La rete dei laboratori diagnostici di riferimento

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1 La rete dei laboratori diagnostici di riferimento Marina Barba CREA- Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale- ROMA 1

2 Il Decreto Legislativo 19 agosto 2005, n. 214! "Attuazione della direttiva 2002/89/CE concernente le misure di protezione contro l'introduzione e la diffusione nella Comunità di organismi nocivi ai vegetali o ai prodotti vegetali! Introduce la rete laboratoristica nazionale (RLN) e definisce il ruolo del laboratorio nazionale di riferimento (LNR)! LRN! Laboratori dei servizi fitosanitari regionali Laboratori pubblici e privati ufficialmente riconosciuti dai servizi

3 I laboratori della rete nazionale REQUISITI TECNICI 1- Personale 2- Ambiente di lavoro 3- Protocolli di diagnosi 22/09/15 3

4 REQUISITI TECNICI 1- Personale Il personale deve essere addestrato, aggiornato e organizzato in funzione della diversa professionalità 22/09/15 4

5 Organizzazione corsi Lezioni teoriche Laboratorio 22/09/15 5

6 REQUISITI TECNICI 2- Ambiente A- Organizzazione idonea dei locali (ricevimento campioni, preparazione campioni, diagnosi, stoccaggio materiale, stoccaggio campioni, etc.) B- Controllo condizioni ambientali che possono influenzare la qualità della diagnosi C- Idonea gestione dei patogeni da quarantena 22/09/15 6

7 REQUISITI TECNICI 3- Protocolli di Diagnosi Il laboratorio DEVE utilizzare protocolli di riferimento VALIDATI, quando disponibili (EPPO standard, standards nazionali, regionali). Se non disponibili deve procedere a validare esso stesso dei protocolli. 22/09/15 7

8 VALIDAZIONE di un PROTOCOLLO DIAGNOSTICO - sensibilità analitica - specificità analitica - ripetibilità - riproducibilità 22/09/15 8

9 REQUISITI PER LA DIAGNOSI CAMPIONI STANDARD: A- CERTIFICATI: provenienti da una fonte certa (fonte riconosciuta internazionalmente o collezioni nazionali), codificato e con una tracciabilità B- DI RIFERIMENTO : devono essere documentati ed idonei per il test. Possono consistere in campioni biologici o preparazioni di acidi nucleici. 22/09/15 9

10 Compiti del LRN:! 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali! 2. Trasferire i protocolli ufficiali a tutti i laboratori della rete! 3. Formare ed aggiornare il personale della rete laboratoristica! 4. Mantenere una collezione di patogeni di riferimento! 5. Organizzare test inter-laboratorio (PT e RT)! 6. Fornire supporto tecnico-scientifico alle autorità competenti! Armonizzazione di tutti i partner coinvolti in diagnosi ufficiali e nel controllo fitosanitario

11 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali! Il Mipaaf ha finanziato negli ultimi anni alcuni progetti per la messa a punto di protocolli ufficiali per la diagnosi di agenti patogeni coperti da norme fitosanitarie.! Quali patogeni? Malattie emergenti Patogeni per i quali non esisteva un protocollo ufficiale Patogeni che rappresentavano un problema fitosanitario Spedito un questionario a tutti i S.F.R. 11

12 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)! Phytoplasmi Candidatus Phytoplasma prunorum Candidatus Phytoplasma mali Funghi - Tilletia indica - Monilinia fructicola - Phytophthora ramorum - Gibberella circinata - Ceratocystis platani - Funghi terricoli: Chondrostereum pupureum, Verticillium dahlie, V. albo-atrum, Armillariella mellea, Nectria galligena, Phytophthora cactorum Virus e viroidi Plum pox virus - PPV Potato Spindle Tuber Viroid - PSTVd Grape viruses (GLRaV 1, 2, 3, GVA, GVB, GFLV, ArMV, GFkV); Pepino mosaic virus - PeMV Tomato infectious chlorosis virus - TIC and Tomato chlorosis virus ToCV Batteri Erwinia amylovora Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Xanthomonas arboricola pv. pruni 12

13 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)! METODO DI LAVORO q Gruppo di lavoro:! - Scelta di protocolli diagnostici da sottoporre a valutazione e validazione secondo criteri internazionali (UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005).! - Discussione dei risultati e calcolo dei parametri di validazione: scelta finale del protocollo(i)!! q Test interlaboratorio con i laboratori della rete nazionale (SS.FF.RR.) per stabilire il parametro di riproducibilità e aumentare la robustezza e armonizzazione del metodo!

14 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)! Un esempio. PROTOCOLLO DIAGNOSTICO PER I Virus della vite coperti da norme fitosanitarie Gruppo di lavoro Ø CRA-PAV Ø CRA-VIT Ø CNR-IVV Bari Ø CNR-IVV Gugliasco Ø Università di Milano Ø Università di Bologna Ø Università di Pisa Ø FEM-IASMA Ø ERSA - FVG Ø CAV - Faenza Ø CRSFA - Locorotondo Ø IPAD -Lodi Ø VCR - Rauscedo 14

15 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)! Laboratori della rete laboratoristica nazionale che hanno preso parte al Ring test Ø Ø Ø Ø Ø SFR Trentino (Laimburg)! SFR Emilia Romagna! SFR Lombardia! SFR Valle d Aosta! SFR Friuli Venezia Giulia (ERSA)! 15

16 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)! METODOLOGIE SCELTE E SOTTOPOSTE A VALIDAZIONE ELISA con antisieri Agritest (8), Bioreba (9), Sediag (8)! Virus: GLRaV 1, 2, 3, GVA, GVB, GFLV, ArMV, GFkV! Multiplex RT-PCR rif. Gambino G. and Gribaudo I Phytopathology 96 (11): )! Estrazione Kit commerciale,! Virus: GLRaV 1, 2, 3, GVA, GVB, GFLV, ArMV, GFkV! 16

17 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)! CAMPIONAMENTO La matrice vegetale da utilizzare per tutti i protocolli è il floema prelevato da tessuto sottocorticale Periodo di prelievo: durante tutto il periodo di dormienza Tipologia: tralci lignificati di un anno. 2 porzioni legnose prelevate nella parte basale. Conservazione: i campioni da saggiare devono essere conservati asciutti, posti in buste di plastica e conservati in luogo fresco fino all utilizzo Tracciabilità: ogni campione deve essere etichettato sulla busta e sulla pianta Spedizione: i campioni devono essere consegnati al laboratorio diagnostico entro 72 ore dal prelievo in pacchi refrigerati 17

18 Lista dei campioni (122) e loro stato sanitario 1 GLRaV 1 + GLRaV 2 + GLRaV 3 + GVA+ GFkV 2 GVA 3 GVB 4 SANO 5 SANO 6 SANO 7 GLRaV3 + GVA 8 GFLV 9 GFkV 10 POOL DA 42 (GLRaV1, GVA,GFLV) 11 GLRaV 3, GFLV 12 GVA, GLRAV1, GLRaV3 13 ArMV, GFLV, GLRaV1 14 GLRaV-1 15 POOL DA 107 (GLRaV1) 16 sano 17 POOL DA 106 (GFKV) 18 ArMV 19 ArMV (GRSPaV) 20 GVA, GRLaV2, GLRaV3 21 GLRaV-3+GVA 22 GLRaV-1, GFkV, GFLV 23 SANO 24 SANO 25 GVA + GFLV 26 GLRaV-1 GLRaV-3 GVA 27 POOL DA 93 (GFLV) 28 GFkV 29 sano 30 GLRaV 3 31 GVA 32 SANO 33 sano 34 SANO 35 ArMV, GFLV, GFKV, GLRaV1, GVA 36 POOL DA 63 (GLRaV2-3, GVA) 37 GLRaV 2 + GFkV 38 POOL DA 66 (GLRaV2, GLRaV3,GVA) 39 GLRaV-1 40 ArMV 41 GVA GFkV GLRaV-3 42 GFLV + GLRaV1 + GVA 43 POOL 22/09/15 SANO 44 GLRaV1 45 GLRaV3 46 SANO 47 SANO 48 POOL DA 18 (ArMV) 49 SANO 50 GLRaV 3, GFkV, GFLV 51 SANO 52 sano 53 POOL DA 44 (GLRaV1) 54 SANO 55 GVA + GFkV +GLRaV-3+GLRaV2 56 GFLV 57 GLRaV3 58 SANO 59 GVA+GLRaV1+GFLV 60 sano 61 sano 62 Sano 63 GLRaV 2 + GLRaV 3 + GVA 64 POOL DA 12 (GVA,GLRaV1-3) 65 SANO 66 GLRaV 2, GLRaV 3 GVA 67 SANO 68 GLRaV 2 (isolato BD) 69 GFLV GFkV GLRaV-3 70 GFLV 71 GVA GFkV GLRaV-3 72 GFkV+ GLRaV 2 + GLRaV 3 + GVA 73 GFkV 74 POOL DA 1 (GLRaV1-2-3,GVA,GFkV) 75 ArMV, GFKV 76 GLRaV2 GLRaV3 77 GFkV + GLRaV2 78 GFLV, GFKV 79 GLRaV3 80 GLRaV1 81 SANO 82 Sano 83 SANO POOL 84 SANO 85 sano 86 Sano 87 GVA, GRLaV2, GLRaV1 88 GLRaV2 (isolato BD) 89 SANO 90 GLRaV-1 e GVA 91 GFLV, GLRaV 3 92 GLRaV 1-3 e GVA 93 GFLV 94 SANO 95 ArMV 96 GVA 97 SANO 98 sano 99 sano 100 SANO 101 SANO 102 GFLV GFkV GLRaV GLRaV 2 (isolato BD) 104 GFkV, GLRaV3 105 GFKV 106 GFkV 107 GLRaV1 108 GVA 109 sano 110 SANO 111 GLRaV 3 + GVA 112 GLRaV 3, GVA, GFLV 113 GFKV 114 GLRaV 2 (isolato RG) 115 POOL DA 70 (GFLV) 116 POOL DA 112 (GLRaV3, GVA, GFLV) 117 POOL GFLV 118 POOL DA 72 (GFKV, GLRaV2-3,GVA) 119 POOL DA 95 (ArMV) 120 POOL DA 25 (GVA,GFLV) 121 POOL DA 71 (GVA, GFKV,GLRaV3 122 POOL DA 113 (GFKV) I campioni sono stati analizzati in forma anonima dai laboratori 18

19 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)! PARAMETRI DI VALIDAZIONE CALCOLATI Sensibilità diagnostica Specificità diagnostica Sensibilità analitica Ripetibilità Riproducibilità Campioni di riferimento target Campioni di riferimento non target ISO 17025; ISO (2003) EPPO Diagnostics PM7/76 e PM7/98 19

20 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)! RISULTATI METODO ELISA Parameter Sensitivity Specificity Accurancy Repeatability Reproducibility Sensitivity pool Specificity pool Accurancy pool Repeatability pool AGRITEST GLRaV1 GLRaV2 GLRaV3 GFKV ArMV GFLV GVA GVB nt nt nt nt 20

21 RISULTATI METODO MOLECOLARE VIRUS/PARAMETER Sensitivity Specificity Accuracy Analytical sensitivity Repeatability Reproducibility GLRaV-1 74% 100% 94% % 70% GLRaV-2 84% 98% 85% % 83% GLRaV-3 100% 93% 95% % 100% GVA 96% 99% 98% % 94% GVB 100% 100% 100% % 100% ArMV 92% 99% 98% % 100% GFLV 68% 100% 90% % 76% GFkV 95% 95% 95% % 95% TOTAL 89% 98% 95% 99% 90% 21

22 ARNADIA: Grapevine-RING TEST ACCURACY Accuratezza relativa: il valore risultante dal calcolo della sensibilità diagnostica e della specificità diagnostica; OPTIMAL ACCURACY HIGH ACCURACY MEDIUM ACCURACY POOR ACCURACY :ELISA-A; 2:ELISA-B; 3:ELISA-S; 4:multiplex RT-PCR

23 2. Trasferimento dei protocolli ufficiali a tutti i laboratori della rete Protocolli includono: q q q q Descrizione della malattia Campionamento: ü Numero di campioni! ü Periodo! ü Matrice! Descrizione del metodo Punti critici del metodo Sito istituzionale Pubblicati su PETRIA

24 3. Formazione del personale della rete 1. Organizzazione di meeting/stage per il personale del settore (es.) Il settore fitosanitario e l EPPO: contributi e criticità, Roma 23 febbraio Convegno Potato spindle tuber viroid nel settore del vivaismo ornamentale: risultati di tre anni di ricerca e messa a punto di un modello di gestione aziendale certificante per piante viroid-free. Sabaudia 25 Maggio Organizazione di corsi di formazione teorici(es.) Corso di formazione per ispettori fitosanitari del Lazio Corso di formazione per ispettori fitosanitari della Sicilia 3. Organizazione di corsi di formazione pratici (lab) es. Phytophthora ramorum: PCR/nested PCR Ceratocystis platani : real time PCR Potato spindle tuber viroid : RT-PCR and real time RT-PCR 24

25 4. Mantenimento di collezioni ufficiali di isolati patogeni di riferimento! Col.Mia: collezione di riferimento Italiana per i microrganismi La collezione contiene riferimenti dettaglaiti di più di microorganismi sia di interesse agro-industriale, sia fitopatogeni, entomopatogeni e del suolo COLMIA è membro del World Federation for Culture Collection (WFCC) con il numero WDCM945. Informazioni dettagliate disponibili sul sito: 25

26 5. Organizzare test inter-laboratorio (PT e RT)!! Quali patogeni? Malattie emergenti Patogeni per i quali esiste un protocollo ufficiale Patogeni che rappresentano un problema fitosanitario Spedito un questionario a tutti i S.F.R. 26

27 Il Laboratorio di riferimento nazionale DEVE essere accreditato secondo ISO ACCREDIA è l ente nazionale accreditatore CREA-PAV ha fatto domanda per l accreditamento dei seguenti protocolli:! ELISA per la diagnosi di Plum pox virus e di Pepino mosaic virus! RT-PCR per la diagnosi di Pospiviroidi! PCR per la diagnosi di Monilinia fructicola! Real time PCR per la diagnosi di Guignardia citricarpa! PCR per la diagnosi di Pseudomonas syringae pv actinidiae! PCR per la diagnosi di Clavibacter michiganensis pv michiganensis!

28 Organigramma:! DIRECTOR TECHNICAL AREA MANAGERs QUALITY MANAGER LABORATORY TECHNICIANS Criticità: Alti costi per ottenere e mantenere lo status di ACCREDITAMENTO Gestione tecnica (tarature strumenti ecc.) Problemi amministrativi (la gestione riguarda tutto il CRA- PAV) Gestione di un laboratorio dove vengono svolte anche altre attività non in Accredia o di ricerca Nessun problema: per eseguire le procedure di validazione

29 6. Fornire supporto tecnico-scientifico alle autorità competenti!! Il Laboratorio di Riferimento fornisce supporto tecnico-scientifico al Mipaaf riguardo: - Gestione delle malattie emergenti - Raccolta dei dati di monitoraggio - Caratterizzazione molecolare dei patogeni coperti da normativa fitosanitaria - Competenza scientifica per l emanazione di provvedimenti ufficiali nei confronti di agenti patogeni di quarantena - Valutazione di PRA

30 In conclusione È in fase di pubblicazione il decreto per il riconoscimento dei laboratori che a vario livello faranno parte della rete laboratoristica nazionale Il laboratorio nazionale di riferimento farà parte della rete laboratoristica europea dei laboratori di riferimento 22/09/15 30

31 In conclusione L EPPO svolge un ruolo di estrema importanza nella armonizzazione dei vari aspetti che riguardano i protocolli di diagnosi e le norme relative all accreditamento dei laboratori Dal 7 all 11 settembre il CREA-PAV ospiterà il 3 workshop riservato ai responsabili dei laboratori europei di riferimento 22/09/15 31

32 In conclusione Una efficiente rete laboratoristica nazionale È alla base di una corretta e tempestiva diagnosi Riduce il rischio di contenziosi Consente di uniformare quanto più possibile le procedure di analisi su tutto il territorio Eleva la qualità dei laboratori responsabili delle analisi ufficiali Favorisce la professionalità e l aggiornamento degli operatori 22/09/15 32

33 Grazie 22/09/15 per l attenzione 33

34 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)! PARAMETRI DI VALIDAZIONE CALCOLATI (ISO 17025; ISO (2003) - EPPO Diagnostics PM7/76 e PM7/98): Sensibilità diagnostica: capacità del metodo utilizzato di rilevare la presenza del patogeno nei campioni sicuramente infetti dal patogeno in esame; Specificità diagnostica: capacità del metodo utilizzato di NON rilevare la presenza del patogeno nei campioni non infetti dal patogeno in esame; Sensibilità analitica: la più piccola quantità di entità infettiva che può essere identificata dal metodo diagnostico (nel caso di patogeni virali vegetali, che non possono essere quantificati in vitro, corrisponde alla diluizione limite dell estratto iniziale nella quale il metodo utilizzato riesce ad individuare il patogeno); Ripetibilità : grado di conformità dei risultati ottenuti in replicazioni, effettuate a intervalli brevi di tempo, del metodo utilizzando lo stesso campione di riferimento e nelle stesse condizioni di lavoro (strumentazioni, operatore, laboratorio); Riproducibilità : grado di conformità dei risultati ottenuti utilizzando lo stesso metodo con gli stessi campioni di riferimento in diversi laboratori. Tutte le prove di validazione sono state effettuate utilizzando una serie di campioni di riferimento: Campioni di riferimento target : campioni infetti da isolati che coprono la diversità genetica, la distribuzione geografica e le eventuali diverse specie ospiti del patogeno. Campioni di riferimento non target : campioni infetti da patogeni simili che colpiscono la stessa specie ospite, da patogeni geneticamente correlati (nel caso dei virus vegetali stesso genere), campioni non infetti appartenenti alla stessa specie ospite. 34