Sport and Hormones. Which test for doping trials? Costanzo Moretti

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Guglielmo Mantovani
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1 Sport and Hormones Which test for doping trials? Costanzo Moretti Section of Reproductive Endocrinology Fatebenefratelli Hospital Tiber Iland Dpt of Internal Medicine University of Rome TorVergata

27 Dicembre 2001 L Ufficio della Procura Antidoping deferisce JGS a seguito di controllo antidoping eseguiti nell ottobre e novembre 2001 dimostranti un superamento della soglia WADA (2 ng/ml) per il

Processo sportivo di revisione a Sezioni Unite assolve JGS dalle incolpazioni ascrittegli Enciclopedia dello Sport Treccani Centrocampista 7 Gennaio 2002 dal passo cadenzato, dedito alla regia ed

2 27 Dicembre 2001 L Ufficio della Procura Antidoping deferisce JGS a seguito di controllo antidoping eseguiti nell ottobre e novembre 2001 dimostranti un superamento della soglia WADA (2 ng/ml) per il nadrolone 8 Febbraio 2002 Commissione d appello federale della FIGC respinge l appello e dispone controlli a sospesa per 6 sei a decorrere dal termine della squalifica Pep Guardiola 8 Maggio 2009 Processo sportivo di revisione a Sezioni Unite assolve JGS dalle incolpazioni ascrittegli Enciclopedia dello Sport Treccani Centrocampista 7 Gennaio 2002 dal passo cadenzato, dedito alla regia ed alla confezione Condanna geometrica a 4 mesi del di gioco...diventa sospensione un punto di riferimento oltre che un simbolo dalla del FC attività Barcellona. agonistica e Vi rimane euro per undici anni, fino all estate 2001, collezionando numerosi successi ed una sconfitta bruciante: quella ad Atene nella finale di Champions League contro il Milan nel Guida la Nazionale Olimpica akka vittoria nel Nell Ottobre 2001, appena ingaggiato dal Brescia, viene implicato in una vicenda di doping. 6 Febbraio 2007 Il Laboratorio della FMSI suggerisce in ottemperanza a quanto suggerito dalla WADA, di eseguire l esecuzione di un test di stabilità sul campione di urine da esaminare 21 Luglio 2005 Condanna da parte del Tribunale di Brescia a 7 mesi di reclusione e 9000 Euro di multa con il beneficio della sospensione condizionale della pena per anni cinque 30 Novembre 2007 Corte d Appello di Brescia assoluzione di JGS dal reato ascrittogli perchè il fatto non sussiste 29 Ottobre 2008 Anche il Tribunale di Roma Ottava Sezione Penale conferma la sentenza del Tribunale di Brescia

3 ng/ml nandrolone 10 Il caso Guardiola La World anti-doping agency (WADA) ha divulgato le linee guida per determinare quale atleta deve raccogliere il campione di urine, le regole per evitare manomissioni nella raccolta, la catena di custodia dei protocolli, i cutoff di concentrazione di varie sostanze al di sopra del quale viene identificata una condizione di doping 2 Soglia WADA Valori medi riscontrati in JGS Soglia WADA che rende obbligatoria la verifica di stabilità del campione

4 Localizzazione dei 35 Laboratori accreditati della World Anti-Doping Agency (WADA)

5 Lista WADA 2009 degli androgeni e dei modulatori degli androgeni proibiti

6 Androgeni e cellula muscolare Linea miogenica Linea adipogenica Singh R et al. Endocrinology (2003) 144:

7 Rigore nella metodologia Condanna inflessibile per chi si è dopato Tutela della immagine e della privacy

8 Correlare il dato analitico alla condizione clinica!

9 Lean mass/kg DXA età 25± ±8.24 n=24 **p<0.01 **p< ±6.4 n=18 **p< ±4.4 n= ±5.4 n= ± ± ±4.7 Builders Nature Builders + ANAB Soccer Prof Soccer Amat Sedentari maschi Sedentarie donne Sedentarie CAIS

10 Procedura analitica iniziale : la raccolta del campione di urine La procedura di raccolta delle urine è molto importante in quanto può influenzare i futuri risultati L atleta deve dichiarare tutti gli eventuali medicamenti assunti nei giorni precedenti La raccolta deve essere eseguita a vista sotto diretta supervisione di personale accreditato Il campione viene suddiviso in due contenitori segnati A e B Deve essere valutati volume, densità, ph e peso specifico. Il valore del ph si può collegare alla degradazione ed alla stabilità del campione, il peso specifico a valutare il tentativo di diluizione del farmaco Il Lab non deve conoscere il nome dell atleta e lavora su codice. In caso di positività del campione A deve essere ripetuta l analisi sul campione B

11 Effetto ergogenico del testosterone come dimostrato dalle correlazioni doserisposta tra testosterone e massa e forza muscolare Bhasin S et al. Am J Physiol Endocrinol Metab 81:

13 Metodologia analitica per il dosaggio degli steroidi

14 Rapporto testosterone/epitestosterone L epitestosterone (17 -idrossi-4-androsten-3-one) è un epimero del testosterone che è prodotto sia nei maschi che nelle femmine attraverso pathways biologiche indipendenti da quelle del testosterone. La assunzione di testosterone esogeno da parte di un atleta non ha effetto sulla concentrazione di epitestosterone. Un rapporto T/E >4 identifica nel campione una presunzione di positività per la assunzione di testosterone esogeno ed apre alla necessità di eseguire tests di conferma

15 Come confermare il dato di positività alla assunzione di testosterone esogeno verificato attraverso un rapporto T/E>4? 1 Generalmente in atleti che non usano steroidi anabolizzanti il rapporto T/E rimane costante. Il criterio di uniformità deve essere creato raffrontando analisi su campioni raccolti in identiche condizioni ambientali e di stile di vita 2 Basaria S JCEM 95: ,2010 Analisi attraverso Isotope ratio mass spectrometry (IRMS) che prevede la misura del rapporto isotopico 13C/12C nel testosterone. La percentuale di 13C nel testosterone endogeno sintetizzato da fonti di carbonio derivanti da animali e piante è maggiore rispetto a quello del testosterone sintetico che presenta un più basso rapporto 13C/12C. In questa analisi gli steroidi sono separati attraverso gas-cromatografia ed ossidati a biossido di carbonio in una camera di combustione. L analisi può avere la possibilità di risultati falsamente negativi (1%)

16 Rapporto T/E AMINOACIDI Sharp CP et al J Strenght Cond Res 2010 Apr 24, 4: Campione urine RESISTANCE TRAINING Uchida MC et al J Strenght Cond Res 2009 Oct 23, 4: FEEDING L-CARNITIN Kraemer WJ et al Med Sci Sports Exercise 206 Apr 24, 4: FALSO SUPERAMENTO DELLA SOGLIA

17 Dosaggio biologico degli androgeni: possibilità di identificare anche le sostanze anabolizzanti la cui struttura chimica è ignota 1 Receptor binding assay valuta la capacità della sostanza di legarsi al recettore androgenico (AR) in presenza di un ligando radioattivo per AR 2 Cell Proliferation assay misura della bioattività di una sostanza grazie alla sua capacità di far proliferare linee cellulari androgeno-dipendenti 3 Reporter gene assay in questo dosaggio la bioattività del composto è misurata dal grado di espressione di un gene reporter

18 Determinazione dell abuso di GH nell atleta Difficoltà 1. Impossibile la differenziazione tra (r)hgh e GH endogeno 2. Breve emivita e secrezione pulsatile 3. Si eleva in caso di stress ed esercizio fisico 4. Isoforme circolanti: 70% 10% Immunoassay Debbono riconoscere differenti epitopi (IRMA) Stabilità ed accuratezza Markers GH-dipendenti IGF-1 IGFBP-2 IGFBP-3 A LS (subunità acido-labile) Procollagenetipo III Osteocalcina Propeptide C-ter del procollagene tipo1 Telopeptide del collagene tipo 1

21 GENI TARGET

22 Strategie per la loro identificazione

23 Conclusioni 1. Una maggiore conoscenza delle condizioni costituzionali di chi pratica lo sport sia a livello amatoriale che professionistico sarebbero di aiuto a chi deve attuare i trials necessari per smascherare il doping 2. L attenzione che ha avuto l abuso di steroidi anabolizzanti dovrebbe essere usata come una opportunità per educare sia gli atleti che la popolazione in generale sui loro gravi effetti avversi. Le tecniche usate (GC/MS e IRMS) devono migliorare in particolare in relazione ai falsi positivi e negativi ed alla correlazione dei dati con lo stato dell asse HPG per poter attuare questo programma 3. Il GH è ampiamente utilizzato come doping dagli atleti in relazione alle sue attività anaboliche e lipolitiche. Le metodologie di dosaggio grazie allo studio dei markers proteici porteranno a scoraggiare il suo uso 4. Esistono grandi rischi nella manipolazione genica legata al doping. Questo rende indispensabile affinare i metodi di rilevazione ed educare la comunità di chi pratica sport

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