proprietà immunoregolatorie delle Cellule Staminali Mesenchimali

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1 Università Politecnica delle Marche - Facoltà di Medicina e Chirurgia Scuola di Dottorato in Biotecnologie Biomediche Caratterizzazione fenotipica, molecolare e proprietà immunoregolatorie delle Cellule Staminali Mesenchimali Tesi di Dottorato di: Giulia Maurizi Relatore: Chiar.mo Prof. Pietro Leoni Correlatore: Dott.ssa Antonella Poloni X Ciclo Triennio 2009/2011

2 Con tanto affetto alla mia famiglia e a Luca

3 Ringraziamenti I miei ringraziamenti vanno per primi al Prof. Leoni ed all AIL per aver reso possibile la mia presenza nel laboratorio di Ematologia dell Università Politecnica delle Marche e la realizzazione di questo studio. Un enorme grazie e tanto affetto alla mitica Dott.ssa Poloni per avermi seguita con cura durante questi tre bellissimi anni di lavoro, che si sono concretizzati con mio grande orgoglio in pubblicazioni scientifiche. Ho cercato veramente di apprendere e mettere in pratica il più possibile! Al mio amato laboratorio, dove ho trascorso tante ore in solitudine, ma sicuramente molte di più in allegria! Grazie a tutte le persone che con semplicità mi hanno dato una mano e preziosissimi consigli.

4 Indice Sommario I Introduzione 1 1 Le cellule staminali Le cellule staminali embrionali Le cellule staminali adulte Le cellule staminali mesenchimali Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo 10 2 Fonti alternative di cellule staminali mesenchimali Cellule staminali mesenchimali nel sangue del cordone ombelicale Cellule staminali mesenchimali nel liquido amniotico e nei villi coriali La componente stroma-vascolare del tessuto adiposo 16 3 Potenziali utilizzi clinici delle cellule staminali mesenchimali Terapia cellulare Rigenerazione ossea Rigenerazione cartilaginea Rigenerazione tendinea, muscolare cardiaca e muscolare scheletrica Rigenerazione di tessuti nervosi 21 Scopo della tesi 22 Materiali e Metodi 25 1 Colture cellulari Isolamento e coltura cellulare di MSCs da midollo osseo Isolamento e coltura cellulare di cellule staminali mesenchimali da amniociti e villociti 25 2 Preparazione di siero umano allogenico 26

5 3 Preparazione di lisato piastrinico allogenico 26 4 Analisi immunofenotipica 27 5 Capacità di differenziazione multilineare delle MSCs fetali e da midollo osseo Differenziazione adipogenica Differenziazione osteogenica Differenziazione condrogenica 29 6 Analisi di espressione di geni di staminalità e di differenziazione multilineare in RT-PCR 30 7 Analisi della lunghezza dei telomeri 31 8 Analisi dell attività della telomerasi in Real Time PCR 31 9 Analisi dell espressione htert, c-myc e p53 in Real Time PCR Analisi delle citochine secrete Co-coltura di cellule fetali e linfociti allogenici Esperimenti in Transwell Colture in soft agar Analisi del cariotipo Analisi statistica dei dati 36 Risultati 37 1 Espansione in vitro e caratterizzazione cellulare Espansione in vitro in sistemi umanizzati di coltura Analisi immunofenotipica Capacità differenziativa multilineare delle MSCs Profili di espressione di geni di staminalità embrionali Profili di espressione di geni immunoregolatori Analisi quantitativa delle citochine secrete dalle MSCs fetali e da midollo 46

6 1.7 Capacità immunoregolatorie delle MSCs fetali e da midollo 48 2 Le MSCs fetali e midollari non sono suscettibili a trasformazioni maligne dopo espansione in vitro a lungo termine Soft agar assay Lunghezza dei telomeri, attività telomerasica ed espressione genica di htert, c- myc e p53 nelle MSCs fetali e da midollo Analisi del cariotipo 53 Discussione 54 Bibliografia 60

7 Sommario Le cellule staminali mesenchimali (Mesenchymal Stem Cells, MSCs) sono una popolazione con elevata capacità proliferativa e con potenziale di differenziazione multilineare; rappresentano, quindi, delle buone candidate per la terapia cellulare e la medicina rigenerativa. In questo studio sono state valutate MSCs fetali isolate da villi coriali (Chorionic Villi, CV) e da liquido amniotico (Amniotic Fluid, AF), confrontandole con le MSCs ottenute da midollo osseo (Bone Marrow, BM), per la capacità di crescita in presenza di siero umano allogenico (human serum, HS) o di lisato piastrinico (platelet lysate, PL), per le caratteristiche immunofenotipiche, il profilo di espressione citochinico e l attività immunoregolatoria su linfociti allogenici stimolati e sottopopolazioni immunoselezionate. Data l elevata potenzialità di espansione delle MSCs fetali, le cellule studiate sono state valutate per la loro stabilità replicativa tramite lo studio della lunghezza dei telomeri, l attività dell enzima telomerasi, l espressione dei geni htert, c-myc e p53 e l analisi del cariotipo. Una popolazione omogenea di cellule fibroblastoidi positiva ai tipici marcatori di superficie mesenchimali è stata isolata da tutti i campioni di CV ed AF analizzati. Le cellule di CV espandono rapidamente in HS (20 raddoppiamenti di popolazione, PDs, in 59 giorni e 6 passaggi di coltura), mentre in siero animale (fetal bovine serum, FBS) raggiungono 27 PDs in 65 giorni e 7 passaggi. Il PL determina un espansione nel 60% dei campioni CV, comunque minore rispetto a quella in HS. I campioni di AF espandono, invece, 40 PDs in 90 giorni, ma solo nel 20% dei campioni analizzati, non proliferano in PL, mentre in FBS espandono 28.5 PDs in 66 giorni. Le cellule fetali studiate inibiscono la proliferazione di linfociti allogenici stimolati e regolano la crescita anche di popolazioni linfocitarie selezionate CD4+ e CD8+. I

8 Nonostante il loro elevato potenziale di espansione, le MSCs fetali studiate hanno mostrato una lunghezza stabile dei telomeri durante la cultura a lungo termine, assenza dell attività telomerasica, nessuna espressione di htert, livelli costanti di espressione di c-myc e p53 e nessuna anomalia cromosomica. In conclusione, i risultati mostrano che i CV rappresentano un ottima fonte di MSCs con proprietà immunoregolatorie, capace di espandere in un sistema di proliferazione umanizzato a lungo termine senza alterazioni genetiche. In più del 90% dei campioni di CV analizzati si ottiene un espansione su larga scala in presenza di siero umano, incoraggiante per potenziali applicazioni cliniche. II

9 Introduzione Introduzione 1. Le cellule staminali Le cellule staminali si definiscono come precursori cellulari immaturi dotati della capacità di auto-rinnovamento (self-renewal) e della grande potenzialità di differenziazione multilineare. Il pionieristico lavoro di Till e McCullough (1961) (1) sulle cellule staminali emopoietiche del topo ha costituito senza dubbio la base di partenza per tutte le successive strategie di ricerca sulle cellule staminali. Questo lavoro, infatti, indicò i paradigmi concettuali che ancora oggi la comunità scientifica impiega per progettare ricerche ed applicazioni cliniche. Si deve quindi alla grande tradizione degli studi ematologici (Little e Storb, 2002) (2) l aver indicato la strada che ha portato all attuale enorme interesse per un possibile impiego terapeutico delle cellule staminali nella cura di un vasto spettro di patologie sulla base delle straordinarie potenzialità differenziative delle cellule staminali (Henningson et al., 2003) (3) isolate da adulto, da cordone ombelicale, da feto, da gonadi fetali (cellule embrionali germinali, EG) e dall embrione preimpianto (cellule staminali embrionali, ES). Le cellule staminali somatiche (non embrionali) già assicurano alcune importanti applicazioni per il trattamento di leucemie, dei grandi ustionati e della degenerazione della retina. Per la medicina rigenerativa del futuro sarà determinante lo sviluppo di strategie tese all ottenimento di grandi quantità di cellule staminali da impiegarsi nella pratica clinica. Difficoltà di tipo tecnico (per il prelievo e per l espansione in coltura) per le staminali somatiche e di tipo tecnico ed etico per le ES e le EG costituiscono però dei limiti ad un più vasto impiego terapeutico delle cellule staminali. Attraverso una divisione cellulare asimmetrica definita mitosi bivalente, la cellula staminale dà origine a due cellule figlie, di cui una identica a se stessa, scarsamente - 1 -

10 Introduzione proliferante ed in grado di mantenere invariato il pool di cellule staminali di quel tessuto, l altra con capacità proliferativa e di maturazione progressiva verso cellule fenotipicamente e funzionalmente sempre più specializzate. Con questa divisione asimmetrica viene mantenuto inalterato il numero di cellule staminali, mentre le cellule maggiormente commissionate, dividendosi ulteriormente, daranno origine ad un numero rilevante di cellule mature che compongono i tessuti (4). In base alle loro potenzialità differenziative, le cellule staminali sono classicamente suddivise in: Cellule Staminali Totipotenti: cellule staminali in grado di differenziare in ogni tessuto embrionale ed extraembrionale. Queste cellule derivano da embrioni allo stadio di 4-8 cellule, dopo 1-3 giorni dalla fecondazione; Cellule Staminali Pluripotenti: cellule embrionali allo stadio di blastocisti, dopo 4-14 giorni dalla fecondazione. Queste cellule sono capaci di differenziare in tessuti di origine embrionale organizzati nei tre diversi foglietti germinali (ectoderma, mesoderma ed endoderma); Cellule Staminali Germinali: sono cellule staminali pluripotenti (cellule riproduttive progenitrici). Nell embrione post-impianto e poi nel feto sono ancora molte le cellule staminali presenti, anche se difficile è il loro isolamento. Queste cellule rappresentano lo stadio di differenziamento che precede la formazione delle gonadi e compaiono nell embrione di topo e umano, alla 1 e 3 settimana di sviluppo, rispettivamente. Se isolate, queste cellule sono in grado, come le cellule staminali embrionali, di replicarsi illimitatamente in vitro mantenendo capacità differenziative pluripotenti. Cellule Staminali Multipotenti: sono cellule che hanno la capacità di moltiplicarsi e di mantenersi in coltura, ma non quella di rinnovarsi in modo - 2 -

11 Introduzione illimitato. Differenziano in tessuti diversi ma appartenenti allo stesso foglietto embrionale. Appartengono a tale categoria le cellule staminali adulte. Cellule Staminali Unipotenti: presenti nei tessuti adulti, potenzialmente più limitate nonché organo-specifiche, sono in grado di auto-rinnovarsi e di differenziare nel tipo cellulare del tessuto di appartenenza, assicurandone la riparazione ed il mantenimento. La multipotenzialità dei compartimenti rigenerativi intratissutali viene conservata nell individuo adulto dalle cellule staminali adulte con un potenziale di staminalità che assicura il rinnovamento dei vari tessuti specializzati. 1.1 Le cellule staminali embrionali Al termine dello sviluppo embrionale preimpianto la blastocisti risulta composta da due principali linee cellulari: le cellule più esterne del trofoectoderma, da cui origineranno gli annessi extraembrionali e un gruppetto di cellule interne, la massa cellulare interna (ICM, inner cell mass), dalle quali avrà origine l embrione vero e proprio. Le cellule della ICM sono, per il breve tempo che precede la gastrulazione, pluripotenti e se prelevate in tempo, disgregate e coltivate in presenza di fibroblasti, citochine e LIF (leukemia inhibitory factor) (Smith et al.,1988; Williams et al., 1988) (5), possono moltiplicarsi sino a formare delle colonie di cellule ES. Dopo alcuni giorni di coltura da poco più di una decina di cellule isolate dalla singola blastocisti se ne possono ottenere migliaia. Queste cellule, se mantenute in condizioni ottimali, continueranno a proliferare rimanendo indifferenziate ed in uno stato diploide, se invece le condizioni di coltura verranno modificate, tenderanno a differenziarsi spontaneamente. La caratteristica più interessante delle cellule ES, per i possibili sviluppi terapeutici, è la loro capacità di differenziarsi, in specifiche condizioni di coltura, in quasi tutti i tipi - 3 -

12 Introduzione cellulari dell organismo. Cellule ES di topo sono state differenziate in vitro in cellule epiteliali, muscolari, nervose, epatiche, pancreatiche ed in osteoblasti ed adipociti (Wobus, 2001) (6). La principale applicazione potenziale della tecnologia delle cellule staminali ES umane è rivolta allo studio dello sviluppo embrionale ed a quello della scoperta di nuovi farmaci. In particolare, in farmacologia, l abilità a far crescere popolazioni pure di specifici tipi cellulari offre un ottimo strumento per saggiare l efficacia di nuove molecole nel trattamento di diverse patologie: si possono infatti provare centinaia e migliaia di nuovi farmaci in un tempo brevissimo e con una spesa minima rispetto ai saggi farmacologici oggi normalmente impiegati. Le linee di cellule umane ES sino ad oggi prodotte in diversi laboratori a livello internazionale (Carpenter et al., 2003) (7) si mantengono stabili come cariotipo e fenotipo per più di 300 passaggi in coltura e per oltre un anno di tempo esprimono un profilo di markers genici (Oct4, SSEA4, Tra-1-60 e Tra-1-81). Quando rimosse dai feeder layers e trasferite in sospensione, le ES iniziano a differenziarsi in aggregati multicellulari tridimensionali, composti da cellule differenziate ed indifferenziate, chiamati corpi embrioidi. Esperimenti di differenziazione in vitro hanno dimostrato che una volta piastrati i corpi embrioidi si compongono di una notevole varietà di tipi cellulari morfologicamente diversi (Odorico et al., 2001) (8): cardiomiociti con contrazione ritmica, cellule neuronali con assoni e dendriti in crescita, cellule mesenchimali ed altri tipi cellulari ancora. Il completo spettro di sviluppo potenziale delle cellule ES si rivela quando queste cellule vengono iniettate in vivo in blastocisti ospiti o in topi SCID (Thomson et al., 1998) (9) dove formano teratomi benigni composti da tessuti originati da cellule altamente differenziate e rappresentative dei tre foglietti germinali (ectoderma: - 4 -

13 Introduzione epiteli neuronali; mesoderma: osso, cartilagine, muscolo striato, tubuli renali; endoderma: epiteli intestinali). Uno dei problemi di più difficile risoluzione è legato alla straordinaria capacità proliferativa delle cellule ES che in vivo possono formare tumori o differenziarsi in tipi cellulari non desiderati, mentre in vitro è possibile dirigere la differenziazione delle ES verso uno specifico tipo cellulare. 1.2 Le cellule staminali adulte Le cellule staminali adulte, Adult Stem Cells, sono cellule presenti nei tessuti di un organismo adulto in grado di autorinnovarsi e di differenziare. Le Adult Stem Cells persistono durante la vita e svolgono in genere funzioni di riparazione tissutale, in risposta ad eventi traumatici o al naturale turnover cellulare (10). Lo studio e la progressiva caratterizzazione delle cellule staminali adulte ha modificato significativamente il concetto di cellula staminale, secondo il quale esiste una differenziazione progressiva dei precursori immaturi che segue lo schema della filiera di derivazione embrionale a cui una cellula appartiene. L osservazione che alcune cellule staminali adulte presenti nel midollo osseo (di origine mesodermica) o in molti altri tessuti sono in grado di assumere morfologia e funzione di cellule di diversa origine embrionale come neuroni o cellule gliali (di origine ectodermica), ed epatociti o pneumoniti (di origine endodermica), ha evidenziato una pluripotenzialità di questi elementi cellulari che ricorda quella delle cellule staminali embrionali. Tali elementi staminali adulti possono migrare in siti molto diversi da quelli di origine, partecipando a fenomeni di rigenerazione tissutale e presentano capacità differenziative e proliferative simili a quelle della blastocisti entro le prime due settimane dall impianto. Queste osservazioni mostrano la capacità rigenerativa dei tessuti adulti, sollevano interrogativi su quando realmente possa dirsi concluso lo - 5 -

14 Introduzione sviluppo embrionale, ma allo stesso tempo suggeriscono enormi potenzialità applicative nell ambito della medicina rigenerativa (11). 1.3 Le cellule staminali mesenchimali Le cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono precursori non ematopoietici inizialmente isolati dal midollo osseo come elementi aderenti, altamente proliferanti, dotati di potenziale di self-renewal a lungo termine e di differenziazione multilineare in diversi tessuti di origine mesenchimali (12,13). Tali proprietà, la facilità di isolarle e coltivarle ed il loro elevato potenziale di espansione ex vivo ne fanno una interessante risorsa utilizzabile in una vasta gamma di applicazioni cliniche nel contesto della terapia cellulare e genica ed in medicina rigenerativa (14). Le MSCs derivano dal mesoderma, il foglietto embrionale intermedio da cui originano i tessuti connettivi di tutto l organismo, che si differenzia intorno al terzo mese di gestazione. Il mesenchima differisce notevolmente dagli altri foglietti embrionali, costituiti quasi esclusivamente di cellule, in quanto è composto da un abbondante matrice extracellulare in cui sono immerse le cellule mesenchimali. Il tessuto mesenchimale si ritrova in tutti gli organi, per garantire supporto strutturale e per regolare il traffico di cellule attraverso i tessuti. Le MSCs, derivano principalmente dal mesoderma, ma possono originare anche da alcune porzioni degli altri due foglietti embrionali: l ectoderma della cresta neurale e l endoderma della placca precordale (15). Tuttavia non si conosce molto sul loro sviluppo durante la vita fetale e post-natale. E stata descritta da Pèault B. et al. l esistenza di una componente di supporto stromale che circonda lo strato emopoietico primitivo dell aorta dorsale nella regione aorto-gonado-mesonefrica del feto umano. Questa popolazione cellulare abbastanza omogenea, consiste di uno strato di cellule stipate - 6 -

15 Introduzione in gruppi, rotondeggianti, situate nel mesenchima, esprimenti varie proteine della matrice extracellulare, in grado di supportare l emopoiesi sia embrionale sia adulta (16,17). Una quota cospicua di cellule analoghe per fenotipo e caratteristiche colturali alle MSCs midollari adulte, ma con potenzialità differenziative più grandi, è stata poi riscontrata nel sangue circolante di feto umano fino alla 7 settimana di gestazione, dopo la quale queste cellule iniziano a diminuire di numero, persistendo fino alla 12 settimana (18). Evidenze sperimentali indicano che una popolazione di cellule a bassissima frequenza persiste nel sangue periferico (19,20): colonie di cellule fibroblastoidi, esprimenti varie caratteristiche mesenchimali, sono state ottenute in coltura, in presenza di siero fetale bovino, da prelievi ematici di soggetti sani, senza aggiunta di fattori di crescita (21). Anche in alcuni studi sul chimerismo dopo trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche da sangue periferico stimolato con fattore di crescita veniva dimostrata una percentuale di cellule stromali del donatore nel soggetto trapiantato (22,23). Si può quindi supporre che durante lo sviluppo embrio-fetale ci siano cellule che si distribuiscono ai vari distretti corporei e persistono nell adulto come riserva per la riparazione e la rigenerazione tissutale (24). Le MSCs sono in grado di differenziare non solo in tessuti di origine mesenchimale, tra cui stroma midollare, tessuto adiposo, osseo, cartilagineo, tendineo e muscolare scheletrico, mesoderma viscerale e cellule endoteliali (12,13), ma anche in cellule di origine nonmesodermica quali neuroni, cellule epiteliali di cute e tubo digerente, fegato e polmone (12,13,18,25). Le MSCs si distinguono da almeno altri due tipi cellulari. Il primo è costituito dalle multipotent adult progenitor cells (MAPC), elementi in grado di differenziare in vitro in cellule endoteliali, epiteliali, neuronali, e verosimilmente rappresentano il precursore comune multipotente da cui originano sia le cellule staminali emopoietiche che quelle mesenchimali. Il secondo tipo cellulare è costituito dalle genericamente dette marrow stromal cells o, come è stato suggerito recentemente, - 7 -

16 Introduzione multipotent mesenchymal stromal cells, che hanno capacità differenziativa multilineare limitata ai soli tessuti di origine mesodermica (tessuto adiposo, osso, cartilagine, muscolo) (26). In realtà la discrepanza tra nomenclatura e caratteristiche biologiche sembra più dovuta a differenze nei saggi utilizzati nei diversi lavori, più che ad una reale coesistenza di più cellule staminali di origine mesenchimale, anche se sicuramente esiste un gradiente nella potenzialità differenziativa delle MSCs, così come avviene per i precursori emopoietici. Alcuni fattori tissutali, inoltre, come il basic fibroblast growth factor (bfgf) o l heparin-binding growth factor-like growth factor (hb-egf), sembrano in grado non solo di incrementare la proliferazione, ma anche d interferire con la capacità differenziativa delle MSCs, mantenendole nello stato di multipotenzialità (27). Le MSCs possono essere facilmente isolate grazie alla loro capacità di aderire su plastica. Le cellule possono essere seminate in piastre o fiasche di coltura a diverse concentrazioni, con terreni di coltura addizionati di siero animale o umano al 10-20% ed antibiotici, e coltivate in appropriate condizioni. Dopo alcune ore, le cellule aderiscono alla superficie della fiasca, mentre quelle non aderenti vengono rimosse con un cambio di terreno, generalmente dopo 48 o 72 ore. Già dopo alcuni giorni si formano dei foci di proliferazione cellulare, fibroblast-colonyforming units (CFU-F), costituite da aggregati di almeno 50 cellule, che vengono contate dopo 14 giorni e rapportate alla popolazione cellulare di partenza, in modo da quantificarne la capacità clonogenica (28). I foci di cellule aderenti crescono molto rapidamente e tendono alla confluenza reciproca, che porta all'arresto della proliferazione ed alla differenziazione spontanea in pre-adipociti. Pertanto, quando il monostrato cellulare diventa semi-confluente (il 70-80% della superficie della fiasca coperta dalle cellule), le cellule vengono tripsinizzate, lavate e nuovamente seminate in fiasche con superficie maggiore per l'ulteriore espansione. Una popolazione cellulare omogenea si ottiene in - 8 -

17 Introduzione genere dopo 3-5 settimane di coltura e questa è capace di proliferare senza differenziare spontaneamente fino a 40 generazioni (29,30,31). Le MSCs possono essere isolate ed espanse in vitro senza apparente modificazione del fenotipo e/o perdita di funzione. La caratterizzazione fenotipica delle MSCs rimane ancora un campo di approfondimento data la mancanza di un marcatore specifico per l analisi e l isolamento delle MSCs (32). Infatti, le MSCs sono prive di markers distintivi unici, così vengono individuate attraverso l analisi di un complesso immunofenotipo, che comprende la mancanza di antigeni tipici delle cellule staminali emopoietiche, come il CD45, il CD34 ed il CD14, e l espressione di una serie di molecole di superficie, come il CD90, chiamato anche Thy-1, il CD105 o endoglina (33); il CD29 o subunità β del recettore per la fibronectina, il CD44 o recettore- III della matrice extracellulare ed il CD73 o SH3-SH4. Le MSCs, anche dopo espansione in vitro, mantengono l espressione di antigeni di superficie come il CD105, CD90, CD73 e CD44. Questi marcatori sono risultati uniformemente e fortemente espressi sulle MSCs isolati da tessuti di diversa origine (34,35). Nonostante la maggior parte dei dati pubblicati si riferiscono a colture cellulari ottenute da midollo osseo, si sta raccogliendo un sempre maggior numero di informazioni sulle MSCs ottenute da fonti alternative come il tessuto adiposo, il sangue periferico, il cordone ombelicale ed i tessuti fetali. Queste cellule condividono, in vitro, molte delle caratteristiche delle MSCs da midollo osseo: l aderenza alla plastica, la morfologia fibroblastoide, la formazione di CFU-F, alcuni markers superficiali ed il potenziale differenziativo in senso osteogenico, adipogenico e condrogenico in seguito ad appropriati stimoli

18 Introduzione 1.4 Le cellule staminali mesenchimali nel midollo osseo Le cellule staminali mesenchimali furono descritte per la prima volta come progenitori derivati dalla frazione stromale di midollo osseo di ratto da parte di Friedenstein e Petrakova nel 1966 e successivamente Friedenstein divenne il pioniere delle metodiche di coltura in vitro per l isolamento e la differenziazione delle MSCs (10). L evidenza definitiva della presenza nel midollo osseo adulto di cellule aderenti in grado di crescere in forma di fibroblasti e di differenziare in vari elementi mesenchimali, si deve ai lavori della metà degli anni 70 (12). Campioni di midollo osseo intero vennero seminati in piastre di coltura in plastica ed a distanza di quattro ore vennero rimosse tutte le cellule non aderenti. I pochi elementi aderenti presentavano un aspetto fusato o simil-fibroblastico e formavano CFU-F. Dopo diversi passaggi in coltura, le cellule che sopravvivevano divenivano omogenee e conservavano la capacità di replicarsi e di dare origine a cellule della cartilagine e della struttura ossea (12). Numerosi studi hanno in seguito confermato la multipotenzialità di queste cellule. In presenza di adeguati stimoli, esse differenziano in adipociti (con vacuoli citoplasmatici contenenti lipidi), osteoblasti (con deposizione di cristalli di idrossiapatite), condrociti (con sintesi di matrice cartilaginea), e cellule muscolari (ricche in miotubuli) (13,36,37,38). Oggi è generalmente accettato che le MSCs sono cellule relativamente rare nel midollo osseo (1/10 5 delle cellule nucleate), dotate di elevata capacità proliferativa senza trasformazione neoplastica, conservando le proprietà staminali (39,40). Sono in grado di esprimere geni di origine embrionale, di sintetizzare molecole di contatto cellula-cellula e componenti della matrice extra-cellulare come il collagene e la fibronectina, di secernere citochine quali interleuchina (IL)-7, IL-8, IL-11, stem cell factor (SCF) e stromal-derivedfactor-1 (SDF-1), attraverso cui viene regolata la mobilizzazione dal midollo delle cellule

19 Introduzione staminali emopoietiche. Per questa ragione le MSCs svolgono il ruolo essenziale di compartimento omeostatico delle cellule stromali midollari, rinnovando continuamente il microambiente necessario per l emopoiesi. Infatti, tali cellule sono in grado di supportare in vitro le colture emopoietiche a lungo termine ed è stato dimostrato che la co-infusione di MSCs e cellule staminali emopoietiche consente un più rapido recupero ematologico dopo trattamento chemioterapico ad alte dosi rispetto alla sola infusione di cellule staminali emopoietiche. Inoltre, data la loro derivazione dal mesoderma intra-embrionario, le MSCs sono in grado di differenziare in numerosi altri tessuti oltre a quelli delle linee osteogenica, adipogenica, condrogenica e muscolare, come cellule di origine endodermica (epatociti, pneumociti) ed ectodermica (cellule nervose, cellule gliali) (13,41). Le cellule staminali mesenchimali midollari infatti esprimono già basalmente marcatori neuronali a bassa intensità ed è descritta in letteratura la capacità delle MSCs midollari di differenziare in senso neurale sotto l effetto di stimoli appropriati (17,29,42). Tale pluripotenzialità è tuttavia progressivamente persa a seguito del processo di senescenza, che si documenta generalmente dopo almeno 40 raddoppiamenti di popolazione. 2. Fonti alternative di cellule staminali mesenchimali L'utilizzo di MSCs da midollo osseo è limitato da due principali problematiche: la procedura invasiva del prelievo di midollo e l'esiguo numero di cellule staminali che si ottengono da ogni prelievo (43). Per questo vengono ricercate nuove fonti, tra cui le più studiate sono i tessuti fetali ed il tessuto adiposo

20 Introduzione 2.1 Cellule staminali mesenchimali nel sangue di cordone ombelicale Il sangue di cordone si è rivelato un eccellente risorsa di cellule staminali emopoietiche per il trapianto allogenico. Rispetto al midollo osseo, presenta una maggiore percentuale di cellule CD34 + CD38 -, suggerendo che nel sangue neonatale possano essere presenti progenitori dotati di potenziale proliferativo e differenziativo. Alcuni ricercatori hanno quindi ipotizzato che nel cordone potessero essere presenti anche progenitori mesenchimali. Diversi autori hanno escluso tale possibilità, ma nel 2004 Bieback e collaboratori hanno dimostrato che rispettando determinati parametri, quali un ridotto tempo di conservazione dei campioni e la disponibilità di almeno 1x10 8 cellule mononucleate, è possibile isolare elementi simili alle MSCs (MSC-like cells) dal sangue di cordone con un'efficienza maggiore del 60%. Tali cellule hanno una frequenza molto più bassa nel cordone rispetto che nel midollo ma mostrano una maggiore capacità proliferativa. Le MSC-like cells esprimono alcuni tipici markers mesenchimali e mancano di quelli emopoietici. Sono inoltre in grado di differenziare in senso osteogenico e condrogenico, come quelle ottenute da midollo, mentre necessitano di particolari condizioni di coltura per originare cellule del tessuto adiposo (coltura in terreno di induzione per il differenziamento adipogenico per almeno 5 settimane). 2.2 Cellule staminali mesenchimali nel liquido amniotico e nei villi coriali L'amniocentesi e la villocentesi sono tecniche utilizzate in periodi diversi della gravidanza per la diagnosi prenatale delle anomalie cromosomiche. L'amniocentesi è la tecnica a cui si ricorre più frequentemente; questa viene effettuata nel secondo trimestre di gravidanza, mentre la villocentesi permette di effettuare un'analisi ancora più precoce, essendo svolta nel primo trimestre di gravidanza. Inoltre i villociti si dividono spontaneamente dopo il prelievo, consentendo di dare i primi risultati già dopo 24 ore, a differenza degli amniociti