Simplexa Group A Strep Direct

Transcript

1 REF MOL2850 Rev. C (Italiano) Saggio PCR in tempo reale per il rilevamento qualitativo in vitro del DNA batterico dello streptococco di gruppo A. Per uso diagnostico in vitro Complessità CLIA Moderata Solo su prescrizione medica USO PREVISTO Il saggio Strep Direct di Focus Diagnostics deve essere utilizzato con lo strumento 3M Integrated Cycler per il rilevamento qualitativo in vitro dello streptococco di gruppo A (SGA), da tamponi faringei di pazienti umani con segni e sintomi di faringite, come in caso di mal di gola. Il test è destinato a facilitare la diagnosi di infezione da streptococco di gruppo A. Il saggio è inteso per un utilizzo in ospedale o in laboratorio statale o di riferimento. Il dispositivo non è inteso per l uso point-of-care. RIASSUNTO E SPIEGAZIONE Lo pyogenes, noto anche come di Gruppo A, è un batterio beta-emolitico che appartiene al sierogruppo A di Lancefield. 1 Lo di gruppo A rappresenta la causa principale di faringite batterica acuta ed è responsabile del 15-30% dei casi di faringite acuta nei bambini e del 5-20% dei casi negli adulti. 2,3 La faringite acuta può essere causata anche da virus, quali adenovirus, virus dell'influenza, virus della parainfluenza, rinovirus e virus sinciziale respiratorio. 4 I sintomi della faringite acuta batterica e di quella virale sono ampiamente sovrapponibili e possono essere spesso molto difficili da differenziare. La corretta identificazione dell'infezione da streptococco di gruppo A permette di trattare efficacemente la malattia con antibiotici. Se non viene diagnosticato e trattato, lo streptococco di gruppo A può causare numerose gravi complicazioni, incluse febbre reumatica, scarlattina, glomerulonefrite e sindrome da shock tossico da streptococco. 5,6,7 Il gold standard per la diagnosi della faringite da streptococco e la coltura da tampone faringeo, che presenta una sensibilità del 90-95%. 8 Tuttavia, per ottenere un risultato conclusivo, sono necessari 1-2 giorni. I test rapidi per la rilevazione dell'antigene (RADT, Rapid antigen detection tests) rilevano la presenza di carboidrati dello streptococco di gruppo A sulla superficie cellulare e possono fornire risultati da un tampone faringeo in minuti. Tuttavia, è stato osservato che i saggi immunologici RADT prodotti negli ultimi 10 anni presentano una buona specificità (95,0-98,7%) ma una sensibilità inferiore (90,6-97,6%) rispetto a una coltura; la necessità di confermare i risultati negativi tramite coltura di tampone faringeo varia quindi a seconda del rendimento. La tecnica di PCR in tempo reale è stata applicata con successo a saggi per la rilevazione dello streptococco di gruppo A da tamponi faringei. 9,10 Alcuni di questi saggi presentano un livello di sensibilità e di specificità paragonabili a quelli della coltura, ma richiedono l esecuzione da parte dell utente finale di una fase di estrazione del DNA. Il saggio Strep Direct è progettato per accorciare significativamente il tempo di risposta (o TAT, turnaround time) per la rilevazione dello streptococco di gruppo A. Strep Direct è un saggio PCR in tempo reale che amplifica il DNA dell'esotossina pirogena B dello streptococco di gruppo A a partire da un tampone faringeo in assenza della tradizionale procedura di estrazione del DNA. Il saggio Strep Direct è facile da effettuare e può essere completato in un'ora circa. Strep Direct permette un accurata identificazione dello streptococco di gruppo A senza necessitare di una conferma tramite coltura. PRINCIPI DELLA PROCEDURA Il saggio Strep Direct è un saggio PCR in tempo reale che permette l amplificazione diretta e la rilevazione qualitativa del DNA batterico dello streptococco di gruppo A da tamponi faringei che non sono stati sottoposti a estrazione dell'acido nucleico. Il sistema comprende: il saggio Strep Direct, il 3M Integrated Cycler (con Integrated Cycler Studio Software), il Direct Amplification Disc (DAD) e accessori associati. Nel saggio Strep Direct, delle sonde-primer bifunzionali fluorescenti vengono utilizzate congiuntamente ai primer inversi corrispondenti per amplificare il DNA batterico dello streptococco di gruppo A e il controllo interno (DNA IC). Il saggio è mirato a una regione conservata dello streptococco di gruppo A (gene della esotossina pirogena B) al fine di identificare tale batterio nel campione. L'uso del DNA IC permette di rilevare il mancato funzionamento e/o l'inibizione della PCR.

2 Pagina 2 MATERIALI FORNITI Il kit Strep Direct di Focus Diagnostics contiene reagenti sufficienti per 24 reazioni. Al ricevimento del materiale, conservare a temperature comprese tra -10 C e -30 C (non utilizzare un congelatore no-frost). Ogni flaconcino contiene materiale sufficiente per un singolo utilizzo. Utilizzare entro 30 minuti dall estrazione dal congelatore. Nome del componente Strep Direct Reaction Mix REF SIMBOLO CE SULL ETICHETTA Descrizione del kit Nome abbreviato Colore del tappo Numero di flaconcini Reazioni per flaconcino/kit Volume per flaconcino MOL2851 REAG A RM Marrone 24 1/24 50 µl Componente del kit Descrizione del componente Contenuto DNA polimerasi, tampone e dntp, DNA di controllo interno, primer marcati con colorante fluorescente specifici per il rilevamento dello streptococco di gruppo A e del controllo interno. Strep Direct Reaction Mix (RM) (miscela di reazione) Target Streptococco di gruppo A DNA di controllo interno (IC) Fluoroforo sonda (colorante) Eccitazione Emissione Gene bersaglio FAM Esotossina pirogena B Q N/A Strep Direct Barcode Card (scheda con codice a barre) Parametri specifici per il test e informazioni relative al lotto. MATERIALI FORNITI SEPARATAMENTE 1. Kit Direct Amplification Disc (REF MOL1455) a) Direct Amplification Discs per utilizzo su Integrated Cycler MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI 1. 3M Integrated Cycler con software Integrated Cycler Studio versione 6.0 o superiore 2. Strep Positive Control Pack (REF MOL2860) 3. Pipetta a volume fisso da 50 µl ( VWR Signature Fixed Volume Ergonomic High-Performance Pipettor Model VWR FE50 o equivalente) 4. Puntali per pipette monouso, sterili e privi di nucleasi con filtri (si raccomanda l uso di puntali Extra Long 91 mm per pipettare direttamente dalle provette primarie). 5. Congelatore (scongelamento manuale) impostato tra -10 e -30 C (per la conservazione, in condizioni di congelazione, dei componenti del kit e dei campioni) 6. Frigorifero da 2 C a 8 C (per i campioni) 7. Guanti monouso senza talco MATERIALI RACCOMANDATI 1. Tampone per terreno di trasporto Liquid Amies da utilizzare come controllo senza templato (NTC, No Template Control ) 2. Replacement Foil Wedges (REF MOL1550) MANIPOLAZIONE E STOCCAGGIO DEI REAGENTI 1. Conservare i reagenti ad una temperatura compresa tra -10 e -30 C (non usare un congelatore no-frost). 2. Prima dell uso, lasciare scongelare i reagenti a temperatura ambiente (tra 18 e 25 C circa). 3. Non utilizzare i kit o i reagenti dopo la data di scadenza. 4. Dopo aver tolto dal congelatore la miscela di reazione, iniziare il test entro 30 minuti. 5. Non agitare sul vortex la miscela di reazione. 6. Non ricongelare la miscela di reazione.

3 Pagina 3 AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Durante la manipolazione dei reagenti del kit, indossare dispositivi di protezione individuale quali, in modo non limitativo, guanti e camice da laboratorio. Lavarsi bene le mani una volta terminato il test. 2. Non fumare, bere, mangiare, manipolare lenti a contatto o truccarsi nelle aree in cui siano in utilizzo i reagenti del kit e/o campioni umani. 3. Smaltire i reagenti del kit non utilizzati e i campioni umani in base alle normative locali, provinciali e nazionali. 4. La contaminazione dei campioni dei pazienti o della miscela di reazione può determinare risultati errati. Utilizzare tecniche asettiche. 5. Utilizzare unicamente il protocollo descritto nel presente foglio illustrativo. Ogni deviazione dal protocollo o l uso di tempi o temperature diversi da quelli specificati possono comportare risultati errati. 6. L impostazione del saggio deve essere eseguita a temperatura ambiente (in un intervallo compreso tra 18 e 25 C). 7. Utilizzare pipette calibrate a volume fisso o equivalenti per trasferire il campione e la miscela di reazione. 8. Evitare di toccare il lato inferiore del foglio che entrerà in contatto con i pozzetti e la superficie del disco. 9. Per prevenire potenziali risultati errati, verificare che il campione e i reagenti vengano dispensati negli appropriati pozzetti di destinazione. 10. Prima di aprire il foglio del pozzetto adiacente, terminare il caricamento e applicare il foglio di copertura adesivo al pozzetto. 11. Avviare l analisi entro 30 minuti dal momento in cui si toglie il flaconcino della miscela di reazione dal congelatore. 12. Non tentare di riutilizzare un pozzetto che è stato utilizzato nelle sessioni precedenti o di rimuovere il foglio di copertura adesivo da un pozzetto che è stato utilizzato. 13. I dischi possono essere riutilizzati fino al completamento di tutti e 8 i settori. Smaltire i dischi usati senza rimuovere il foglio di copertura. Smaltire i dischi usati senza rimuovere il foglio di copertura in un contenitore per rifiuti a rischio biologico. 14. La miscela di reazione contiene una percentuale di glicerolo >1%, che può causare irritazione in caso di inalazione o contatto con la pelle. In caso di inalazione o contatto con la pelle, adottare le misure di primo soccorso. 15. Se la confezione o il suo contenuto appaiono rotti o danneggiati, non usarli e contattare Focus Diagnostics. I recapiti si trovano nell ultima pagina di questo documento. 16. La matrice spettrale deve essere installata in ogni 3M Integrated Cycler e non deve essere modificata a meno che Focus Diagnostics non fornisca un codice QR aggiornato per lo strumento. La matrice spettrale è specifica per ogni 3M Integrated Cycler. La matrice spettrale è stata fornita con lo strumento 3M Integrataed Cycler sulla copertina del manuale dell hardware di 3M Integrated Cycler. Se non si può scansionare o non si trova l'etichetta della matrice, contattare Focus Diagnostics. I recapiti si trovano nell ultima pagina di questo documento. 17. Se si modifica o se non si installa la matrice spettrale si possono ottenere risultati errati. ISTRUZIONI PER L USO A. PRELIEVO DEI CAMPIONI I tipi di campione accettabili sono tamponi faringei in terreni Amies: Numeri di catalogo Copan 480C e 481C o equivalenti. Utilizzare il tampone fornito con il terreno di trasporto. Non utilizzare tamponi in alginato di calcio, poiché possono contenere sostanze che inibiscono il test PCR. I tamponi faringei devono essere utilizzati entro 72 ore dal prelievo. B. IMPOSTAZIONE DELLO STRUMENTO PER PCR IN TEMPO REALE 1. Fare riferimento al manuale per l operatore di Integrated Cycler per configurare l Integrated Cycler Studio Software e per aggiungere la definizione di un saggio, impostare ed effettuare analisi su 3M Integrated Cycler. C. CARICAMENTO DEL DIRECT AMPLIFICATION DISC E AMPLIFICAZIONE MEDIANTE PCR IN TEMPO REALE NOTA: Non è necessario effettuare l estrazione del campione prima della fase di amplificazione mediante PCR. 1. Selezionare i campioni da analizzare. 2. Scongelare i flaconcini di miscela di reazione a temperatura ambiente (in un intervallo compreso tra 18 e 25 C circa). Usare un flaconcino di miscela di reazione per ogni campione da analizzare. 3. Effettuare la lettura del codice a barre del flaconcino di miscela di reazione Strep Direct o della card con codice a barre. 4. Effettuare la lettura del codice a barre del Direct Amplification Disc (DAD). 5. Effettuare la lettura o digitare il numero identificativo di ogni campione. 6. Staccare il foglio adesivo, un settore per volta, per esporre i pozzetti dei campioni (SAMPLE) e della miscela di reazione (R) senza rimuovere completamente il foglio di copertura adesivo (Figura 1 e 2). Evitare di toccare il lato inferiore del foglio che entrerà in contatto con i pozzetti e la superficie del disco. 7. Verificare che la miscela di reazione sia completamente scongelata. Centrifugare brevemente le provette se necessario. (Non agitare sul vortex la miscela di reazione.) 8. Utilizzare la pipetta a volume fisso per trasferire 50 µl della miscela di reazione nel pozzetto della miscela di reazione (R). 9. Utilizzare la pipetta a volume fisso per trasferire 50 µl di campione o controllo; pipettare il campione o il controllo nel pozzetto Campione (SAMPLE). 10. Coprire il settore sigillando i pozzetti con il foglio adesivo precedentemente staccato, premendo con fermezza in prossimità del bordo del disco. Se il foglio originale è lacerato, sostituirlo con un foglio sostitutivo per settore.

4 Pagina Rimuovere con cautela la linguetta del foglio di copertura a livello della perforazione. 12. Ripetere i passaggi da 6 a 11 per il/i campione/i successivo/i. 13. Caricare il DAD sigillato sul 3M Integrated Cycler e avviare l analisi. Figura 1 Disco con foglio sollevato, prima dell uso, per scoprire i pozzetti del campione e della miscela di reazione del settore N 3 Figura 2 Pozzetti del campione [SAMPLE] e della miscela di reazione [R] NOTE (a scopo informativo; non è necessaria alcuna azione/interpretazione da parte dell utilizzatore): 1. I kit Focus Diagnostics possono contenere un numero di versione relativo alle Assay Definitions (definizioni del saggio). In presenza di un numero di versione, esso verrà aggiunto alla definizione del saggio, ad esempio "Sample IVD Assay.2". Se esistono più versioni, il software utilizza automaticamente la definizione del saggio associata al numero di lotto scansionato. CONTROLLO DI QUALITÀ Strep Positive Control Pack (MOL2860) può essere utilizzato come controllo esterno per il controllo qualità, la formazione o la verifica delle prestazioni. Ogni laboratorio deve stabilire i propri intervalli per il controllo qualità e la frequenza di tali controlli, in base alle leggi e ai regolamenti locali applicabili e alle buone pratiche di laboratorio standard. Fare riferimento al foglio illustrativo di Strep Positive Control Pack (PI.MOL2860) per le istruzioni relative all'analisi del Controllo positivo. Tipo di controllo Risultati previsti per i controlli Streptococco di gruppo A Controllo interno (DNA IC) Strep Direct Positive Control 1 Rilevato1 Non applicabile 2 Controllo senza templato (NTC) Non rilevato Valido 1 I valori tipici del Ct per il controllo positivo sono compresi tra 25 e Non è necessaria la rilevazione del DNA di controllo interno (DNA IC) Simplexa per ottenere un risultato valido. RISULTATI Al termine della sessione, il software interpreta e mostra automaticamente i risultati. 1. Per ogni ID d'accesso (ID del campione) inserito, il software presenta un risultato ["Detected" (rilevato), "Not detected" (non rilevato) o "Invalid" (non valido)] per lo streptococco di gruppo A. a. Detected ( Rilevato ) indica la presenza del DNA di streptococco di gruppo A nel campione del paziente. b. Not Detected ( Non rilevato ) indica l'assenza del DNA di streptococco di gruppo A nel campione del paziente. c. Invalid ( Non valido ) indica l'impossibilità di determinare in maniera conclusiva la presenza o l'assenza del DNA di streptococco di gruppo A nel campione del paziente. Questo risultato può essere dovuto a 1) mancato funzionamento del controllo interno (IC) oppure a 2) mancato rilevamento di un volume sufficiente del campione. Il campione deve essere analizzato nuovamente. Vedere il paragrafo successivo Risultati non validi. d. EC500 indica un errore relativo alla qualità dei dati per quel particolare analita batterico. Il software non ha potuto determinare un amplificazione valida per l analita in questione. e. EC505 indica un errore relativo alla qualità dei dati per quel particolare analita batterico, Il software non ha potuto determinare un amplificazione valida per l analista in questione. Contattare l assistenza tecnica di Focus Diagnostics ai recapiti riportati sull ultima pagina di questo documento.

5 Pagina 5 2. Stampare il referto secondo le proprie necessità. a. Esportare i risultati secondo le proprie necessità. RISULTATI NON VALIDI In caso di risultato "Non valido o di un codice di errore, analizzare nuovamente il campione con un nuovo flaconcino di miscela di reazione proveniente dallo stesso kit o da un nuovo kit. Se non si riesce a risolvere il problema, contattare l assistenza tecnica di Focus Diagnostics. I recapiti si trovano nell ultima pagina di questo documento. LIMITAZIONI 1. Per uso diagnostico in vitro. Negli Stati Uniti, il prodotto è inteso per l uso in strutture sanitarie con una certificazione CLIA minima di complessità moderata. 2. Tutti i risultati derivanti da questo e da altri test devono essere correlati al quadro clinico, ai dati epidemiologici e ad altri dati disponibili ai fini della valutazione del paziente da parte del medico. 3. Un follow-up aggiuntivo con il metodo colturale è necessario se il risultato è negativo e i sintomi clinici persistono o in caso di attacchi di febbre reumatica acuta (FRA). 4. La prevalenza delle infezioni batteriche influisce sul valore predittivo del test. 5. Come accade per altri test, un risultato negativo non esclude la presenza di infezioni da streptococco di gruppo A. 6. Si possono avere risultati falsi negativi qualora i batteri presentino mutazioni, inserzioni, delezioni o riarrangiamenti del genoma, o se il test viene eseguito in una fase molto precoce della malattia. 7. Si possono avere risultati falsi negativi se il campione contiene un numero inadeguato di batteri a causa di prelievo, trasporto o manipolazione non corretti. Si possono avere risultati falsi negativi se i batteri sono presenti a un livello inferiore alla sensibilità analitica del test. 8. Come accade per altri test, si possono avere risultati falsi positivi. In alcuni scenari, può essere indicato ripetere il test o eseguirlo con un dispositivo differente. 9. Questo test non può escludere la presenza di infezioni causate da altri patogeni virali o batterici. 10. Le informazioni contenute nel codice a barre del kit possono essere trasferite a Integrated Cycler Studio solo mediante un lettore di codice a barre. Se il lettore non funziona o se, per qualsiasi altra ragione, non si riesce a trasferire le informazioni, contattare Focus Diagnostics ai recapiti indicati nell'ultima pagina di questo documento. 11. Le prestazioni di questo test non sono state determinate per l uso nei test di screening dei donatori.

6 Pagina 6 CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI STUDIO CLINICO PROSPETTICO Milletrecentonovantasette (1397) campioni raccolti prospetticamente da quattro (4) siti geografici diversi tra il 6 maggio 2014 e il 28 ottobre 2014 da pazienti con segni e sintomi di infezioni della faringe da streptococco di gruppo A. Milletrecentocinquantadue (1352) campioni erano valutabili con Strep Direct e con il metodo colturale di confronto. I campioni sono stati analizzati con Strep Direct presso i siti di raccolta, mentre il metodo colturale di confronto è stato effettuato presso un (1) laboratorio centrale. Il tasso di non validità dello studio clinico prospettico condotto con Strep Direct è stato dello 0,57% (otto su milletrecentonovantasei (8/1396) campioni). L'analisi delle discordanze è stata effettuata usando un saggio di sequenziamento bidirezionale validato. Risultato di Simplexa Group A Strep Direct Studio clinico prospettico (globale) Metodo colturale Rilevato Non rilevato Totale Rilevato a 209 Non rilevato 4 b Totale % sensibilità % valore predittivo positivo (PPV) 97,4%(152/156) IC al 95%: da 93,6% a 99,0% 72,7%(152/209) IC al 95%: da 66,3% % specificità % valore predittivo negativo (NPV) 95,2%(1139/1196) IC al 95%: da 93,9% a 96,3% 99,7%(1139/1143) IC al 95%: da 99,1% a 99,9% a 78,3% a 46 campioni discrepanti su 57 erano positivi allo streptococco di gruppo A, 9 su 57 erano negativi e 2/57 erano indeterminati, quando analizzati utilizzando un saggio di sequenziamento bidirezionale validato. b 2 campioni discrepanti su 4 erano positivi allo streptococco di gruppo A e 2 su 4 erano negativi quando analizzati utilizzando un saggio di sequenziamento bidirezionale validato. RIPRODUCIBILITÀ Tre (3) centri di ricerca hanno valutato la riproducibilità inter-centro, inter-giorno e inter/intra-saggio del dispositivo. Ogni laboratorio ha analizzato un gruppo di sei (6) campioni comprensivi di campioni preparati ad hoc bassi positivi (circa 1 volta il limite di rilevazione, LoD) e moderatamente positivi (circa 3 volte il LoD) per ogni sierotipo (M1 ed M3) dello streptococco di gruppo A; sono stati inoltre inclusi un controllo positivo e uno negativo. I saggi sono stati effettuati in triplicato (3), in cinque (5) giorni diversi. Per ogni centro erano previsti due (2) operatori, ciascuno dei quali ha saggiato il gruppo di campioni una (1) volta al giorno, per un totale di due (2) serie di dati al giorno. La tabella seguente mostra i risultati combinati di tutti i centri. Centro di analisi 1 Centro di analisi 2 Centro di analisi 3 Complessivi Campione del gruppo analizzato Concordanza % con i risultati previsti Ct medio % CV Concordanza % con i risultati previsti Ct medio % CV Concordanza % con i risultati previsti Ct medio % CV % totale IC al 95% Negativo Controllo positivo Streptococco di gruppo A sierotipo M1 basso positivo NA NA 96,7% (29/30) 41,9 NA 29,5 1,4 29,5 3 NA NA 30 1,2 38,6 4,4 83,3% (25/30) 39,4 5,6 96,7% (29/30) 38 3,5 98,9% (89/90) (90/90) 93,3% (84/90) da 94,0 a 99,8% da 95,9 a da 86,2 a 96,9%

7 Pagina 7 Centro di analisi 1 Centro di analisi 2 Centro di analisi 3 Complessivi Campione del gruppo analizzato Concordanza % con i risultati previsti Ct medio % CV Concordanza % con i risultati previsti Ct medio % CV Concordanza % con i risultati previsti Ct medio % CV % totale IC al 95% Streptococco di gruppo A sierotipo M1 moderatamente positivo Streptococco di gruppo A sierotipo M3 basso positivo Streptococco di gruppo A sierotipo M3 moderatamente positivo 96,7% (29/30) 35,9 2,6 93,3% (28/30) 36,3 4,8 36 1,8 38,5 2,9 90,0% (27/30) 39,2 4,8 96,7% (29/30) 39 4,5 36,3 2,6 90,0% (27/30) 36,7 3,2 Tutti 99,4% (179/180) 92,2% (166/180) 98,9% (178/180) SENSIBILITÀ ANALITICA / LIMITE DI RILEVAZIONE 37 2,7 97,8% (88/90) 94,4% (85/90) 96,7% (87/90) 96,9% (523/540) da 92,3 a 99,4% da 87,6 a 97,6% da 90,7 a 98,9% da 95,0 a 98,0% Il limite di rilevazione (LoD) per Strep Direct è stato definito effettuando una diluizione in serie. I campioni LoD usati per questo studio sono stati preparati ad hoc utilizzando due (2) stock batterici dei sierotipi di streptococco di gruppo A M1 ed M3; questi stock sono stati verificati (rimessi in coltura e rititolati). Per ogni sierotipo, otto (8) diverse concentrazioni sono state addizionate in matrici simulate a partire dagli stock batterici verificati e sono state quindi confermate utilizzando trentadue (32) replicati. È stato determinato il seguente limite di rilevazione (LoD): Limite di rilevazione di Strep Direct Sierotipo dello streptococco di gruppo A Concentrazione [ufc/ml] M1 682 M REATTIVITÀ ANALITICA / CROSS-REATTIVITÀ Reattività analitica La reattività analitica è stata determinata come capacità del saggio Strep Direct di rilevare sessanta (60) ceppi di streptococco di gruppo A assenti nello studio LoD. La reattività analitica è stata osservata nell'analisi di ventuno (21) ceppi. Tutti sono stati rilevati come positivi per lo streptococco di gruppo A a livelli pari o inferiori a 5000 ufc/ml. La reattività analitica è stata analizzata utilizzando metodi di analisi di sequenza in silico NCBI BLAST per trentanove (39) ceppi SGA distinti a partire dai ceppi umidi analizzati. Sierotipo di pyogenes Concentrazione (ufc/ml) % rilevazione Risultati qualitativi di Simplexa Group A Strep Direct: M2 1,50 X % (3/3) M4 1,50X % (3/3) M5 1,50 X % (3/3) M6 1,50 X % (3/3)

8 Pagina 8 Sierotipo di pyogenes Concentrazione (ufc/ml) % rilevazione Risultati qualitativi di Simplexa Group A Strep Direct: M9 3,00 X % (3/3) M12 1,50 X % (3/3) M13 1,50 X % (3/3) M14 1,50 X % (3/3) M18 5,00 X % (3/3) M22 1,50 X % (3/3) M27 3,00 X % (3/3) M28 1,50 X % (3/3) M29 1,50 X % (3/3) M49 1,50 X % (3/3) M73 3,00 X % (3/3) M75 3,00 X % (3/3) M77 3,00 X % (3/3) M78 1,50 X % (3/3) M82 1,50 X % (3/3) M87 1,50 X % (3/3) M89 3,00 X % (3/3)

9 Pagina 9 Cross-reattività (specificità analitica) La reattività analitica è stata valutata per Strep Direct analizzando la sua capacità di identificare esclusivamente lo streptococco di gruppo A senza cross-reattività con organismi strettamente correlati o che possono causare sintomi clinici simili, oppure presenti nella flora normale della faringe. Campioni negativi sono stati addizionati a potenziali organismi cross-reagenti a concentrazioni note. I campioni arricchiti sono stati esaminati per la reattività con Group A Strep Direct. Sono stati analizzati sessantaquattro (64) organismi. Bacteroides ovalis e Tremella fuciformis non erano disponibili per l'analisi, pertanto è stata effettuata l'analisi della sequenza In-Silico NCBI BLAST. Non è stata osservata alcuna cross-reattività. Cross-reagente Concentrazione analizzata Simplexa Group A Strep Direct: % rilevazione (n. rilevati/n. analizzati) Basale1 Non applicabile 0,0% (0/5) Basale2 Non applicabile 0,0% (0/5) Adenovirus 1 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml 0,0% (0/3) Adenovirus 7A 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml 0,0% (0/3) Arcanobacterium haemolyticum 1,00 X 10 6 TCID 50 /ml 0,0% (0/3) Bacillus cereus 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Bacteroides ovatus 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Bordetella pertussis 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Burkholderia cepacia 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Campylobacter rectus 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Candida albicans 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Chlamydia pneumoniae 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Coronavirus 229E 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml 0,0% (0/3) Corynebacterium diptheriae 1,00 X 10 6 TCID 50 /ml 0,0% (0/3) Citomegalovirus (CMV) 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml 0,0% (0/3) Enterococcus faecalis vanb 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Enterovirus 71 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml 0,0% (0/3) Virus di Epstein Barr (B95-8) 1,00 X 10 5 copie/ml 0,0% (0/3) Escherichia coli 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Fusobacterium necrophorum 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Haemophilus influenzae 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) HSV-1 McIntyre 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml 0,0% (0/3) HSV-2 G 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml 0,0% (0/3) Influenza A/Hong Kong/8/68 H3N2 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml 0,0% (0/3) Influenza B/Panama/45/90 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml 0,0% (0/3) Klebsiella pneumoniae 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Lactobacillus acidophilus 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Legionella pneumophila 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Metapneumovirus-9 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml 0,0% (0/3)

10 Pagina 10 Cross-reagente Concentrazione analizzata Simplexa Group A Strep Direct: % rilevazione (n. rilevati/n. analizzati) Moraxella catarrhalis 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Mycoplasma pneumoniae 1,00 X 10 6 CCU/ml 0,0% (0/3) Neisseria gonorrhoeae 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Neisseria meningitidis 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Parainfluenza 1 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml 0,0% (0/3) Parainfluenza 2 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml 0,0% (0/3) Parainfluenza 3 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml 0,0% (0/3) Peptostreptococcus micros 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/6) Pseudomonas aeruginosa 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Rhinovirus 1A 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml 0,0% (0/3) RSV-B ,00 X 10 5 TCID 50 /ml 0,0% (0/3) Staphylococcus aureus (MRSA), ATCC ,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Staphylococcus epidermidis (MRSE), ATCC ,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Stenotrophomonas maltophilia 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) agalactiae 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) anginosus 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) canis 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) constellatus subsp. constellatus 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) cristatus 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) dysgalactiae 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) equi subsp. zooepidemicus 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) equinus 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) gallolyticus 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) gordonii 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) intermedius 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) mitis 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) mutans 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) oralis 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) parasanguinis 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) pneumoniae 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) salivarius 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) sanguinis 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) sobrinus 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) uberis 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) vestibularis 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3) Treponema denticola 1,00 X 10 6 spirocheti/ml 0,0% (0/3) Veillonella parvula 1,00 X 10 6 ufc/ml 0,0% (0/3)

11 Pagina 11 INTERFERENZE Le prestazioni del saggio Strep Direct sono state valutate in presenza di sostanze potenzialmente interferenti che possono essere presenti nella faringe. Le sostanze potenzialmente interferenti sono state valutate in campioni preparati ad hoc che contenevano streptococco di gruppo A dei sierotipi M1 ed M3 in concentrazioni basse positive (circa 1 volta il LoD) e moderatamente positive (circa 3 volte il LoD). Non si sono trovate prove di interferenza causata dalle sostanze alle concentrazioni testate. Potenziale interferente Principio attivo Concentrazione dell interferente Sierotipo batterico SGA Strep Direct (n. rilevati/n. analizzati) Basale Non applicabile Non applicabile M1 (5/5) Basale Non applicabile Non applicabile M3 (5/5) Afrin spray nasale Afrin spray nasale Oximetazolina cloridrato Oximetazolina cloridrato 15% v/v M1 (3/3) 15% v/v M3 (3/3) Antibiotico Amoxicillina 0,5 mg/ml M1 (3/3) Antibiotico Amoxicillina 0,5 mg/ml M3 (3/3) Antibiotico Cefalexina 0,04 mg/ml M1 (3/3) Antibiotico Cefalexina 0,04 mg/ml M3 (3/3) Antibiotico Clindamicina 0,06 mg/ml M1 (5/5) Antibiotico Clindamicina 0,06 mg/ml M3 (3/3) Antibiotico Eritromicina 1 mg/ml M1 (3/3) Antibiotico Eritromicina 1 mg/ml M3 (3/3) Antibiotico Penicillina 1200 U/ml M1 (3/3) Antibiotico Penicillina 1200 U/ml M3 (3/3) Aspirina Aspirina 0,62 mg/ml M1 (3/3) Aspirina Aspirina 0,62 mg/ml M3 (3/3) Benadryl Benadryl Difenidramina cloridrato Difenidramina cloridrato 10 µl/tampone M1 (3/3) 10 µl/tampone M3 (3/3) Sangue Sangue 10% v/v M1 (3/3) Sangue Sangue 10% v/v M3 (3/3) Spray per il mal di gola Chloraseptic Spray per il mal di gola Chloraseptic Fenolo 10% v/v M1 (3/3) Fenolo 10% v/v M3 (3/3) Compresse Contac Cold + Flu Paracetamolo Clorfenamina maleato Fenilefrina cloridrato 16,2 mg/ml 0,06 mg/ml 0,16 mg/ml M1 (3/3) Compresse Contac Cold + Flu Paracetamolo Clorfenamina maleato Fenilefrina cloridrato 16,2 mg/ml 0,06 mg/ml 0,16 mg/ml M3 (3/3) Corticosterone Corticosterone 4 mg/tampone M1 (3/3) Corticosterone Corticosterone 4 mg/tampone M3 (3/3) Dentifricio Crest Complete Dentifricio Crest Complete Fluoruro di sodio 0,1 mg/ml M1 (3/3) Fluoruro di sodio 0,1 mg/ml M3 (3/3)

12 Pagina 12 Potenziale interferente Principio attivo Concentrazione dell interferente Sierotipo batterico SGA Strep Direct (n. rilevati/n. analizzati) Anestetico / analgesico orale Finafta Anestetico / analgesico orale Finafta Alcol etilico Acido salicilico Benzocaina Alcol etilico Acido salicilico Benzocaina Diluizione 1/10X M1 (3/3) Diluizione 1/10X M3 (3/3) Listerine Eucaliptolo Mentolo Salicilato di metile Timolo 10 µl/tampone M1 (3/3) Listerine Eucaliptolo Mentolo Salicilato di metile Timolo 10 µl/tampone M3 (3/3) Mucina Mucina Proteina mucina purificata Proteina mucina purificata 60 µg/ml M1 (3/3) 60 µg/ml M3 (3/3) Neo-Synephrine Fenilefrina cloridrato 15% v/v M1 (3/3) Neo-Synephrine Fenilefrina cloridrato 15% v/v M3 (3/3) NyQuil NyQuil Destrometorfano bromidrato Doxilamina succinato Destrometorfano bromidrato Doxilamina succinato Diluizione 1/200 X M1 (3/3) Diluizione 1/200 X M3 (3/3) Farmaco antidolorifico FANS 0,1 mg/ml M1 (3/3) Farmaco antidolorifico FANS 0,1 mg/ml M3 (3/3) Farmaco antidolorifico Tilenolo 1 mg/ml M1 (3/3) Farmaco antidolorifico Tilenolo 1 mg/ml M3 (3/3) Sciroppo per la tosse Robitussin Cough / Chest Congestion Sciroppo per la tosse Robitussin Cough / Chest Congestion Spray nasale di soluzione fisiologica Destrometorfano bromidrato Guaifenesina Destrometorfano bromidrato Guaifenesina Cloruro di sodio con conservanti 2,0 mg/ml M1 (3/3) 2,0 mg/ml M3 (3/3) 15% v/v M1 (3/3) Spray nasale di soluzione fisiologica Saliva Saliva Cloruro di sodio con conservanti Acqua, elettroliti, muco, ecc. Acqua, elettroliti, muco, ecc. 15% v/v M3 (3/3) 50 µl/tampone M1 (3/3) 50 µl/tampone M3 (3/3)

13 Pagina 13 Potenziale interferente Principio attivo Concentrazione dell interferente Sierotipo batterico SGA Strep Direct (n. rilevati/n. analizzati) Scope Glicerina Saccarina di sodio Benzoato di sodio Cloruro di cetilpiridinio Acido benzoico Blu 1 Giallo 5 10 µl/tampone M1 (3/3) Scope Glicerina Saccarina di sodio Benzoato di sodio Cloruro di cetilpiridinio Acido benzoico Blu 1 Giallo 5 10 µl/tampone M3 (3/3) Pasticche per il mal di gola Pasticche per il mal di gola Pasticche per il mal di gola Pasticche per il mal di gola Pasticche per il mal di gola Pasticche per il mal di gola Mentolo 1,7 mg/ml M1 (3/3) Mentolo 1,7 mg/ml M3 (3/3) Pectina 0,34 mg/ml M1 (3/3) Pectina 0,34 mg/ml M3 (3/3) Zinco gluconato glicina 0,1 mg/ml M1 (3/3) Zinco gluconato glicina 0,1 mg/ml M3 (3/3) Timolo Timolo 400 mg/tampone M1 (3/3) Timolo Timolo 400 mg/tampone M3 (3/3) Nebulizzatore orale Zicam Nebulizzatore orale Zicam Zincum Aceticum Zincum Gluonicum Zincum Aceticum Zincum Gluonicum 0,625% v/v M1 (3/3) 0,625% v/v M3 (3/3)

14 Pagina 14 INIBIZIONE DA PARTE DI ALTRI MICRORGANISMI Il saggio Strep Direct è stato valutato testando la capacità di identificare lo streptococco di gruppo A quando sono presenti altri microrganismi potenzialmente inibitori. I sessantaquattro (64) microrganismi potenzialmente inibitori del pannello sono stati addizionati individualmente a un pool contenente concentrazioni basse (circa 1 volta il LoD) e moderate (circa 3 volte il LoD) dei sierotipi M1 ed M3 dello streptococco di gruppo A. Nei casi in cui non è stato rilevato un segnale per lo streptococco di gruppo A in nessuno dei tre (3) replicati, sono stati analizzati a titolo di conferma altri cinque (5) replicati. Bacteroides ovalis e Tremella fuciformis non erano disponibili per l'analisi, pertanto è stata effettuata l'analisi della sequenza In- Silico NCBI BLAST. Alle concentrazioni analizzate non sono stati confermati effetti inibitori per Strep Direct. Organismo Concentrazione analizzata Sierotipo SGA: M1 Strep Direct: % rilevazione (n. rilevati/n. analizzati) Sierotipo SGA: M3 Strep Direct: % rilevazione (n. rilevati/n. analizzati) Basale Non applicabile (11/11) (10/10) Adenovirus 1 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml (3/3) (3/3) Adenovirus 7A 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml (3/3) (3/3) Arcanobacterium haemolyticum 1,00 X 10 6 TCID 50 /ml (3/3) (3/3) Bacillus cereus Bacteroides ovatus Bordetella pertussis Burkholderia cepacia Campylobacter rectus Candida albicans Chlamydia pneumoniae Coronavirus 229E 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml (3/3) (3/3) Corynebacterium diptheriae 1,00 X 10 6 TCID 50 /ml (3/3) (3/3) Citomegalovirus (CMV) 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml (3/3) (3/3) Enterococcus faecalis vanb Enterovirus 71 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml (3/3) (3/3) Virus di Epstein Barr (B95-8) 1,00 X 10 5 copie/ml (3/3) (3/3) Escherichia coli Fusobacterium necrophorum Haemophilus influenzae HSV-1 McIntyre 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml (3/3) (3/3)2 HSV-2 G 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml (3/3) (3/3) Influenza A/Hong Kong/8/68 H3N2 Influenza B/Panama/45/90 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml (3/3) (3/3) 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml (3/3) (3/3) Klebsiella pneumoniae Lactobacillus acidophilus Legionella pneumophila Metapneumovirus-9 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml (3/3) (3/3) Moraxella catarrhalis

15 Pagina 15 Organismo Mycoplasma pneumoniae Concentrazione analizzata Sierotipo SGA: M1 Strep Direct: % rilevazione (n. rilevati/n. analizzati) Sierotipo SGA: M3 Strep Direct: % rilevazione (n. rilevati/n. analizzati) 1,00 X 10 6 CCU/ml (3/3) (3/3) Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Parainfluenza 1 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml (3/3) (3/3) Parainfluenza 2 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml (3/3) (3/3) Parainfluenza 3 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml (3/3) (3/3) Peptostreptococcus micros *** 1,00 X 106 ufc/ml (6/6) (6/6) Pseudomonas aeruginosa Rhinovirus 1A 1,00 X 10 5 TCID 50 /ml (3/3) (3/3) RSV-B ,00 X 10 5 TCID 50 /ml (3/3) (3/3) Staphylococcus aureus (MRSA), ATCC Staphylococcus epidermidis (MRSE), ATCC Stenotrophomonas maltophilia agalactiae anginosus* 1,00 X 10 6 ufc/ml (5/5) (3/3) canis constellatus subsp. constellatus cristatus dysgalactiae equi subsp. zooepidemicus equinus gallolyticus gordonii intermedius mitis mutans oralis parasanguinis pneumoniae salivarius sanguinis** 1,00 X 10 6 ufc/ml (5/5) (3/3) sobrinus

16 Pagina 16 Organismo Concentrazione analizzata Sierotipo SGA: M1 Strep Direct: % rilevazione (n. rilevati/n. analizzati) Sierotipo SGA: M3 Strep Direct: % rilevazione (n. rilevati/n. analizzati) uberis vestibularis Treponema denticola 1,00 X 10 6 spirocheti/ml (3/3) (3/3) Veillonella parvula *1 su 3 dei replicati iniziali presentava un volume basso (errore di controllo assenza liquido), pertanto sono stati testati ulteriori tre replicati. Pertanto sono stati valutati in totale 5 replicati. **1 su 3 dei replicati iniziali era invalid a causa di IC Failure, pertanto sono stati testati ulteriori tre replicati. Pertanto sono stati valutati in totale 5 replicati. ***Campione analizzato due volte, perché presente nell'elenco del protocollo con nomi diversi per lo stesso organismo. Pertanto sono stati valutati in totale 6 replicati. CONTAMINAZIONE DA CARRY-OVER Il carryover da amplificazione per i saggi Simplexa, incluso il saggio Strep Direct, è stato determinato a partire dal saggio Simplexa Flu A/B & RSV Direct REF MOL2650 (K120413) ed è disponibile sul sito web dell'fda. Lo studio può essere applicato al saggio Strep Direct in quanto non è specifico per gli analiti. Nel saggio Simplexa Flu A/B & RSV Direct REF MOL2650 (K120413) lo studio sul carry-over da amplificazione ha ricercato la presenza di una contaminazione nei campioni negativi. Lo studio è stato impostato posizionando alternativamente su ogni disco campioni altamente positivi e altamente negativi. Non è stata osservata alcuna prova di contaminazione da carry-over. VALORI PREVISTI La prevalenza di streptococco di gruppo A dipende dalla popolazione di pazienti e dall'epidemiologia. Nello studio prospettico Simplexa TM Group A Strep Direct, duecentonove (209) dei milletrecentocinquantadue (1352) campioni analizzati, pari al 15,4%, erano positivi per i quattro (4) siti geografici diversi tra il 6 maggio 2014 e il 28 ottobre BIBLIOGRAFIA 1. Lancefield RC A serological differentiation of human and other groups of hemolytic streptococci. J. Exp. Med. 57 (4): Poses RM, Cebul RD, Collins M, Fager SS The accuracy of experienced physicians' probability estimates for patients with sore throats: implications for decision making. JAMA 254: Komaroff AL, Pass TM, Aronson MD, Ervin CT, Cretin S, Winikoff RN, and Branch WT Jr The prediction of streptococcal pharyngitis in adults. J. Gen. Intern. Med. 1: Marx, John Rosen's emergency medicine: concepts and clinical practice (7th ed.). Chapter Brook I, and Dohar JE Management of group A beta-hemolytic streptococcal pharyngotonsillitis in children. J. Fam. Pract. 55 (12): S Stevens DL, Tanner MH, Winship J, Swarts R, Ries KM, Schlievert PM, and Kapalan E Severe group A streptococcal infections associated with a toxic shock-like syndrome and scarlet fever toxin A. N. Engl. J. Med. 321 (1): Hahn RG, Knox LM, and Forman TA Evaluation of post streptococcal illness. Am. Fam. Physician. 71 (10): Choby BA Diagnosis and treatment of streptococcal pharyngitis. Am. Fam. Physician. 79 (5): Lintges M, Sabine S, Uciechowski P, Plümäkers B, Reinert RR, Al-Lahham A, Lütticken R, and Rink L A new closedtube multiplex real-time PCR to detect eleven super antigens of pyogenes identifies a strain without super antigen activity. International Journal of Medical Microbiology (297): Twagira1 MFN, Wade1 JJ, Eltringham1 I, and Smith M Development of a real-time PCR assay on the Roche Light- Cycler for the detection of erm and mef erythromycin resistance genes in ß-haemolytic streptococci. JAC. 56 (4):

17 Pagina 17 L uso delle sonde Scorpions per la diagnostica in vitro nell'uomo è coperto da una licenza concessa da Qiagen Manchester, UK, a Focus Diagnostics, Inc. Scorpions è un marchio registrato di Qiagen Manchester, UK. I coloranti Black Hole Quencher, CAL Fluor e Quasar sono a marchio Biosearch Technologies, Inc. ('BTI'). La tecnologia con colorante Black Hole Quencher, CAL Fluor e Quasar è concessa in licenza ai sensi dell accordo con BTI e tali prodotti sono venduti a solo scopo clinico, diagnostico o di ricerca e sviluppo. RAPPRESENTANTE AUTORIZZATO mdi Europa GmbH, Langenhagener Str , Langenhagen-Hannover, Germania INFORMAZIONI PER GLI ORDINI PI.MOL2850.IVD.IT Rev. C Redatto il: 17 giugno 2015 Telefono: Fax: ASSISTENZA TECNICA (800) (solo U.S.A.) (714) (562) (Internazionale) Telefono: Fax: (800) (solo U.S.A.) (562) (562) (Internazionale) Visitate il nostro sito web all indirizzo Cypress, California 90630, Stati Uniti