Roma, novembre 2005

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1 Roma, novembre 2005

2 Problematiche legate ai patogeni emergenti nei prodotti della pesca E. Suffredini, L. Cozzi, F. Scalise

3 D. L.voL 530/92 norme sanitarie per la produzione e l immissione sul mercato dei molluschi bivalvi vivi Requisiti microbiologici: salmonelle ed Escherichia coli Lipp E.K. & Rose J.B., The role of seafood in foodborne diseases in the United States of America. Rev. Sci.. Tech. 16: eziologia delle epidemie associate a consumo di molluschi 4% batteri associabili a contaminazione fecale 20% batteri naturalmente presenti nell ambiente marino (e.g. Vibrio) numerosi studi epidemiologici 10-50% casi GE associabili a NoV (~40% trasmissione alimentare) casi/anno di HAV in Italia (SEIEVA)

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5 Determinazione di virus enterici Epatite A (HAV): RT-nested-PCR L. Croci, D. De Medici, G. Morace, A. Fiore, C. Scalfaro, F. Beneduce and L. Toti (1999). Detection of hepatitis A virus in shellfish by nested reverse transcription-pcr Int J Food Microbiol 48: Norovirus (NoV): RT-booster-PCR D. De Medici, L. Croci, E. Suffredini and L. Toti (2004). Reverse transcription-booster PCR for detection of Noroviruses in shellfish Appl Environ Microbiol 70(10): Enterovirus (EV): RT-nested-PCR D. De Medici, F. Beneduce, A. Fiore, C. Scalfaro and L. Croci (1998) Application of reverse transcriptase-nested-pcr for detection of poliovirus iun mussels Int J Food Microbiol 40: 51-56

6 Epidemia di HAV Campania (gennaio - agosto 2004) Osservatorio Epidemiologico Regione Campania Centro Naz. Epidemiologia Dip. MIPI - epatiti virali C.N.Q.R.A. - LNR per le contaminazioni batteriologiche e virali dei molluschi bivalvi vivi Monitoraggio delle aree di produzione dell alto Adriatico I.Z.S. Lombardia Emilia Romagna, sez. Brescia I.Z.S. Venezie, sez. Adria Monitoraggio dei prodotti in vendita nell area di Napoli I.Z.S. Mezzogiorno, sez. Portici

7 Periodo gennaio agosto 2004 : 882 casi di epatite A frequenza su base regionale: : 15/ abitanti frequenza nazionale 3-5/ ; max 30/ Puglia e Campania

8 (1993 to 2003) casi/ Ca mp ania Italia

9 Periodo gennaio agosto : 882 casi di epatite A frequenza su base regionale: : 15/ frequenza nazionale 3-5/ Casi concentrati in due aree costali (attack rate 54.3/ abitanti) 694 casi (78.7% 78.7%) confermati sierologicamente Sequenze su 43 campioni clinici: 40 genotipo 1B 3 genotipo 1A

10 Curva epidemica con tre picchi, il primo subito dopo Natale Casi sospetti (n. 188) Casi confermati (n. 694) Studio caso-controllo : consumo di molluschi maggiore fattore di rischio (O.R.= 3.1; C.l. 95%) casi Week settimana

11 Campionamento nei punti vendita di differenti aree della Campania da marzo a luglio Totale campioni analizzati: 138 Campioni positivi: 11 (8%) Sequenze : 9 genotipo 1A* 3 genotipo 1B* * 1 campione con contaminazione multipla

12 10 su 11 campioni positivi > periodo marzo giugno 1 in luglio 55% dei positivi raccolti dalle 2 aree costali con tasso di attacco più alto (54.3/ abitanti)

13 Sequenze da campioni clinici Sequenze da molluschi

14 Conferma dei molluschi come maggiore fattore di rischio nella trasmissione dell HAV Conferma della co-circolazione di differenti ceppi nella stessa area geografica Evidenza di pratiche di manipolazione del prodotto non corrette in 5 degli 11 campioni positivi

15 1 anno (giugno giugno 2004) 235 campioni (T. philippinarum e M. galloprovincialis) aree di produzione B; differenti siti dell alto Adriatico Analisi per : E. coli - Salmonella spp. HAV NoV Sequenziamento e analisi filogenetica

16 parametri batteriologici e parametri virologici E. coli (MPN/100g) samples viral contamination HAV+ NoV+ HAV+ NoV+ n n % n % n % n % < > tot

17 Total Ostrea spp Chlamys spp Mytilus galloprovincialis Tapes philippinarum % n % n % n % n % n n HAV+ NoV+ NoV+ HAV+ viral contamination E. coli > 230/100g samples analyzed Species

18 sequenze e analisi filogenetica virus HAV: sequenziati 5 su 18 genotipo 1A NoV: sequenziati 31 su Hawaii 7 Melksham 7 GGIIb 3 Lordsdale GG II

19 sequenze e analisi filogenetica virus

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21 Classificazione (fonte: Vibrionacee: Vibrio (72 specie) Allomonas Catenococcus Enterovibrio Ferrania Grimontia Listonella Photobacterium Salinivibrio

22 Genere VIBRIO Bacilli Gram-negativi con dimensioni comprese tra 0,5 e 0,8 m in lunghezza, di forma talvolta leggermente ricurva e mobili per la presenza di un flagello polare monotrico o multitrico, racchiuso in un rivestimento continuo con la membrana esterna della parete cellulare. metabolismo fermentativo (talvolta con produzione di gas) e ossidativo non producono spore ossidasi-positivi (ad eccezione di V. metschnikovii) Fattori più importanti per lo sviluppo: temperatura delle acque (10-30 C) e salinità (5-30 )

23 Sopravvivenza dei vibrioni nell ambiente marino In condizioni avverse subiscono modificazioni morfologiche e fisiologiche, pur mantenendo la loro patogenicità (fase di quiescenza): si riducono di dimensioni (da 15 a 300 volte) modificano il loro metabolismo, orientandosi verso vie metaboliche in grado di evitare danni strutturali indotti da carenze di determinati nutrienti arrestano i cicli di divisione

24 Vibrioni patogeni associati a infezioni umane Specie Vibrio Cute (ferite) App. Digerente Orecchio Sito di infezione Sangue (setticemia) Sangue (batteriemia) App. respiratorio S.N.C. (meningi) 1 V. cholerae O1/O (+)????? V. cholerae non O1/ non (+) (+)? (+) O139 2 V. parahaemolyticus ++ + (+)? (+) (+) (+) 3 V. vulnificus + ++? ++ + (+) (+) 4 V. fluvialis ++?????? 5 V. alginolyticus? ++ +? (+)?? 6 Ph. damsela? ++????? 7 V. furnissii (+)?????? 8 V. hollisae ++?? (+)??? 9 V. mimicus ???? 10 V. metschnikovii (+)?? (+)??? 11 V. cincinnatiensis???? (+)? (+) 12 V. carchariae? ++????? ++ : il più comune sito di infezione, + : altri siti di infezione, (+) : raro sito di infezione,? : da stabilire. (da West, 1989, e integrata con informazioni da Oliver and Kaper, 1997).

25 V. cholerae Sierogruppo O1: colera epidemico biotipo Classico: 6 pandemie /1923 biotipo ElTor: settima pandemia Sierogruppo O139 (prima comparsa 1992) Enterotossina colerica -> diarrea secretoria; l incubazione è _di ore Dose infettante: 10 8 _ipocloridria, ) unità (inferiore in pazienti con

26 V. parahaemolyticus Concentrazione media nei prodotti della pesca: < 10 3 u.f.c./g, più alta in molluschi provenienti da acque molto calde (non facilmente rintracciabile a temperature inferiori a 20 C) Tempo di replicazione molto breve (<12 minuti in condizioni ottimali) Tipi: Kanagawa + (produttori di emolisina termostabile diretta, tdh) Kanagawa - (talvolta produttori di emolisina correlata al tdh, trh) Emolisine -> gastroenterite acuta; incubazione 4-96 ore Dose infettante (studi su volontari): maggiore di 10 5 unità col tipo Kanagawa +

27 V. vulnificus Concentrazione media nei prodotti della pesca: <10 3 u.f.c./g (fino a 10 5 u.f.c./g in acque calde) Presente anche in acque fredde (isolato dalle acque costiere della Nuova Scozia ed Olanda) Fattori di virulenza (Citolisine, ecc.) -> febbre e nausea, lesioni cutanee, setticemia; tempo di incubazione ca. 38 ore. Letalità: 40-60% Dose infettante: 10 3 u.f.c./g; inferiore in individui a rischio, ad es. con malattie epatiche, diabete, stati di immuno-depressione, neoplasie

28 Ricerca di Vibrio negli alimenti (metodiche classiche) Metodo FDA Bacteriological Analytical Manual 8 th edition, 1995 Metodo ISO 8914:1990 per Vibrio parahaemolyticus Identificazione biochimica

29 Necessità Armonizzazione e standardizzazione delle tecniche di determinazione ed enumerazione Ottimizzazione delle tecniche di caratterizzazione della tossigenicità

30 Colony hybridization V. cholerae FDA-BAM ctxab DIG-labelled probe V. parahaemolyticus tlh AP-probe/ DIG-labelled probe tdh AP-probe/ DIG-labelled probe trh DIG-labelled probe V. vulnificus vvh AP-probe/ DIG-labelled probe

31 Colony hybridization FDA-BAM Preparazione del campione e diluizioni decimali Inoculo su T 1 N 3 o VVA e incubazione Preparazione del filtro e ibridazione: trasferimento delle colonie lisi asciugatura in microonde neutralizzazione lavaggi trattamento con proteinasi K ibridazione sviluppo di colore

32 Metodo di ibridazione con sonda tlh Vibrio parahaemolyticus (positivi) Vibrio spp. (negativi) attesi ottenuti attesi ottenuti Totale 1 replica 36 (+3) 30 (+3) 83.3% % 106 (+3) 2 replica 44 (+3) 38 (+3) 86.3% % 113 (+3)

33 Considerazioni Alta specificità della sonda tlh (FDA-BAM) Capacità di evidenziare la maggior parte dei ceppi (falsi negativi sono stati ottenuti per ceppi isolati dal M.Adriatico, Africa e da altre aree) Sviluppo di una sonda alternativa (toxr probe)

34 Metodi di PCR per la determinazione di V. parahaemolyticus PCR: toxr (Kim, 1999) gyrb (Venkateswaran, 1998) pr72h (Lee, 1995) tlh (Bej, 1999) Ceppi Vibrio: 131 ambientali 10 di riferimento Risultati: la PCR per il gene toxr ha evidenziato tutti i ceppi di V.parahaemolyticus (confermati dal sequenziamento del rdna 16s) gli altri metodi hanno dato falsi positivi

35 Vibrio vulnificus Metodo di ibridazione con sonda vvh (FDA- BAM): 3 ceppi di riferimento di V. vulnificus 10 ceppi diversi di Vibrio spp. I risultati ottenuti comprovano un ottima resa

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