Strategie diagnostiche del laboratorio di Area Vasta Romagna. Maria Federica Pedna U.O. Microbiologia AVR Pievesestina Cesena

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1 Strategie diagnostiche del laboratorio di Area Vasta Romagna per l identificazione l dei germi multiresistenti Maria Federica Pedna AVR Pievesestina Cesena

2 Resistenze gram-negativi Fenomeno della multiresistenza nei batteri gram-negativi: Enterobacteriacee: 50% di tutti i batteri nei campioni clinici Diffusi nell ambiente e sono uno dei componenti principali della flora intestinale umana Ruolo predominante nelle infezioni ospedaliere Aumento delle resistenze a vari antibiotici legata all impiego clinico di questi farmaci (pressione selettiva).

3 Resistenze gram-negativi β-lattamasi principale meccanismo di resistenza soprattutto nelle Enterobacteriacee per antibiotici β-lattamici (farmaci di larghissimo impiego) Oltre 400 tipi β-lattamasi a codifica cromosomica (resistenza naturale) β-lattamasi acquisite per trasferimento genico attraverso plasmidi(resistenza acquisita) 2 classificazioni funzionale classi principali da 1 a 4 (caratteristiche biochimiche, capacità di idrolisi, inibitori) molecolare(omologia sequenze aminoacidiche) classi A,C,D caratterizzate da un residuo di serina nel sito attivo essenziale per l attività idrolitica (serino-β-lattamasi), sono inibite da ac.clavulanico, tazobactam e ac.fenilboronico); classe B caratterizzate dalla presenza di metalli (Zn++) per l attività catalitica (metallo-βlattamasi ), vegono inibite da EDTA e ac.dipicolinico

4 Inibitori di β-lattamasi ESBL AmpC KPC MBL Acido clavulanico Ac. fenilboronico Cloxacillina Ac. aminofenilboronico Ac. etilen-diamino-tetracetico (EDTA) Ac. dipicolinico

5 Anno immissione β-lattamici in commercio (penicilline, β-lattamico + inibitore β-lattamasi, cefalosporine, cefamicine, carbapenemi) Anno isolamento β-lattamasi cromosomiche-plasmidiche 1941 Penicillina G P TEM-1 β-lattam. a largo spettro Atene Grecia 1982 Sme-1 carb. classe A London H UK 1983 ESBL SHV-2 Germania 1984 IMI-1 carb. classe A California USA 1987 IRT β-latt. Spagna 1989 ESBL CTX-M-1 Germania e Francia 1988 AmpC MIR-1plas Massachusetts USA Ampicillina P Carbenicillina P Cefalexina C Cefazolina C Amoxicillina P Ticarcillina P Cefoxitina Ce 1977 Cefuroxima C Mezlocillina P Cefaclor C Cefotaxime C Piperacillina P Amoxicillina+Clavulanato P Ceftriaxone C Ceftazidime C Cefotetan Ce 1985 Imipenem Ca 1985 Ticarcillina+Clavulanato P Ampicillina+Sulfbactam P Cefpodoxime C Piperacillina+Tazobactam P Cefepime C Meropenem Ca 2001 Ertapenem Ca 2007 Doripenem Ca 1 o 1 o 1 o 1 o 1 o AmpC, SHV1 e K1 β-lattam. cromosomiche 1970 SHV-1 β-lattam. a largo spettro 1985 ESBL TEM-3 Francia 1990 NMC carb. classe A Parigi Francia 1993 IMP-1 MBL Singapore 2001 KPC-1 carbapen. North Carolina USA

6 Carbapenemi Imipenem 1985 Ampio spettro d azione e notevole resistenza all azione idrolitica da parte delle beta-lattamasi, azione battericida rapida dovuta all attraversamento veloce delle porine D2 della parete batterica Meropenem 1996 Carbapenemico semisintetico con maggiore stabilità rispetto all imipenem

7 Enterobatteri produttori di CARBAPENEMASI (CPE) Le carbapenemasi di classe A idrolizzano con diversa intensità tutti gli antibiotici b-lattamici e sono attualmente rappresentate dalle classi NmcA, Sme, IMI, SFC, GES, KPC. I loro geni sono cromosomici o localizzati su una importante varietà di plasmidi, ma in ogni caso associati a trasposoni Le carbapenemasi di classe B o metallo-b-lattamasi lattamasi idrolizzano tutti gli antibiotici b-lattamici ad accezione dell aztreonam. Sono state individuate le classi IMP, VIM, GIM, KHM e NDM. I geni delle MBL sono spesso plasmidici associati ad integroni e trasposoni. La carbapenemasi di classe D, D idrolizza molto più fortemente i carbapenemi mentre non idrolizza le cefalosporine di 3 a generazione. Attualmente quella maggiormente isolata è OXA-48. Il gene OXA-48 è localizzato su un trasposone e la sua riserva naturale è stata identificata in Shewanella sp.

8 Mechanisms of Carbapenem Resistance Carbapenemase hydrolyzing enzymes Porin loss OprD ESBL or AmpC + porin loss

9 Acquired carbapenemases in Gram-negative pathogens Enzyme family Class Pathogens Serine-β-lact. Serine-β-lact. A D Enterobacteriaceae P. aeruginosa Acinetobacter Enterobacteriaceae Metallo-β-lact. B Pseudomonas Acinetobacter Enterobacteriaceae Le carbapenemasi clinicamente più importanti sono attualmente: KPC, metallo β-lattamasi (IMP, VIM, NDM) e OXA48.

10 Diffusione di Enterobatteri CPE La diffusione mondiale di Enterobacteriaceae carbapenemasi positive (CPE) rappresenta una grave minaccia per la salute pubblica. Necessari notevoli sforzi per garantire l'individuazione tempestiva e accurata e per l'attuazione di strategie efficaci di controllo delle infezioni. Dovrebbero essere implementate a livello mondiale procedure di screening per i «pazienti a rischio» per prevenire l'ulteriore sviluppo di infezioni causate da batteri multi-resistenti o pan- resistenti in ospedale

11 Situazione europea della diffusione di enterobatteri produttori di carbapenemasi (gennaio 2012) R. Canton et al. 2012

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13 Perchéèimportante diagnosticare correttamente la presenza di ceppi produttori di carbapenemasi? Difficoltà nella scelta della terapia corretta Monitoraggio epidemiologico di questi ceppi per il controllo della loro diffusione

14 Quando sospettare enterobatteri produttori di carbapenemasi? EUCAST propone, anche per gli enterobatteri nei confronti dei carbapenemi come per le altre combinazioni microrganismo/antibiotico, il concetto di valori epidemiologici cut-off (ECOFF), che definiscono l estremità superiore della distribuzione del wild-type; microrganismi con valori di MIC superiori all ECOFF hanno verosimilmente acquisito qualche meccanismo di resistenza.

15 In questa versione del documento viene raccomandato di seguire le indicazioni fornite dal Comitato di Studio degli Antimicrobici dell AMCLI (CoSA) che consigliano di sottoporre a conferma fenotipica i ceppi di enterobatteri cheabbiano una MIC >0,5 μg/ml per meropenem (più specifico rispetto agli altri carbapenemi)

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18 Algoritmo per l identificazione fenotipica e la refertazione degli enterobatteri produttori di carbapenemasi

19 Programmi di sorveglianza attiva finalizzati a prevenire la diffusione di ceppi di Enterobatteri produttori di carbapenemasi Screening per individuare i pazienti colonizzati effettuato mediante esame colturale di un campione prelevato con tampone rettale. La selezione dei pazienti da sottoporre a tale screening cosìcome la sua frequenza possono variare a seconda del programma di sorveglianza adottato, in funzione dei diversi contesti epidemiologici e organizzativi locali.

20 Screening per ricerca enterobatteri CPE Semina diretta su terreni cromogeni Vantaggi:lettura risultati dopo h, facile riconoscimento delle colonie sospette, identificazione presuntiva di specie Limiti:costi elevati, sensibilitàe specificitàda valutare in base al terreno utilizzato CPE+ Semina diretta su mcconkey (o altro terreno per gram-negativi) Semina diretta con su dischetto mcconkey di (o meropenem altro terreno Vantaggi:lettura selettivo per risultati gram-negativi) dopo con h, dischetto facile di riconoscimento delle colonie meropenem sospette Limiti: metodica più indaginosa, sensibilità più ridotta in pz. colonizzati in bassa carica CPE-

21 Emerging Infectious Diseases Vol. 18, No. 9, September 2012

22 Quali test utilizzare per la conferma fenotipica? Test di sinergia con acido boronico Test di sinergia con EDTA o acido dipicolinico Test di Hodge (variamente modificato) E-test per MBL

23 Sinergia mediante combinazione su dischetto Il ceppo potenzialmente produttore di carbapenemasi viene testato nei confronti del carbapenemico (meropenem) in presenza di inibitori, ad es. acido dipicolinico per le metallo-betalattamasi (MBL) e acido boronico per le KPC. Vantaggi: di facile esecuzione, consente la rilevazione e caratterizzazione fenotipica delle carbapenemasi di tipo KPC e MBL. Limiti: non consente il riconoscimento della produzione di carbapenemasi di tipo OXA (altrimenti individuabili accertando un fenotipo di resistenza alla temocillina).

24 Sinergia mediante combinazione su dischetto KPC+ MBL+ NEG

25 Test di Hodge modificato Si basa sulla dispersione delle carbapenemasi dal microrganismo produttore nel mezzo circostante e sulla sua capacità di proteggere i ceppi sensibili presenti sulla stessa piastra. Vantaggi: di facile esecuzione, economico, non richiede dispositivi o reagenti particolari, consente di riconoscere la produzione di tutti i tipi di carbapenemasi incluse quelle di tipo OXA. Limiti: è un test relativamente aspecifico non permettendo, ad esempio la distinzione fra carbapenemasi di classe A e B; necessita di un certo grado di esperienza per l interpretazione affidabile dei risultati; può comportare il rischio di risultati di falsa positività (ceppi iperproduttori di AmpC o ESBL) o di falsa negatività (ceppi produttori di MBL)

26 Hodge Test modificato per carbapenemasi Ceppo test Streak each test isolate from disk to edge of plate Ceppo indicatore Inoculate MH agar with a 1:10 dilution of a 0.5 McFarland suspension of E. coliatcc and streak for confluent growth using a swab. Disco Place 10-µg imipenem disk in center Lettura Isolate A is a KPC producer and positive by the modified Hodge test. Anderson KF et al. JCM 2007 Aug;45(8): modificato

27 E-test per conferma fenotipica MBL IP IP/IPI > 8 Phantom zone Etest IPI = IP + EDTA

28 Tutti i ceppi sospettati di produrre carbapenemasi devono essere confermati.

29 Refertazione enterobatteri CPE

30 Test di associazione tra antibiotici 1 piastra: sospensione 0.5 McFarland diluita1:10 s u MH Agar Dopo 24 h leggere le MIC di ogni antibiotico Preparare una seconda piastra con le stesse modalità della prima. Per ogni associazione da testare applicare sull'agar della piastra la striscia dell E-Test con la MIC più alta. Marcare sul retro della piastra l esatta posizione della prima striscia con una linea lungo i bordi, la cima e il fondo nonché l esatta posizione della MIC 32 mg/ml Lasciare la piastra sul banco per un ora poi rimuovere la prima striscia Applicare la seconda striscia dell'associazione in modo che la posizione della sua MIC = 32 mg/ml corrisponda esattamente alla posizione della MIC = 32 mg/ml della prima striscia, incubare Dopo 24 h leggere accuratamente i valori delle MIC del secondo antibiotico applicato sull'agar e confrontarli con quelli ottenuti il giorno precedente per l'interpretazione del test

31 Refertazione test di associazione tra antibiotici Sinergia La MIC in associazione dell'antibiotico più attivo è due o più diluizioni più bassa della MIC dello stesso antibiotico (il piùattivo) testato singolarmente. Es. MIC A = 8, MIC B = 16 (A èil piùattivo), MIC AB = 2 (diminuzione di due diluizioni). Antagonismo La MIC in associazione dell'antibiotico più attivo è due o più diluizioni più alta della MIC dello stesso antibiotico (il piùattivo) testato singolarmente. Es. MIC A = 4, MIC B = 16 (A èil piùattivo), MIC AB = 16 (aumento di due diluizioni). Indifferenza La MIC in associazione dell'antibiotico piùattivo è+1 diluizione della MIC dello stesso antibiotico (il piùattivo) testato singolarmente Es. MIC A = 1, MIC B = 2 (A èpiùattivo), MIC AB = 1 (nessuna variazione).

32 Per potere battericida si intende la diluizione del siero che uccide il 99,9% dei batteri dell inoculo iniziale (nessuna crescita sulle piastre di sub-coltura). National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methodology for the Serum Bactericidal Test, NCCLS Document M21-P,Vol. 7, No. 1, 1987

33 N pazienti positivi per enterobatteri CPE per azienda Area Vasta Romagna 2012

34 Enterobatteri CPE da isolati clinici e screening rettali Area Vasta Romagna 2012

35 Materiali da cui sono stati isolati enterobatteri CPE Area Vasta Romagna 2012

36 Tipi di enterobatteri CPE isolati Area Vasta Romagna 2012 * Isolamenti di ceppi diversi dallo stesso paziente

37 N screening MDR pervenuti su t.rettalee % di pz. positivi Area Vasta Romagna 2012

38 Un ringraziamento particolare a tutta l equipe di Microbiologia