. Le condizioni di temperatura e umidità dovrebbero essere controllate in modo da offrire sufficiente comfort agli operatori. Le postazioni di lavoro dovrebbero essere studiate secondo criteri ergonomici, tenendo anche conto della necessità di ridurre lo stress di tipo visivo. La qualità dell aria dovrebbe essere garantita da sistemi di filtrazione/purificazione seguendo criteri delle norme vigenti. Direzione del laboratorio Il laboratorio di PMA dovrebbe essere diretto da un biologo con esperienza pluriennale come embriologo clinico. Il possesso di titoli specifici (specializzazione, master, dottorato) sarebbe auspicabile, ma non vincolante. Al direttore di laboratorio spetta l organizzazione delle attività, la verifica che il setup del laboratorio sia adeguato alle funzioni richieste e al carico di lavoro in termini di attrezzature e risorse umane, la scelta delle tecniche di laboratorio più appropriate, la redazione e revisione del manuale di laboratorio, la pianificazione del training del personale di nuova acquisizione e dell educazione continua del personale già formato, l analisi dei risultati, l implementazione di un sistema di qualità, l interazione con lo staff clinico. 2

3 È richiesto che il direttore di laboratorio svolga il proprio ruolo a tempo pieno e in sede. È infatti indispensabile che la persona preposta abbia diretta e continua percezione dell ambiente di lavoro e dell attività dei colleghi. Ruoli direttivi a distanza o intermittenti sono difficilmente immaginabili. Personale La selezione, training, aggiornamento e motivazione del personale di laboratorio rivestono un importanza critica nella costituzione di una squadra di lavoro in grado di garantire uno standard di risultati elevato e costante. Ciò richiede l implementazione di misure di tipo organizzativo e tecnico. Lo staff biologico dovrebbe essere in numero adeguato e con appropriata formazione ed esperienza. Si calcola che un rapporto sufficiente tra embriologi e numero di cicli eseguiti sia circa 1:200. Ruoli, funzioni e livelli gerarchici dovrebbero essere descritti in un organigramma ufficiale e in specifiche job descriptions. Per funzioni critiche dovrebbero essere identificati titolari e sostituti. La formazione del personale di nuova acquisizione e preesistente dovrebbe essere curato attraverso documentati programmi di training e aggiornamento. Documentazione I processi a cui è sottoposto il materiale biologico dovrebbero essere descritti in un manuale delle istruzioni operative. Tale manuale dovrebbe essere reso disponibile agli operatori prima della sua applicazione ed essere accessibile in ogni momento. Esso 3

4 dovrebbe contenere una dettagliata descrizione dei metodi e dei materiali applicati per le diverse fasi di lavoro. Documentazione scritta dovrebbe essere generata anche per a) norme di comportamento riguardanti gli operatori (uso di divise, mascherine, cuffie; norme igieniche), b) prove, controlli, collaudi e manutenzione delle attrezzature, c) controllo della performance, d) azioni correttive, e) norme di sicurezza, f) movimentazione, conservazione e stoccaggio dei materiali, g) aggiornamento delle procedure. La documentazione dei risultati di laboratorio dovrebbe essere pertinente, significativa, chiara e preferibilmente conforme a standard internazionalmente riconosciuti. Norme generali per le istruzioni operative Preparazione dei campioni seminali. L obiettivo della preparazione dei campioni seminali consiste nella selezione degli spermatozoi con motilità rapida progressiva e normale morfologia (se presenti) e nella loro separazione dal plasma seminale. La preparazione standard del campione seminale dovrebbe basarsi sull applicazione di gradienti di densità i quali, oltre a separare la popolazione di spermatozoi di interesse, rimuovono o riducono fortemente la carica di agenti infettivi. La centrifugazione diretta del seme è sconsigliabile poiché tale trattamento potrebbe generare un danno agli spermatozoi per effetto di specie reattive dell ossigeno (ROS) rilasciate da spermatozoi immaturi o da globuli bianchi. Per tale ragione, lo swim-up da pellet centrifugato non dovrebbe essere applicato, mentre può essere consentito lo swim-up da seme non trattato, nonostante in tal caso 4

5 sia maggiore il rischio di contaminazione da plasma seminale e da eventuali agenti infettivi. Prelievo degli oociti. Al prelievo, gli oociti dovrebbero essere valutati rispetto allo stato di maturazione per selezionare, se necessario, quelli da destinare alla standard IVF. I dettagli morfologici dell oocita ancora incluso nel cumulo ooforo possono essere osservati attraverso la tecnica dello spreading. Talvolta, la presenza delle cellule del cumulo costituisce un impedimento all osservazione dell oocita. Tuttavia lo stato di compattezza o espansione delle stesse cellule del cumulo è spesso indicativo della maturità oocitaria. Coaguli di sangue di grandi dimensioni dovrebbero essere rimossi con l ausilio di aghi di siringhe da insulina, ma particolare attenzione dovrebbe essere prestata per evitare danni accidentali all oocita. Standard IVF. La standard IVF dovrebbe essere eseguita utilizzando una precisa concentrazione di spermatozoi mobili. Tale concentrazione non dovrebbe essere in eccesso rispetto alle oggettive necessità. Benché non siano noti studi sistematici sulla materia, si ritiene che concentrazioni di spermatozoi mobili per ml siano adeguate. ICSI. La ICSI è una prassi consolidata e ben definita. In breve, per la sua esecuzione si richiede che siano utilizzati spermatozoi mobili e, se possibile, con morfologia normale. È indispensabile manipolare gli spermatozoi in modo da interrompere la continuità della membrana cellulare e favorire il rilascio del contenuto cellulare 5

6 all interno dell oocita, successivamente alla microiniezione. La microiniezione dovrebbe essere eseguita in modo da evitare che l ago non sia inserito in una zona dell oocita in cui si ritiene possa essere presente il fuso meiotico. La deposizione dell spermatozoo dovrebbe essere preceduta da una aspirazione del citoplasma sufficiente a interrompere la continuità dell oolemma. Verifica della fecondazione (fertilization check). La verifica della fecondazione dovrebbe essere effettuata intorno alle 18 ore post inseminazione (p.i.) e comunque mai dopo le 20 ore p.i.. Di ciascun oocita inseminato dovrebbe essere registrato lo stato meiotico, il numero di pronuclei, il numero di globuli polari. In caso di mancata fecondazione dopo standard IVF, dovrebbe essere descritta la presenza o assenza di spermatozoi aderenti alla zona pellucida. In considerazione del fenomeno noto come in vitro aging gli oociti che appaiono non fecondati entro 20 ore p.i non dovrebbero essere sottoposti a reinseminazione. Mezzi di coltura. L uso di mezzi di coltura preparati in laboratorio non dovrebbe essere consentito, in presenza di alternative commercialmente disponibili. Per la coltura embrionale successiva al terzo giorno p.i. dovrebbero essere impiegati sistemi di coltura sequenziali. L uso di siero come supplemento proteico dovrebbe essere evitato, se possibile anche per i terreni per la maturazione in vitro degli oociti. Valutazione degli embrioni. 6

7 La valutazione della qualità embrionale dovrebbe essere effettuata a tempi definiti (per esempio a ore p.i.) e secondo criteri riproducibili condivisi dai membri del laboratorio. Identificazione e tracciabilità dei campioni biologici I campioni biologici dovrebbero essere identificati secondo criteri univoci e conformi alle norme vigenti. Benché talvolta raccomandato, non esiste consenso sulla necessità o opportunità di eseguire il doppio controllo (da parte di due operatori) dell identità dei campioni in fasi critiche del processo, quali l inseminazione o il transfer di embrioni. Durante tutto il processo, la localizzazione fisica dei campioni in spazi specifici del laboratorio deve essere regolamentata. Documentazione dell attività di laboratorio Ciascuna fase del processo di manipolazione e conservazione del materiale biologico dovrebbe essere descritta tecnicamente in maniera esauriente e pertinente. Orario di esecuzione e operatore dovrebbero essere riportati. Il destino di ciascun oocita, embrione e campione seminale dovrebbe essere documentato. Eventuali deviazioni dai protocolli prestabiliti dovrebbero essere registrate e motivate. Tutta la documentazione dovrebbe essere prodotta in forma cartacea e informatica. Il backup dei documenti informatici dovrebbe essere garantito da un sistema automatico. I referti di laboratorio dovrebbero essere in forma chiara e contenere informazioni pertinenti ed essere sottoposti ad accurato controllo e a convalida prima dell emissione. 7

8 Materiali Tutti i materiali (piastre di coltura, pipette, cateteri, etc) che possono entrare in contatto direttamente o indirettamente contatto con gameti ed embrioni dovrebbero essere non tossici e pertanto appartenere almeno alla categoria tissue culture grade. Se disponibili, dovrebbero essere preferiti articoli embryo tested. Eventuali (bio)chemicals dovrebbero essere di adeguata qualità e purezza. Di ogni lotto di materiale dovrebbe essere disponibile il certificato di analisi. Per materiali non testati per embriotossicità dovrebbero essere eseguito un accertamento di qualità. A tale scopo, potrebbero essere utilizzati il mouse embryo test e lo sperm survival test. Movimentazione, conservazione e stoccaggio dei materiali La corretta conservazione del materiale durante il trasporto e lo stoccaggio dovrebbe essere verificata. Le date di ricezione, preparazione (se applicabile) e utilizzo dovrebbero essere registrate. I numeri di lotto dei materiali utilizzati dovrebbero essere associati ai processi a cui sono sottoposti i campioni biologici. L uso di materiale scaduto dovrebbe essere evitato tramite l applicazione di appropriate misure preventive. Inoltre dovrebbero essere garantite scorte minime per ogni materiale. Attrezzature Le attrezzature dovrebbero essere appropriate al tipo e volume di attività. In particolare, gli incubatori per la coltura di embrioni dovrebbero essere in numero 8

9 superiore rispetto alle effettive esigenze e in ogni caso in numero superiore a uno. Per apparecchiature di importanza critica sarebbe auspicabile l impiego di sistemi di allarme in grado di inviare informazioni a terminali informatici o telefoni cellulari. Le bombole di CO 2 o di miscele gassose dovrebbero essere poste in ambiente diverso dal laboratorio. Le cappe per la manipolazione di materiale biologico dovrebbero rispondere ai requisiti normativi. Le sostanze tossiche, quali fissativi, dovrebbero essere utilizzate solo in associazione con cappe chimiche poste in ambiente diverso dal laboratorio di embriologia. Inoltre, per mantenere la temperatura ideale di coltura di oociti ed embrioni, il laboratorio dovrebbe essere dotato di una serie di dispositivi, quali piani riscaldati per microscopi e piani di lavoro, blocchi porta-provette, miniincubatori da utilizzare sui piani delle cappe, etc. Prove, controlli e collaudi delle attrezzature Le attrezzature dovrebbero essere accompagnate dai relativi manuali originali. Di ogni attrezzatura dovrebbe essere previsto un programma documentato di manutenzione ordinaria e straordinaria, un resoconto del suo utilizzo e, se previsto, delle calibrazioni. Controlli giornalieri dovrebbero essere eseguiti per apparecchiature critiche, quali incubatori (per temperatura di esercizio e concentrazione di CO 2 ), frigoriferi e freezers (per temperature di esercizio), cryofreezers (per le curve di raffreddamento) e banche per la crioconservazione a -196 C (per livelli di azoto). Analisi non strumentali 9

10 Per le analisi non strumentali è necessario stabilire l accuratezza e la ripetibilità intere intra-operatore. Ciò è applicabile all analisi seminale (per i valori di conta, gradi di motilità, morfologia), la valutazione della qualità oocitaria, del pattern cromatinico dei pronuclei e della qualità embrionale. È auspicabile la partecipazione del personale di laboratorio a programmi esterni di qualità assurance (QA). Inoltre, per garantire l affidabilità degli accertamenti analitici non strumentali, sarebbe opportuno che ciascun operatore eseguisse un numero minimo di operazioni. Indicatori di efficienza I programmi di QA forniscono uno strumento per monitorare i processi al fine di migliorare l efficacia di una procedura. In tal senso è essenziale valutare con regolarità i risultati del laboratorio attraverso indicatori appropriati e oggettivi, definendo allo stesso tempo valori soglia minimi. Per ridurre interferenze dovute a variabilità nella popolazione dei pazienti, tali verifiche dovrebbero essere compiute su categorie sufficientemente grandi in termini numerici. L elenco sotto riportato indica alcuni possibili indicatori di efficienza (esprimibili in valori percentuali). - oociti degenerati dopo rimozione delle cellule del cumulo, in preparazione della ICSI - fecondazione IVF ed ICSI - oociti degenerati dopo ICSI - segmentazione (cleavage rate) - embrioni con 4 blastomeri a ore p.i. - blastulazione 10

11 - blastocisti di buona/ottima qualità - embrioni e oociti vitali dopo crioconservazione - impianto - gravidanze Safety La sicurezza rappresenta un elemento essenziale degli standard qualitativi dei laboratori di embriologia e seminologia. È necessario che sia nominato un responsabile per la sicurezza, che esistano protocolli scritti, che siano predisposti documentazione e training sui rischi operativi generali e specifici. Prima del trattamento del campione biologico è necessaria la verifica degli esami infettivologici dei pazienti. Devono essere approntati dispositivi di protezione da contaminazione da fluidi biologici. L uso di pipet-aid automatici dovrebbe essere garantito. Le cappe dovrebbero garantire la possibilità di lavorare in condizioni asettiche ma anche proteggere l operatore (Classe II). Le immunizzazioni contro infezioni virali dovrebbero essere incoraggiate. L uso di sostanze tossiche dovrebbe essere accompagnato da attrezzature e dispositivi di protezione. Dispositivi di protezione personale sono richiesti anche per l uso di azoto liquido. La decontaminazione chimica e biologica, se necessaria, dovrebbe essere condotta secondo specifici protocolli. Il rischio biologico deriva principalmente dalla contaminazione dei campioni da HIV, HBV, HCV. Tutti i campioni dovrebbero essere trattati come potenzialmente infetti. La conservazione e consumo di alimenti dovrebbero essere proibiti. Il personale dovrebbe essere dotato di divise, occhiali di protezione, guanti 11

12 (powder-free), etc. Attenzione dovrebbe essere posta alla contaminazione di oggetti di comune utilizzo, quali telefoni e tastiere di PC. Il rischio di ferite accidentali con materiali acuminati contaminati da seme e di contatto tra seme e abrasioni, piccole lesioni cutanee, etc. dovrebbe essere prevenuto. Materiali costituenti rischio biologico e materiali acuminati (sharps) contaminati dovrebbero essere smaltiti secondo speciali procedure. Le procedure di crioconservazione espongo a rischi di ustioni da contatto diretto con azoto liquido, possibili danni oculari da esposizione a gas e asfissia. Per garantire la sicurezza, è pertanto necessario disporre di locali dedicati, dispositivi di protezione personale (quali occhiali/schermi per la protezione del viso, guanti isolanti) e strumenti per la manipolazione di oggetti raffreddati in azoto liquido. Dovrebbe inoltre essere garantito un elevato ricambio d aria e la presenza di sistemi di monitoraggio della concentrazione di ossigeno ambientale. Specificità del laboratorio di seminologia La definizione e attuazione di standard di qualità riguardano anche il laboratorio di seminologia. L attività di questo laboratorio, infatti, è critica per risultati aventi un significato sia diagnostico, sia terapeutico. La ricerca di uno standard di qualità per il laboratorio di seminologia è resa difficile dalla complessità delle analisi eseguite sul liquido seminale. Tale complessità non è di carattere tecnico, ma piuttosto deriva dalla natura altamente pleiotropica degli spermatozoi umani e dal fatto che gli attuali metodi analitici generano ampie differenze valutative tra diversi laboratori e diversi operatori dello stesso laboratorio. L assenza di automazione enfatizza l impatto dell errore umano nella conta e nell analisi della morfologia e della motilità. I metodi 12

13 di valutazione, per esempio della morfologia, sono molteplici e spesso non sono riferibili ad adeguati campioni standard di riferimento. Inoltre, non bisogna dimenticare che l analisi seminale è effettuata su una minuscola sub-popolazione dell intero campione. Pertanto, la qualità dell esito scade con la riduzione del numero degli spermatozoi analizzati. Per esempio, valutazioni morfologiche eseguite su spermatozoi rivestono scarso valore. In passato, le resistenze all introduzione di criteri di qualità sono state notevoli. Ciò si percepisce da posizioni prese ufficialmente da alcuni autori: it would appear that semen analysis is for the most part carried out satisfactority all over the world and therefore the energy exspended for running a QA program in relation to semen analysis could be a waste of time (Jequier, 1997). Più recentemente, però, l esigenza di programmi in grado di elevare lo standard qualitativo del laboratorio di seminologia è emersa più decisamente: QC and QA are firmly embedded in ISObased quality systems and are requirements of regional, national and EC legislations (Pacey, 2010). Un esempio della necessità di standard qualitativi è offerto dai risultati di un survey eseguito per determinare, in diversi laboratori, la variabilità di misurazione della concentrazione degli spermatozoi. È emerso che, per un campione di riferimento, il risultato possa variare fino a un fattore 5 e che la variazione risulti maggiore nel caso in cui il dispositivo di misurazione sia diverso dalla camera di Neubauer (Pacey, 2010). Gli errori che conducono a differenze, talvolta notevoli, nei risultati posso essere di diversa natura. Esistono errori definiti random, consistenti in differenze casuali e in genere di segno diverso che sono introdotte nelle operazioni di campionamento e/o lettura. Tali errori sono apprezzabili attraverso letture ripetute da parte dello stesso osservatore o strumento. Altri errori, indicati come sistematici, alterano il risultato 13

14 in una sola direzione e non possono essere identificati attraverso letture ripetute. La ricerca di standard qualitativi eseguita attraverso programmi di qualità control (QC) dovrebbe essere in grado di identificare, e se possibile limitare, sia gli errori random, sia gli errori. Un QC interno dovrebbe essere in grado di stimare la precisione delle misurazioni e rilevare eventualmente risultati esterni ai limiti di controllo. A tale scopo sono necessari dei campioni standard. Sul mercato sono disponibili campioni che garantiscono accuratezza e precisione, seppur in un intervallo limitato. I campioni che possono essere preparati in laboratorio hanno il vantaggio di coprire un più ampio intervallo di grandezze, ma implicano il limite della non conoscenza del valore target reale. In ogni caso, per la misurazione di un certo parametro, con metodi statistici è possibile controllare la variabilità intra- e inter-operatore. Per esempio le X bar charts consentono di identificare risultati molto divergenti dal target value. Rispetto a quest ultimo, possono essere definiti livelli di attenzione e di azione per misure correttive (WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, 2010). L utilità di un programma di controllo qualità è dimostrata da uno studio eseguito per valutare la coerenza dei valori di morfologia tra 19 tecnici di centri diversi durante un periodo di 40 mesi. Lo studio ha previsto una fase di training iniziale per tutti i tecnici allo scopo di uniformare le modalità di analisi. Per circa un quarto dei tecnici è stato inoltre condotto un refresh course annuale. I risultati hanno indicato che 15 dei 19 tecnici (78%) hanno riportato letture con limiti di errore entro un intervallo di 0.5±SD. Inoltre, i partecipanti ai refresh courses hanno riportato letture con limiti di errore entro un intervallo di 0.2±SD (Franken and Kruger, 2006). In merito alla valutazione della morfologia, la recente indicazione delle manuale WHO 2010, secondo cui il valore minimo di forme normali è pari al 4%, ha introdotto una 14

15 considerevole difficoltà per l implementazione di programmi di QC e QA. Essendo infatti il valore minimo di normalità molto vicino a 0, deriva che analisi basate sulla conta di meno di 100 spermatozoi producono dati con intervalli di confidenza talmente ampi da rendere non significativa l identificazione di campioni con valori di morfologia maggiore o minore del 4%. Conclusioni Elevati standard qualitativi rappresentano ormai requisiti organizzativi, tecnici e normativi indispensabili per i laboratori di embriologia e seminologia. Il miglioramento della qualità dovrebbe coinvolgere tutti i principali elementi strutturali, gestionali e operativi del laboratorio, quali dotazioni impiantistiche, security, organico, procedure, documentazione, indicatori di efficacia, attrezzature, materiali e safety. Anche se in evoluzione, la cultura del QC/QA non sembra però essere ancora del tutto acquisita, nonostante sia appurato che le eventuale variabilità delle performance possono essere monitorate e corrette. Allo scopo di favorire il progresso dell intera attività del laboratorio, i programmi di training ed educazione continua sono essenziali. Bibliografia Franken DR, Kruger TF. Lessons learned from a sperm morphology quality control programme. Andrologia :

16 Jequier AM. Clinical assessment of male infertility in the era of intracytoplasmic sperm injection. Baillieres Clin Obstet Gynaecol : Magli MC, Van den Abbeel E, Lundin K, Royere D, Van der Elst J, Gianaroli L; Committee of the Special Interest Group on Embryology. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories. Hum Reprod : Mortimer D, Mortimer S. Quality and risk management in the IVF laboratory. Cambridge University Press Cambridge, UK. Pacey AA. Quality assurance and quality control in the laboratory andrology. Asian J Androl :21-5. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen FIFTH EDITION. World Health Organization