BBL CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol (PEA)

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1 BBL CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol (PEA) I Rev. 10 Gennaio 2015 PROCEDURE DI CONTROLLO DI QUALITÀ INTRODUZIONE BBL CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol (PEA) (agar sangue di montone al 5% CDC per anaerobi con alcol feniletilico) è un terreno di coltura arricchito per l isolamento selettivo di batteri anaerobi obbligati da colture miste. II PROCEDURA DEL TEST 1. Ridurre tutte le piastre agar per anaerobiosi per una notte, a temperatura ambiente, in un sistema per anaerobiosi BD GasPak EZ. 2. Preparazione degli inoculi a. Preparare le colture di anaerobi obbligati per il test, inoculando con un tampone la crescita (di 2 5 giorni) da una piastra CDC agar sangue di montone al 5% per anaerobi in una provetta contenente 5 ml di terreno tioglicollato arricchito, con vitamina K 1 ed emina. Mescolare accuratamente e correggere per ottenere una torbidità comparabile allo standard McFarland 0,5. NOTA - Manipolare le colture rapidamente per evitare un esposizione prolungata all ossigeno. Il tempo di esposizione totale non deve superare 20 min. b. Usare brodi di coltura di h del microrganismo anaerobio facoltativo, diluiti Inoculo delle piastra a. Usando un pipettatore volumetrico o un sistema equivalente, dispensare 0,05 ml dell inoculo appropriato nei campioni di terreno in piastra e strisciare per l isolamento. Per Proteus mirabilis, usare una diluizione 10-3 del brodo di coltura come inoculo. b. Includere piastre di Trypticase Soy Agar con sangue di montone al 5% (TSA II) come controlli per tutti i microrganismi e piastre CDC agar sangue di montone al 5% per anaerobi come controlli per gli anaerobi obbligati. c. Incubare i controlli in piastre TSA II in aerobiosi a 35 ± 2 C e tutte le altre piastre in anaerobiosi (sistema per anaerobiosi BD GasPak EZ) a 35 ± 2 C. 4. Esaminare tutte le piastre inoculate dopo 48 e 72 h per verificare entità di crescita, dimensioni delle colonie, pigmentazione e reazioni emolitiche. Esaminare i ceppi di Porphyromonas alla luce UV (365 nm) per verificare la fluorescenza. 5. Risultati attesi *Bacteroides fragilis ATCC *Clostridium perfringens ATCC *Peptostreptococcus anaerobius ATCC Porphyromonas levii ATCC Escherichia coli ATCC *Proteus mirabilis ATCC Crescita Crescita, beta emolisi Crescita moderata intensa a 72 h. Le colonie sono di colore biancastro bronzo, circolari con bordo intero. Crescita lieve intensa a 72 h. Le colonie sono di colore biancastro - bronzo, circolari, intere, in rilievo, opache. Fluorescenza da rosa brillante ad arancio a rosso mattone alla luce UV.** Crescita in tracce intensa; le dimensioni delle colonie sono ridotte rispetto al controllo non selettivo. Le colonie sono grigie, leggermente in rilievo, semi-opache con superficie brillante. Crescita in tracce intensa; lo sciamare è inibito rispetto al controllo non selettivo. Le colonie sono di color grigio chiaro, circolari, traslucide opache. * Ceppo batterico raccomandato per il controllo di qualità a cura dell utente. ** La fluorescenza si osserva soltanto in colonie giovani. Il pigmento si sviluppa lentamente e può oscurare la fluorescenza. 1

2 III CONTROLLO DI QUALITÀ SUPPLEMENTARE 1. Esaminare le piastre come descritto in Deterioramento del prodotto. 2. Eseguire un esame visivo delle piastre rappresentative per garantire che l eventuale presenza di difetti fisici non interferisca con l uso. 3. Determinare il ph mediante potenziometria a temperatura ambiente per verificare che rientri nel range specificato di 7,5 ± 0,2. 4. Verificare la stabilità delle piastre durante la procedura di inoculo. 5. Incubare a 35 ± 2 C per 72 h le piastre rappresentative non inoculate ed esaminarle per verificare la contaminazione microbica. INFORMAZIONI SUL PRODOTTO IV USO PREVISTO Il terreno BBL CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol è usato per l isolamento selettivo di batteri anaerobi obbligati esigenti a crescita lenta, da svariati materiali clinici e non clinici. V SOMMARIO E SPIEGAZIONE L isolamento di batteri anaerobi obbligati da materiali clinici e non clinici richiede l uso di terreni selettivi, non selettivi e di arricchimento. 1 La scelta del terreno da impiegare si basa sul tipo di campione e sui risultati dell osservazione microscopica diretta. I terreni non selettivi si usano per isolare microrganismi presenti in bassa quantità e per fornire un indicazione della quantità e dei tipi di microrganismi presenti nel campione. I terreni selettivi sono impiegati per facilitare il recupero dei microrganismi desiderati presenti in popolazioni miste. L agar sangue di montone al 5% CDC per anaerobi con alcol feniletilico è stato formulato da Dowell et al. dei Centers for Disease Control and Prevention come terreno arricchito, selettivo per l isolamento e la coltura di batteri anaerobi obbligati da materiali clinici contenenti batteri anaerobi facoltativi a crescita rapida, come per esempio Proteus e altri membri della famiglia delle Enterobacteriaceae. 2 Il terreno impiega BBL Trypticase Soy Agar supplementato con agar aggiuntivo, estratto di lievito, vitamina K 1, emina, cistina, sangue di montone al 5% e alcol feniletilico. VI PRINCIPI DELLA PROCEDURA BBL CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol è un terreno altamente nutritivo grazie al contenuto di peptoni, estratto di lievito, emina, vitamina K 1 e sangue di montone. I peptoni forniscono i fattori di crescita azotati, carbonio, zolfo e altri ingredienti in traccia. L estratto di lievito è un importante fonte di vitamine B. Il cloruro di sodio mantiene l equilibrio osmotico. Componenti del sangue di montone, emina, cistina e vitamina K 1 forniscono i fattori di crescita richiesta da alcuni anaerobi obbligati. 3-7 La selettività si ottiene aggiungendo alcol feniletilico, che riduce la crescita dei batteri gramnegativi, anaerobi facoltativi, senza inibire la crescita dei batteri anaerobi obbligati. 8 VII REAGENTI BBL CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol Formula approssimata* per L di acqua purificata Digerito pancreatico di caseina... 15,0 g Digerito papaico di farina di soia... 5,0 g Cloruro di sodio... 5,0 g Agar... 20,0 g Estratto di lievito... 5,0 g Emina... 0,005 g Vitamina K ,01 g L-cistina... 0,4 g Alcol feniletilico... 2,5 g Sangue di montone, defibrinato... 5% *Compensata e/o corretta per soddisfare i criteri di performance. 2

3 Avvertenze e precauzioni Per uso diagnostico in vitro. Se si riscontra un umidità eccessiva, capovolgere il fondo su un coperchio e lasciare asciugare all aria per evitare la formazione di aderenze tra la parte superiore e inferiore della piastra durante l incubazione. I campioni clinici possono contenere microrganismi patogeni, inclusi i virus dell epatite e i virus dell immunodeficienza umana. Manipolare tutti i materiali e gli articoli contaminati con sangue e altri fluidi biologici in conformità alle norme dell istituto e alle precauzioni standard Dopo l uso, le piastre preparate, i contenitori dei campioni e gli altri materiali contaminati devono essere sterilizzati in autoclave prima dello smaltimento. Quando si impiegano i recipienti BBL GasPak con le buste per lo sviluppo di gas, usare soltanto buste di marca GasPak. Istruzioni per la conservazione Al ricevimento, conservare le piastre al buio a 2 8 C. Evitare congelamento e surriscaldamento. Aprire soltanto al momento dell uso. Ridurre al minimo l esposizione alla luce. Le piastre preparate, conservate nell involucro originario a 2 8 C sino al momento dell uso, possono essere inoculate fino alla data di scadenza e incubate per i tempi di incubazione raccomandati. Prima dell inoculo, attendere che il terreno si porti a temperatura ambiente. Deterioramento del prodotto Non usare le piastre se presentano tracce di contaminazione microbica, alterazione di colore, essiccamento o altri segni di deterioramento. VIII RACCOLTA E TRATTAMENTO DEI CAMPIONI Per la raccolta dei campioni, sono stati concepiti svariati tamponi e contenitori. Raccogliere i campioni prima della somministrazione di terapia antibiotica. Predisporre una consegna tempestiva al laboratorio. Per prolungare la sopravvivenza dei microrganismi allorché si prevede un intervallo di tempo significativo tra raccolta e coltura definitiva, sono stati concepiti numerosi terreni di conservazione o sistemi di trasporto, come per esempio i prodotti per la raccolta e il trasporto dei campioni BBL. Per informazioni dettagliate sulle procedure di raccolta e trattamento dei campioni, consultare la documentazione appropriata. 13,14 Il laboratorio deve essere provvisto di informazioni cliniche sufficienti a consentire al microbiologo di selezionare i terreni più adatti e le tecniche appropriate. IX PROCEDURA Materiale fornito BBL CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol Materiali necessari ma non forniti Terreni di coltura accessori, reagenti, microrganismi per controllo di qualità e apparecchiature di laboratorio necessarie. Procedura del test Adottare tecniche asettiche. La superficie agar deve essere omogenea e non eccessivamente umida. Strisciare il campione non appena perviene in laboratorio. Ridurre al minimo l esposizione all aria. In caso di campioni liquidi, inoculare i terreni con 1 goccia del campione. Triturare i campioni di tessuto e quindi omogeneizzarli in brodo sterile, come per esempio BBL Enriched Thioglycollate Medium, prima dell inoculo. Eseguire quindi l inoculo come per i campioni liquidi. I campioni su tampone possono essere seminati per rotolamento nel primo quadrante del terreno in piastra e usati quindi per inoculare i terreni liquidi. In alternativa, è possibile strofinare il tampone in un piccolo volume di brodo ridotto e usare il brodo per inoculare i terreni come nel caso di campioni liquidi. Ridurre questo terreno immediatamente prima dell inoculo ponendolo in anaerobiosi per h. 3 Un modo semplice ed efficace per ottenere condizioni di anaerobiosi adatte, è l uso dei sistemi per anaerobiosi BD GasPak EZ. 3

4 Inoculare i terreni in piastra usando la metodica di striscio su piastra per ottenere colture pure da campioni contenenti flora mista. Inoculare un brodo di arricchimento, come per esempio BBL Enriched Thioglycollate Medium, contemporaneamente alle piastre di isolamento primario. Incubare immediatamente in anaerobiosi o conservare in un recipiente flussato con gas privo di ossigeno fino ad accumulare un numero sufficiente di piastre (ma per non più di 3 h). 15 Incubare a 35 ± 2 C per almeno 48 h e preferibilmente per 5 7 giorni. Indipendentemente dal sistema per anaerobiosi usato, è importante includere un indicatore di anaerobiosi come per esempio l indicatore di anaerobiosi GasPak. Controllo di qualità a cura dell utente Vedere Procedure di controllo di qualità. Le procedure prescritte per il controllo di qualità devono essere effettuate in conformità alle norme vigenti o ai requisiti di accreditazione e alla prassi di controllo di qualità in uso nel laboratorio. Per una guida alla prassi di controllo di qualità appropriata, si consiglia di consultare le norme CLIA e la documentazione CLSI in merito. X RISULTATI Dopo l incubazione, la maggiore parte delle piastre evidenzia un area di crescita confluente. Poiché la procedura di striscio è in effetti una tecnica di diluizione, quantità decrescenti di microrganismi vengono depositate nelle aree strisciate. Di conseguenza, una o più di queste aree deve presentare colonie isolate dei microrganismi contenuti nel campione. La crescita di ogni microrganismo può inoltre essere classificata semiquantitativamente in base alla crescita di ciascuna delle aree strisciate. Esaminare le colonie usando un microscopio da dissezione e una lampada UV a onda lunga (le colonie di Porphyromonas-Prevotella spp. pigmentanti devono presentare fluorescenza arancio rosso mattone alla luce UV). La fluorescenza è visibile prima della pigmentazione. Per determinare la relazione con l ossigeno di ogni tipo di colonia presente sul terreno solido per anaerobiosi, inoculare i terreni seguenti Una piastra agar sangue per anaerobiosi, da incubare in anaerobiosi. 2. Una piastra agar sangue (o agar cioccolato) per aerobiosi, da incubare in aerobiosi supplementata con anidride carbonica. L agar cioccolato è particolarmente necessario per distinguere Haemophilus spp. esigenti sul piano nutritivo e altri batteri che crescono in agar sangue per anaerobiosi incubati in anaerobiosi e su agar cioccolato a una maggiore concentrazione di anidride carbonica, ma non crescono su agar sangue in presenza di anidride carbonica o aria. 3. Una piastra agar sangue per aerobiosi, da incubare in aerobiosi senza supplementazione con anidride carbonica. 4. Provette di terreno tioglicollato arricchito e/o terreno con carne cotta e una provetta di brodo peptone estratto di lievito glucosio. Incubare tutte le colture a 35 ± 2 C per almeno 24 h e un massimo di 7 giorni. Annotare la relazione con l ossigeno come anaerobio obbligato o non anaerobio (anaerobio aerotollerante, microaerofilo o anaerobio facoltativo). 16 I microrganismi che non crescono in piastre di subcoltura per aerobiosi possono essere presuntivamente ritenuti anaerobi obbligati in termini di fabbisogno di ossigeno. Le colonie dei ceppi che dimostrano di essere anaerobi obbligati, possono essere sottoposte a ulteriori studi usando i brodi di coltura corrispondenti. Per ulteriori informazioni, incluse le procedure di identificazione, consultare la documentazione appropriata. 6,7,17-21 XI LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA Alcuni test diagnostici possono essere eseguiti con la piastra primaria. Per i test biochimici e altre procedure di identificazione, si raccomanda tuttavia una coltura pura. Per informazioni dettagliate e procedure raccomandate, consultare la documentazione appropriata Un solo terreno è raramente adatto a rilevare tutti i microrganismi potenzialmente significativi in un campione. È importante ricordare che i microrganismi generalmente 4

5 sensibili all antibiotico in un terreno selettivo, possono essere completamente o soltanto parzialmente inibiti, a seconda della concentrazione dell antibiotico, delle caratteristiche del ceppo microbico e del numero di microrganismi nell inoculo. I microrganismi generalmente resistenti all antibiotico non devono essere inibiti. Per ottenere maggiori informazioni e garantire il recupero ottimale di potenziali patogeni, le colture di campioni cresciuti su terreni selettivi devono pertanto essere comparate con campioni cresciuti in coltura su terreni non selettivi. XII PERFORMANCE Prima della spedizione, vengono testate le performance di tutti i lotti di CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol (PEA). Campioni rappresentativi del lotto vengono inoculati mediante diffusione con 0,1 ml delle colture seguenti: Bacteroides fragilis (ATCC 25285), Clostridium perfringens (ATCC 13124), Peptostreptococcus anaerobius (ATCC 27337), Porphyromonas levii (ATCC 29147), Escherichia coli (ATCC 25922) e Proteus mirabilis (ATCC 12453). Gli inoculi per B. fragilis, C. perfringens, P. anaerobius e P. levii sono prelevati da colonie cresciute sulle piastre CDC agar sangue di montone al 5% per anaerobi e corrette a uno standard McFarland 0,5 in terreno tioglicollato arricchito ridotto. L inoculo per E. coli è prelevato da un brodo di coltura e diluito 10-1, mentre quello per P. mirabilis è prelevato da un brodo di coltura e diluito Dopo l inoculo, le piastre vengono incubate a 35 ± 2 C in un sistema GasPak completo. Le piastre vengono esaminate dopo 48 ore di incubazione. Tutti i microrganismi anaerobi presentano crescita leggera intensa, con tipica morfologia delle colonie e reazioni emolitiche, mentre E. coli e P. mirabilis evidenziano crescita in tracce intensa. Rispetto a un controllo non selettivo, le dimensioni delle colonie di E. coli sono ridotte mentre con P. mirabilis si registra una riduzione dello sciamare delle colonie. All esame alla luce UV (365 nm), P. levii presenta fluorescenza da rosa brillante ad arancio brillante a rosso mattone. XIII DISPONIBILITÀ N. di cat. Descrizione BD BBL CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol (PEA), confezione da 20 piastre XIV BIBLIOGRAFIA 1. Dowell, V.R., Jr Wound and abscess specimens, p In A. Balows (ed.), Clinical microbiology. How to start and when to stop. Charles C. Thomas, Springfield, Ill. 2. Dowell, V.R., Jr., G.L. Lombard, F.S. Thompson, and A.Y. Armfield Media for isolation, characterization, and identification of obligately anaerobic bacteria. CDC laboratory manual. Center for Disease Control, Atlanta. 3. Dowell, V.R., Jr., and T.M. Hawkins Laboratory methods in anaerobic bacteriology. CDC laboratory manual. HHS Publication No. (CDC) Centers for Disease Control, Atlanta. 4. Gibbons, R.J., and J.B. MacDonald Hemin and vitamin K compounds as required factors for the cultivation of certain strains of Bacteroides melaninogenicus. J. Bacteriol. 80: Wilkins, T.D., S.L. Chalgren, F. Jimenez-Ulate, C.R. Drake, Jr., and J.L. Johnson Inhibition of Bacteroides fragilis on blood agar plates and reversal of inhibition by added hemin. J. Clin. Microbiol. 3: Isenberg, H.D. (ed.) Clinical microbiology procedures handbook, vol. 1,2 and 3, 2nd ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 7. Rodloff, A.C., P.C. Appelbaum, and R.J. Zabransky Cumitech 5A, Practical anaerobic bacteriology. Coordinating ed., A.C. Rodloff. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 8. Dowell, V.R., Jr., C.O. Hill, and W.A. Altemeier Use of phenylethyl alcohol in media for isolation of anaerobic bacteria. J. Bacteriol. 88: National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, Pa. 10. Garner, J.S Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17: U.S. Department of Health and Human Services Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 12. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p Isenberg, H.D., F.D. Schoenknecht, and A. von Graevenitz Cumitech 9, Collection and processing of bacteriological specimens. Coordinating ed., S.J. Rubin. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 5

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