Lo studio delle induzioni e la scoperta de l organizzatore

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1 Lo studio delle induzioni e la scoperta de l organizzatore La formazione degli assi negli anfibi è una combinazione tra sviluppo a mosaico e regolativo. Nei lab di Hans Spemann (Premio Nobel 1935) si evidenziò la necessità di interazioni induttive Da allora (prima con l embriologia sperimentale, recentemente con l embriologia molecolare) lo studio dei processi induttivi rappresenta uno dei campi più affascinanti della biologia dello sviluppo Gli esperimenti di Spemann negli anfibi i primi nuclei sono equivalenti e ogni blastomero è in grado di originare un organismo intero 1

2 Con strozzatura parallela a primo piano di segmentazione si sviluppano 2 larve complete Con strozzatura perpendicolare al primo piano di segmentazione lato dorsale originò larva completa, l altro lato una massa disorganizzata di cellule ventrali (no SNC, notocorda e somiti) 2

3 L uovo di anfibio è asimmetrico HP: esistenza di sostanze citoplasmatiche nell uovo ripartite in modo diverso? Il primo piano di segmentazione divide a metà la semiluna grigia Nella semiluna grigia qualcosa di essenziale per il successivo sviluppo Cellule dell area della semiluna grigia danno origine a LDB e sono predeterminate a invaginarsi. 3 Danno inizio alla gastrulazione

4 Durante la gastrulazione eventi progressivi di determinazione Cellule dell espianto mostrano uno sviluppo autonomo Triturus taeniatus Triturus cristatus Cellule dell espianto mostrano uno sviluppo condizionale Alla fine della gastrulazione i tessuti sono determinati 4

5 un unico tessuto della gastrula era in grado di autodifferenziarsi il LABBRO DORSALE DEL BLASTOPORO Spettacolari esperimenti di trapianto Hans Spemann e Hilde Mangold (1924) (H. Spemann, Premio Nobel nel 1935) Cellule del LDB (e loro derivati notocorda e endomesoderma cefalico) = l ORGANIZZATORE - inducono tessuti ventrali a diventare dorsali (tubo neurale e mesoderma somitico) - organizzano un embrione secondario con assi antera-posteriore e dorso-ventrale 5

6 induzione del cordomesoderma e dell ectoderma neurale è l inizio di una serie di altre induzioni INDUZIONE EMBRIONALE PRIMARIA ma è davvero il primo evento induttivo? NO! 6

7 INDUZIONE MESODERMICA L ipotesi dei 3 segnali di Slack (fine anni 80) segnale di induzione di mesoderma ( generico ) 2 - segnale di induzione della corda (cordomesoderma) 3 - segnale di dorsalizzazioone del mesoderma (per somiti e mesotelio) 7

8 Gli esperimenti di Nieuwkoop e Nakamura Induzione del mesoderma da parte dell endoderma vegetativo Trapianto di cellule vegetative dorsali in parte ventrale di blastula di 32 cellule induce secondo asse 8

9 Specificità regionale dell induzione del mesoderma (sandwich di animal caps con diversi blastomeri vegetativi di blastula a 32 cellule) Blastomero D1 (più dorsale) induce a formare strutture del mesoderma dorsale Centro di Nieuwkoop Cellule vegetative più dorsali in grado di indurre l organizzatore 9

10 Meccanismo di stabilizzazione della B-catenina nella regione dorsale della blastula Fecondazione e rotazione corticale Proteine GBP (GSK3 binding protein) e Dsh (Dishevelled) che inattivano GSK3 sono traslocate su lato dorsale Wnt11 protezione ulteriore della B-catenina GSK3 (Glycogen synthase kinase 3) elimina B-catenina tranne che nel lato dorsale, dove B-catenina si accumula nei nuclei B-catenina può attivare trascrizione di altri fattori importanti per la trascrizione di proteine tipiche dell organizzatore 10

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12 Segnali della superfamiglia TGF-B dall endoderma sono determinanti per l induzione del mesoderma VegT e Vg1 (mrna materni nell endoderma) Proteine es. activina e Nodal (fattori paracrini che istruiscono cellule a divenire mesoderma) 1 Gradiente di queste proteine controlla il tipo di mesoderma indotto: 3 (Prot correlate a Nodal) Regionalizzazione dorso-ventrale del mesoderma dipende da azione sinergica di segnali endodermici dorsali (dipendenti da B-catenina) e ventrali (dipendenti da VegT) che attivano espressione di geni correlati a Nodal (Agius 2000, De Robertis.) 12

13 to summarize Two-step model of mesoderm induction in Xenopus At the midblastula stage, higher β -Catenin levels on the dorsal side of the embryo, together with the vegetally located transcription factor VegT and the maternal TGF-β -family growth factor Vg1, generate a gradient of Nodal related molecules expressed in the endoderm. In turn, this gradient induces the formation of overlying mesoderm: low doses of Nodal-related molecules (Xnrs) lead to the formation of ventral mesoderm, whereas high doses lead to the establishment of Spemann s organizer. Nieuwkoop s centre is the region of dorsal endoderm that induces organizer tissue. At the gastrula stage, the organizer secretes a cocktail of factors that refine the initial patterning. Note that β -Catenin is widely distributed on the dorsal side, including in derivatives of the three 13 germ layers. (CNS, central nervous system.) (De Robertis et al., 2000)

14 Black and Gerhart (1985, 1986) let the initial sperm-directed rotation occur, but then immobilized eggs in gelatin and gently centrifuged them so that the internal cytoplasm would flow toward the point of sperm entry. When the centrifuged eggs were then allowed to develop in normal water, two sites of gastrulation emerged, leading to conjoined twin larvae (Figure 10.10). Black and Gerhart hypothesized that the twinning was caused by the formation of two areas of interaction: one axis formed where the normal cortical rotation caused the normal cytoplasmic interactions in the vegetal region of the cell, the other where the centrifugation-driven cytoplasm interacted with the vegetal components. Twin blastopores produced by rotating dejellied Xenopus eggs ventral side (sperm entry point) up at the time of first cleavage. (A) Two blastopores are instructed to form: the original one (opposite the point of sperm entry) and the new one created by the 14 displacement of cytoplasmic material. (B) These eggs develop two complete axes, which form twin tadpoles, joined ventrally. (Photographs courtesy of J. Gerhart.)

15 Tessuti derivati dall organizzatore: - endoderma faringeo - placca precordale (mesoderma cefalico) - cordomesoderma (mesoderma dorsale. essenzialmente la notocorda) - labbro dorsale del blastoporo Romboencefalo e tronco Prosencefalo e Mesencefalo 15

16 INDUZIONE NEURALE Ricerca di fattori solubili prodotti dall organizzatore, in grado di indurre ectoderma a formare tessuto neurale le ricerche recenti hanno portato a un cambio di paradigma 1- è l epidermide che viene indotta a formarsi (da segnali BMP in particolare BMP4) 2- l organizzatore blocca induzione epidermica mediante inattivazione del segnale BMP (principali proteine inibitrici di BMP secrete dall organizzatore (Nogging, follistatina, cordina) 16

17 L induzione neurale è specificata regionalmente dalle diverse porzioni mesodermiche derivanti dal LDB (Gli esperimenti di Otto Mangold, marito di Hilde) Prime cellule del mesoderma che si involvono da LDB (endomesoderma) inducono la testa Successive - che formeranno la notocorda - inducono tronco e coda Quali sono i segnali induttivi coinvolti? 17

18 Inibitori del segnale Wnt prodotti da endoderma faringeo e mesoderma cefalico inducono strutture del capo 18

19 mrna di cerberus iniettato in un blastomero vegetativo ventrale Gradienti di Wnt e BMP specificano polarità postero-anteriore e dorso-ventrale. Interazione scoperta negli anfibi, oggi considerata generale nello sviluppo animale

20 Segnali Wnt e acido retinoico (RA) modellano il tronco Gradienti di proteine Wnt e RA (fattori di caudalizzazione) regolano la specificazione dell asse antero-posteriore nella regione del tronco e della coda Determinano pattern di espressione di geni Hox - specificazione delle regioni del tubo neurale 20

21 Left-right axis specification 21

22 La gastrulazione nei pesci (zebrafish) 1- Epibolia delle cellule del blastoderma guidato da cellule dello strato sinciziale del tuorlo (YSL) che si espandono sulla superficie della cellula del tuorlo. 2- Involuzione e ingressione di cellule del blastoderma, con formazione di ipoblasto (a differenza di uccelli e mammiferi formerà l endomesoderma) che si distingue dall epiblasto in superficie Quando l epibolia volge al termine (ca 10 hpf) il mesoderma circonda interamente il tuorlo tra endoderma ed ectoderma 22

23 Cellule dell ipoblasto e dell epiblasto si intercalano mediante processi di estensione convergente nella regione dorsale, formando lo scudo embrionale estensione convergente dell ipoblasto lungo la linea dorsomediana forma il cordomesoderma (scudo embrionale equivalente funzionale del LDB) Movimenti di estensione convergente del cordomesoderma sono simultanei a epibolia dell epiblasto verso il polo vegetativo. Modello formazione dell ipobasto 23 (endomesoderma)

24 Formazione degli assi embrionali in zebrafish 24

25 Lo sviluppo di zebrafish 25

26 Epiboly in zebrafish 26

27 LA GASTRULAZIONE NEGLI UCCELLI Al momento della deposizione l embrione consiste di un blastoderma cellulare a forma di disco, che giace sull abbondante tuorlo.

28 LA LINEA PRIMITIVA 3-4 h p.f La linea primitiva si presenta inizialmente come un ispessimento dell epiblasto a livello della zona marginale posteriore Le cellule del centro della linea primitiva aumentano in altezza mentre quelle che le circondano diventano tondeggianti, degradano la matrice cellulare su cui poggiano ed intercalandosi in senso medio-laterale attuano un estensione convergente

29 ALLUNGAMENTO DELLA LINEA PRIMITIVA L estensione convergente è responsabile dell avanzamento della linea primitiva: raddoppia la lunghezza e dimezza la larghezza. 7-8 h p.f. A questo allungamento contribuiscono anche divisioni cellulari Le cellule migrano anteriormente La migrazione ha una direzione posteroanteriore ed arriva ad estendersi per il 60-75% della lunghezza dell area pellucida X

30 FORMAZIONE DEL SOLCO PRIMITIVO E NODO DI HENSEN Mentre stria primitiva si allunga, si forma una depressione, il SOLCO PRIMITIVO L estremità anteriore della stria primitiva presenta un ispessimento, NODO DI HENSEN (analogo del labbro dorsale del blastoporo) al cui centro si trova una depressione imbutiforme, la fossetta primitiva La linea primitiva definisce gli ASSI EMBRIONALI: si estende dalla regione posteriore a quella anteriore le cellule migranti penetrano dal suo lato dorsale e si portano su quello ventrale divide la parte sinistra da quella destra

31 INGRESSIONE DEL MESODERMA E DELL ENDODERMA Le cellule dell epiblasto subiscono una trasformazione da epiteliali a mesenchimali e la loro lamina basale si disgrega (espressione del fattore di dispersione che interferisce con E- Caderine). Migrazione attraverso queste depressioni e passaggio nel blastocele Le cellule dell epiblasto si muovono verso la stria primitiva Si formano endoderma (dai precursori che migrano per primi) e il mesoderma

32 La popolazione di cellule che passa attraverso la stria primitiva cambia continuamente ATTRAVERSO il NODO DI HENSEN Le prime cellule che migrano si portano in profondità nel blastocele e anteriormente ENDODERMA FARINGEO DELL INTESTINO ANTERIORE Poi migrano anteriormente altre cellule che non si spostano così ventralmente ma restano tra endoderma e epiblasto MESENCHIMA CEFALICO E MESODERMA DELLA PLACCA PRECORDALE

33 Le cellule che migrano successivamente attraverso il nodo di Hensen diventano cellule del cordomesoderma (notocorda) Le cellule che migrano attraverso le parti laterali e posteriori della linea primitiva danno origine alla maggior parte dei tessuti endodermici e mesodermici Lo strato profondo si unisce all ipoblasto dando origine a tutti gli organi endodermici e membrane extraembrionali Lo strato che rimane tra endoderma ed epiblasto costituisce la parti mesodermiche dell embrione e le membrane extraembrionali

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36 REGRESSIONE DELLA LINEA PRIMITIVA Dopo che endoderma e maggior parte del mesoderma si sono internalizzati la stria primitiva comincia a regredire e il nodo di Hensen si sposta verso l estremità posteriore dell embrione dove darà origine alla regione anale Le cellule rilasciate dal nodo di Hensen durante la sua regressione danno origine alla notocorda

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39 EPIBOLIA DELL ECTODERMA Mentre le cellule dell endoderma e del mesoderma presuntivi si spostano verso l interno, i precursori dell ectoderma cominciano a proliferare e migrano a circondare per epibolia il vitello Solo le cellule dell area opaca si saldano alla membrana vitellina attraverso lunghi filopodi. Tramite queste strutture si spostano lungo la membrana vitellina legandosi alla fibronectina presente in essa e trascinando così le altre cellule ectodermiche intorno al vitello

40 L analogia funzionale degli organizzatori dei Vertebrati Scudo embrionale Labbro dorsale del blastoporo Nodo di Hensen 40