Tecniche di marcatura dei leucociti autologhi e metodologie diagnostiche in Medicina Nucleare. Relatrice: Dott.ssa Daniela Lardaruccio

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1 Tecniche di marcatura dei leucociti autologhi e metodologie diagnostiche in Medicina Nucleare. Relatrice: Dott.ssa Daniela Lardaruccio

2 IL PROCESSO FLOGISTICO L infiammazione può essere: ACUTA CRONICA È caratterizzata da un aumento di flusso ematico e da una alterata permeabilità capillare con conseguente trasudazione di proteine plasmatiche (inclusi fattori del complemento e anticorpi) e di leucociti nel tessuto infetto. Le cellule infiltranti sono costituite prevalentemente da macrofagi, linfociti, monociti e plasmacellule con associata proliferazione di vasi sanguigni e fibrosi.

3 I radiofarmaci utilizzati sono: Leucociti o granulociti autologhi marcati con 99m TcHMPAO o con 111 In-oxina; 99m Tc-Anticorpi antigranulociti (MoAb); 67 Gallio-citrato ( 67 Ga); 18 F-Fluorodesossiglucosio (FDG); 99m Tc-Difosfonati (HDP/MDP).

4 SCINTIGRAFIA CON LEUCOCITI AUTOLOGHI MARCATI È un indagine diagnostica che si propone di identificare la presenza di eventuali focolai di flogosi/infezione presenti nell organismo e non riconoscibili con altre tecniche. Così, marcando i leucociti autologhi ed attraverso la valutazione scintigrafica, è possibile individuare eventuali infezioni ed infiammazioni presenti nell organismo. I globuli bianchi svolgono fisiologicamente una funzione di difesa contro gli agenti infettanti e pertanto si concentrano in un focolaio infettivo allo scopo di combattere l infezione.

5 Le tecniche utilizzate per procedere alla marcatura dei leucociti autologhi sono essenzialmente due: Marcatura in vitro dei leucociti autologhi: Metodica che implica un complesso e laborioso processo di separazione e di marcatura dei leucociti; Tecnica che ha il vantaggio di avere una più adeguata accuratezza diagnostica sia in termini di sensibilità che di specificità. Marcatura in vivo dei leucociti autologhi: Metodica che ha in generale una soddisfacente accuratezza diagnostica però sia la sensibilità che la specificità degli anticorpi anti-granulociti marcati sono generalmente inferiori rispetto a quelle della più complessa metodica basata sui leucociti autologhi marcati in vitro; Tecnica che ha il vantaggio di una maggior semplicità e sicurezza (sia per i pazienti che per gli operatori) rispetto alla marcatura in vitro dei leucociti.

6 MARCATURA IN VITRO DEI LEUCOCITI AUTOLOGHI FASE 1: Prelevare 50 ml di sangue FASE 2: Prelevare da questa siringa un aliquota di 10 ml e centrifugarla a 800 g per 10 minuti; prelevare il sovranatante e trasferirlo in provetta. Aggiungere alla siringa con la quota maggiore di sangue 10 ml di HEAS-steril, evitando la formazione di bolle; miscelare bene capovolgendo ripetutamente la siringa, porre quindi la siringa in posizione obliqua su un supporto e lasciare sedimentare il contenuto per min a temperatura ambiente.

7 MARCATURA IN VITRO DEI LEUCOCITI AUTOLOGHI FASE 3: Completata la sedimentazione, trasferire il sovranatante in una provetta sterile di plastica da 50 ml (contrassegnata come PRLP, plasma ricco di leucociti e piastrine) e centrifugare tale provetta a 150 g per 5 minuti. Terminata la centrifugazione, aspirare il sovranatante e trasferirlo in una provetta contrassegnata come PRP (plasma ricco di piastrine) e centrifugarla di nuovo a 800 g per 10 minuti per ottenere un sovranatante contrassegnato come CFP2. FASE 4: Ricostituire un kit di HMPAO con 3 ml di 99m Tc appena eluito a elevata attività specifica (1,1-1,5 GBq/mL o mci/ml) e lasciare a incubare per 5 minuti in agitazione lenta; al termine prelevare 1 ml (circa 1,1 GBq, o 30 mci) per la marcatura.

8 MARCATURA IN VITRO DEI LEUCOCITI AUTOLOGHI FASE 5: Aggiungere nella provetta contenente i leucociti 1 ml di 99m Tc- HMPAO e lasciare incubare per minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 4 ml di CFP2. Centrifugare a 150 g per 5 minuti. Aspirare i leucociti marcati in una siringa da 10 ml e reiniettare nel paziente. L intera procedura qui descritta ha una durata di circa 2 ore

9 MARCATURA IN VITRO DEI LEUCOCITI AUTOLOGHI Affinché le cellule radiomarcate possano assolvere al loro compito è necessario che: I leucociti marcati si comportano, una volta re-iniettati, esattamente come i nativi; pertanto, il processo di isolamento e marcatura non deve danneggiarli, né deve variarne le capacità funzionali e la sopravvivenza. Il legame cellule-radiofarmaco rimanga stabile per tutta la durata dell esame, evitando così una ridotta sensibilità dell analisi e un elevata attività aspecifica nei distretti corporei che potrebbe interferire con la valutazione delle immagini.

10 MARCATURA IN VIVO DEI LEUCOCITI AUTOLOGHI La marcatura del Leukoscan avviene in tre fasi: 1. Il liofilo è dapprima ricostituito aggiungendo 0,5 ml di soluzione fisiologica; 2. Si aggiunge quindi 1 ml di 99m Tc-pertecnetato agitando il flacone fino a dissoluzione completa del contenuto; 3. Incubazione di circa 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la marcatura, la soluzione deve essere ispezionata visivamente per verificare l assenza di particelle in sospensione e/o di colorazione anomala (la soluzione deve essere limpida e incolore). Il radiofarmaco è stabile fino a 4 ore dopo la marcatura.

11 PROCEDURA PRE-ESAME Consiste nel: Verificare l appropriatezza del quesito clinico proposto; Raccogliere le informazioni anagrafiche e clinico-anamnestiche; Raccogliere gli esami emato-chimici (VES, PCR, es. emocromo ed emocoltura quando indicata) e strumentali inerenti il quesito clinico che dovranno essere portate al momento dell esecuzione dell esame; Verificare la capacità del paziente di eseguire l esame (assenza di claustrofobia), di completare le varie acquisizioni dell indagine e di rimanere in clinostatismo fermo sul lettino per tutta la durata dell esame (almeno 40 minuti quando è eseguita l acquisizione SPECT o SPECT-CT); Procedere alla sospensione, se indicato e possibile, dei farmaci noti per interferire con la funzionalità dei leucociti.

12 CONTROINDICAZIONI Stato di gravidanza in atto; Allattamento; Scarsa compliance del paziente; Grave leucopenia in caso di somministrazione di 99m Tc-HMPAO/ 111 In-leucociti misti autologhi o granulociti puri (G.B. < 2000); Presenza di anticorpi anti HAMA in caso di pregresse somministrazioni di anticorpi monoclonali ( 99m Tc-MoAb antigranulociti);

13 PROTOCOLLO DI AQUISIZIONE Nel caso di scintigrafia con leucociti marcati con 99m Tc-HMPAO: È consigliato l utilizzo di collimatore Low Energy High Resolution (140 KeV con finestra del 20%); La matrice da impostare è di 128x512; È importante impostare anche la velocità di scorrimento del lettino pari a 10 min/metro. La scelta della metodica di acquisizione sarà effettuata in funzione della regione corporea da studiare. Successivamente devono essere eseguite acquisizioni statiche planari delle regioni di interesse, queste possono essere eseguite a conteggio o a tempo.

14 PROTOCOLLO DI ACQUISIZIONE L acquisizione di immagini precoci ( +2-4h ) e tardive ( max +24h ) varia a seconda della patologia in esame. Infatti, le acquisizioni tardive planari (eseguite a conteggio o a tempo) possono essere seguite da acquisizione SPECT o SPECT/TC. Nel caso di acquisizione SPECT, i parametri da impostare sono: Matrice 128x128; Zoom 1; Campionamento angolare di 3 pari a 120 viste; Tempo/step: sec.

15 APPLICAZIONI CLINICHE ARTRITE INFETTIVA Infiammazione dell articolazione conseguente a infezione batterica, fungina, o virale dei tessuti sinoviali o periarticolari. La diffusione dei microrganismi al tessuto sinoviale può avvenire per batteriemia, per penetrazione diretta dall esterno (morsi, chirurgia, traumi penetranti), o per contiguità da focolai infettivi vicini (osteomielite, ascessi dei tessuti molli, ferita infetta). Scintigrafia con leucociti autologhi marcati con 99m Tc-HMPAO in paziente con sospetta artrite settica del ginocchio destro. Le immagini statiche planari precoci (in alto) e tardive (al centro) nelle due proiezioni anteriore e posteriore e in proiezione laterale (in basso) evidenziano iperaccumulo dei leucociti marcati in corrispondenza della cavità articolare del ginocchio destro.

16 APPLICAZIONI CLINICHE Studio scintigrafico, mirato sulle anche ed esteso al tratto medioprossimale delle cosce: Eseguito dopo 4 e 24 ore circa dalla marcatura "in vivo" dei leucociti mediante la somministrazione di frammenti anticorpali monoclonali specifici legati a 99m Tc; Sono state acquisite immagini statiche, ottenute nelle proiezioni anteriori e posteriori. Le immagini mostrano una modesta iperconcentrazione dei leucociti marcati che si proietta a carico dei tessuti molli del versante antero-laterale della coscia destra, in sede peri-femorale. Il quadro scintigrafico depone per processo flogistico o flogistico-infettivo in fase attiva nella sede suddetta.

17 CONCLUSIONI Lo studio scintigrafico con leucociti marcati rappresenta una metodica di medicina nucleare di elevato valore diagnostico. La tecnica di marcatura dei leucociti autologhi, la verifica della qualità della procedura e la metodologia di acquisizione delle immagini scintigrafiche (imaging planare e SPECT) risultano di fondamentale importanza ai fini del risultato clinico.

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