3. Produzione su ampia scala di proteine ricombinanti: la bioindustria nel settore farmaceutico

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1 3. Produzione su ampia scala di proteine ricombinanti: la bioindustria nel settore farmaceutico 3.1. Fermentazione 3.2. Biostrumentazioni e lavorazioni a valle (recupero del prodotto) 3.3. Tecniche di analisi e purificazione di macromolecole biologiche: cromatografia ed elettroforesi 3.4. Formulazione dei prodotti biotecnologici

2 Fasi essenziali di un tipico processo biotecnologico

3 Fermentazione Procedura che consente di ottenere elevate densità di cellule procariotiche o eucariotiche rispetto alle normali condizioni di coltura. Ciò si ottiene mediante un controllo molto accurato di tutti i parametri fondamentali per la crescita in vitro delle cellule: temperatura, concentrazione di ossigeno, ph, agitazione, controllo della concentrazione dei nutrienti del mezzo di coltura

4 Tappe del processo di fermentazione Preparazione del mezzo di coltura e sterilizzazione dell attrezzatura Preparazione inoculo (mantenimento condizione di sterilità) Inoculo nel fermentatore Crescita delle cellule (fase lag - fase log - fase stazionaria - morte) Fine del processo fermentativo Recupero e separazione del mezzo di coltura dalle cellule Prodotti secreti: purificazione del prodotto dal mezzo di coltura Prodotti non secreti: rottura cellulare, recupero della frazione di interesse, purificazione del prodotto. Caratterizzazione del prodotto e valutazione dell attività biologica

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6 Fermentazione preparazione del mezzo di coltura (per batteri, lieviti, cellule animali) BATTERI Estratto di lievito Triptone Glucosio Sterilizzazione, aggiunta di: KH 2 PO 4, K 2 HPO 4 antibiotico CELLULE ANIMALI LIEVITI Estratto di lievito Triptone Glucosio Sterilizzazione, aggiunta di: Siero

7 Fermentazione sterilizzazione e sanitizzazione Sterilizzazione in place : fonte di vapore sterile che consente la sterilizzazione del bioreattore nonché, in alcuni casi, del mezzo di coltura. Sanitizzazione o CIP (cleaning in place): attrezzatura che consente una pulizia del bioreattore mediante passaggio di soluzioni acide e basiche in maniera alternata a lavaggi con acqua bidistillata.

8 Fermentazione Preparazione dell inoculo Inoculo nel fermentatore Per cellule di qualsiasi natura si parte da una Master Cell Bank L inoculo è di solito preparato in un volume di circa il 10% del volume finale della fermentazione. Esempio (con un fermentatore batterico da 200 litri utili): Pre-inoculo: crescita a saturazione in beuta da 2 litri Inoculo in un fermentatore da 20 litri utili Inoculo nel fermentatore da 200 litri

9 BIOREATTORE AD AGITAZIONE MECCANICA

10 BIOREATTORE AD AGITAZIONE MECCANICA (a) O PNEUMATICA (b)

11 BIOREATTORE AD AGITAZIONE MECCANICA DA 2 LITRI DA 40 LITRI

12 BIOREATTORE AD AGITAZIONE MECCANICA DA 65 LITRI This fermentor features a 65 L working volume, with sterilization in place, a bottom mixer drive, a top mechanical foam breaker, and automatic control of ph, drive speed, oxygen tension, culture temperature and foam level. Temperature jumps from 30 C to 42 C can be achieved in about 12 minutes. Cells may be harvested in 10 minutes with a continuous flow centrifuge, Model 41 made by CEPA.This system is easy to use. Please talk to Glenn Miller for details.

13 BIOREATTORI A LETTO FISSO

14 BIOREATTORI A PERFUSIONE

15 Fermentazione Curva di crescita delle cellule Fase lag adattamento delle cellule alle condizioni di coltura, senza divisione Fase esponenziale fase di crescita e duplicazione cellulare, fase in cui la maggior parte dei geni si esprime in maniera ottimale Fase stazionaria blocco della crescita dovuto essenzialmente all esaurimento e alla degradazione del mezzo di coltura Fase di morte Per ottenere la massima resa in cellule: Riduzione della fase stazionaria mediante pre-adattamento delle cellule al mezzo per la fermentazione Posporre al massimo l avvento della fase stazionaria

16 Procedure di Fermentazione Fermentazione discontinua Batch (usata di solito per grandi bioreattori per batteri), recupero del prodotto di fermentazione nella parte finale della fase log. In alcuni casi è di interesse la fase che si approssima al termine della crescita esponenziale per la produzione da parte di microorganismi di metaboliti secondari (es. antibiotici) Fermentazione discontinua con rifornimento aggiunta di mezzo di coltura fresco verso la fine della fase log, per spingere ulteriormente la crescita cellulare Fermentazione continua crescita indefinita delle cellule, mediante l aggiunta di nuovo mezzo di coltura e rimozione contemporanea di cellule cresciute e metaboliti, stabilendo con un dispositivo di controllo del flusso il giusto regime di aggiunta e rimozione

17 Fermentazione Recupero e separazione delle cellule dal mezzo di coltura cellule CENTRIFUGAZIONE FILTRAZIONE mezzo di coltura lisi delle cellule centrifugazione microfiltrazione concentrazione centrifugazione in continuo=concentrazione proteina intracellulare tecniche di purificazione proteina secreta proteina purificata

18 TECNICHE DI CENTRIFUGAZIONE (= separazione delle particelle solide dal liquido basata sulla differenze di densità) centrifugazione differenziale (a diverse velocità) centrifugazione in gradiente di densità

19 TECNICHE DI FILTRAZIONE Concentrazione sovranatante di coltura e primo passaggio di sterilizzazione della biomassa (membrane 0,45 o 0,22 micron) Separazione cellule dal mezzo di coltura mediante sistemi di filtrazione a flusso tangenziale, che evita l occlusione delle membrane grazie alle forze radenti intense lungo la superficie delle membrana

20 ULTRAFILTRAZIONE La soluzione da trattare viene fatta passare sotto pressione attraverso membrane i cui pori hanno tagli molecolari ben definiti.

21 SISTEMI INDUSTRIALI DI FILTRAZIONE

22 LISI DELLE CELLULE Si agisce sulla biomassa per ottenere la rottura delle strutture cellulari Metodi chimici Lisi con alcali Trattamento con solventi organici Trattamento con detergenti Metodi biologici Lisi enzimatica Metodi meccanici Omogenizzazione ad alta pressione Agitazione con abrasivi Ultrasonicazione Metodi fisici Shock osmotico Shock termico Cicli di congelamento/scongelamento

23 CONCENTRAZIONE DEL PRODOTTO PROTEICO Evaporazione Estrazione liquido-liquido Precipitazione Adsorbimento

24 Tecniche di analisi e purificazione di macromolecole biologiche

25 CROMATOGRAFIA Separazione in base alla diversa distribuzione delle sostanze tra due fasi: Fase solida stazionaria (gel di silice, cellulosa, polimeri quali agarosio o acrilamide compressa) Fase mobile (liquida o gassosa) La separazione si verifica sulla base di un interazione differenziale di varia natura (carica, peso molecolare, idrofobicità) tra i componenti il campione e il mezzo cromatografico, con conseguente rallentamento di alcune molecole rispetto ad altre. Fattore primario per la velocità dell operazione è il trasporto della massa attraverso i pori della fase solida. Una evoluzione è la cromatografia di perfusione, che oltre ai pori convenzionali presenta anche grandi pori canale.

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27 SCHEMA DI APPARATO PER CROMATOGRAFIA

28 SCHEMA DI APPARATO PER CROMATOGRAFIA HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography)

29 PRINCIPALI TIPI DI CROMATOGRAFIE APPLICATE ALLA PRODUZIONE INDUSTRIALE Cromatografia a scambio ionico Cromatografia di interazione idrofobica Cromatografia di gel permeazione o gel filtration Cromatografia di (immuno)affinità Letti espansi

30 CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO Basata sulla carica della proteina da purificare informazioni necessarie= densità di carica e punto isoelettrico Modalità positiva: il prodotto di interesse interagisce con la fase solida. Modalità negativa: il prodotto di interesse non interagisce con la fase solida, ma è favorito l adsorbimento dei contaminanti. Scambiatori anionici: legano le molecole a carica negativa Scambiatori cationici: legano le molecola a carica positiva L eluizione del prodotto si ottiene mediante un gradiente di concentrazione salina continuo o graduale. Molto utilizzata a livello industriale anche perché è facile aumentare la scala

31 SCAMBIO IONICO - MATRICE DEAE

32 CROMATOGRAFIA DI INTERAZIONE IDROFOBA Elevate concentrazioni saline riducono l idratazione della proteina favorendo l accessibilità ai residui idrofobi esposti alla superficie. La separazione avviene grazie ad interazioni non covalenti e non elettrostatiche tra poteine e fase stazionaria. Tecnica blanda, assicura elevate rese di proteine non danneggiate, correttamente avvolte e separate dai contaminati. Spesso viene usata a valle della cromatografia a scambio ionico

33 CROMATOGRAFIA DI (IMMUNO) AFFINITA Basata su interazioni altamente specifiche tra un ligando immobilizzato alla fase solida e la proteina di interesse. E altamente efficace. Dopo che è avvenuta l interazione tra il ligando e la proteina di interesse si lava ripetutamente la matrice al fine di allontanare i contaminanti. Eluizione della proteina di interesse: Si aggiungono ligandi in grado di competere per l interazione tra proteina e fase stazionaria Si variano drasticamente le condizioni fisiche (ph, concentrazione salina) che determinano una riduzione dell affinità. La forza della metodologia può trasformarsi anche nella sua debolezza. Infatti, se il legame ligando-proteina è molto forte, l eluizione della proteina può richiedere drastiche condizioni che potrebbero danneggiare il prodotto.

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35 SCHEMA CROMATOGRAFIA DI (IMMUNO) AFFINITA

36 CROMATOGRAMMA DI PURIFICAZIONE MEDIANTE AFFINITA

37 CROMATOGRAFIA DI GEL-PERMEAZIONE O GEL-FILTRAZIONE (ad esclusione dimensionale) Separa le proteine in base alle dimensioni ed alla loro forma Fase stazionaria: gel inerti con una ristretta distribuzione della dimensione dei pori. In base alla dimensione dei pori scelti per la fase stazionaria verranno trattenute le proteine più piccole, mentre le più grandi verranno rapidamente eluite. Su scala industriale è poco efficiente per l effetto intrinseco di diluizione. Utilizzata spesso nella fase finale di purificazione quando la proteina da purificare ha già raggiunto concentrazioni elevate. Utilizzata anche per confermare il peso molecolare delle proteine o per portare le proteine nel tampone più idoneo alla formulazione finale.

38 SCHEMA DI CROMATOGRAFIA DI GEL-PERMEAZIONE O AD ESCLUSIONE DIMENSIONALE

39 LETTI ESPANSI Sviluppo di nuovi metodi per la semplificazione dei processi di produzione e purificazione. In teoria si ottiene la chiarificazione, la concentrazione e la purificazione della biomassa in un unico passaggio Letti fluidificati già utilizzati per il recupero di antibiotici

40 PRINCIPALI TIPI DI ELETTROFORESI APPLICATE ALLA PRODUZIONE INDUSTRIALE Elettroforesi su piastra Elettroforesi capillare Elettroforesi bidimensionale Elettroforesi in campo pulsato Focalizzazione isolettrica

41 ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMIDE/SDS (SDS-PAGE) Valutazione peso molecolare, purezza, frammentazione L elettroforesi separa le macromolecole in base al peso molecolare ed alla carica netta risultante considerando i gruppi carichi positivamente e negativamente presenti sulla proteina L uso del detergente SDS fa si che la separazione diventa dipendente essenzialmente dalle dimensioni della proteina. Il SDS si complessa alle proteine determinando il dispiegamento delle proteine, e la quantità complessata è proporzionale alla grandezza della proteina. Il SDS è carico negativamente e la carica della proteina viene sopraffatta dalla carica del SDS: quindi tutti i complessi SDS-proteine sono carichi negativamente proporzionalmente alla grandezza della proteina. Quindi il rapporto carica/massa diventa una costante La concentrazione di acrilammide si sceglie in base ai pesi molecolari di interesse da analizzare: più alta è la sua concentrazione peggio migreranno le proteine di alto peso molecolare.

42 Abs 220 nm A.U.S.F. INIZIO GLICINA 0.1M Markers PM CARICATO COLORAZIONE PROTEINE IN SDS-PAGE FRAZIONI ADSORBITE 97.4 FRAZIONI TEMPO DI ELUIZIONE [min] Colorazione con Coomassie Colorazione con nitrato di argento

43 ELETTROFORESI CAPILLARE Si effettua in un capillare dal diametro di mm in cui è presente una soluzione e non una matrice. Il capillare attraversa un rilevatore a luce ultravioletta o a fluorescenza che misura le proteina mano a mano che migrano nel campo elettrico. Il movimento della proteina è funzione della sua massa e della sua carica risultante, quest ultima influenzata dal ph e dagli analiti presenti in soluzione.

44 ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE Combina la focalizzazione isoelettrica con la separazione in SDS-PAGE Si separano prima le proteine mediante focalizzazione isoelettrica basata sui rispettivi valori di PI In un secondo step si separano le proteine mediante SDS-PAGE in senso perpendicolare alla prima separazione

45 FOCALIZZAZIONE ISOELETTRICA Si ottiene preparando un gel in cui si stabilisce un gradiente di ph utilizzando anfoliti a basso peso molecolare dotati di diversi valori di PI Le proteine migreranno fino alla regione in cui la carica risultante sarà nulla

46 WESTERN BLOT (I) Valutazione identità, aggregazione, frammentazione

47 riferimento aggregati WESTERN BLOT (II) Valutazione identità, aggregazione, frammentazione

48 Marker. Standard Human liver Mouse liver Transgenic VERIFICA DELL ESPRESSIONE DELLA PROTEINA DI INTERESSE pet21a - + SCCA - + b-gal Elettroforesi su gel di poliacrilammide-sds Colorazione con coomassie o argento Western blot (rilevazione con anticorpo)

49 VALUTAZIONE PRODOTTO FINALE E CONTROLLO QUALITA PROTEINE RICOMBINANTI Peso Molecolare: SDS-PAGE, Cromatografia di esclusione, Spettrometria di massa Purezza: SDS-PAGE, Cromatografia di esclusione Concentrazione: Cromatografia di esclusione Spettrometria UV, reazioni colorimetriche Identità: Western blot, RP-HPLC Aggregazione: Cromatografia di esclusione, Western blot Frammentazione: Western blot, SDS-PAGE Eliminazione dei contaminanti (endotossine batteriche): Cromatografia a scambio ionico Sterilità: Filtrazione e Ultrafiltrazione.

50 VALUTAZIONE DELL ATTIVITÀ BIOLOGICA DEL PRODOTTO FINALE Saggi correlati alla funzione specifica della molecola: saggio enzimatico, saggi di binding tipo ELISA (ligando-recettore) Saggi su cellule in coltura: migrazione, proliferazione, attivazione di un recettore Saggi in vivo: verifica della funzione mediante somministrazione della proteina ricombinante in modelli animali

51 Le fasi di produzione possono variare: il prodotto è il processo

52 FORMULAZIONE FARMACI PROTEICI Principali contaminanti Origine Ospite Prodotto Processo Contaminante Virus, batteri Proteine e DNA derivanti dall ospite Varianti di glicosilazione Varianti C- e N-terminali Endotossine Sostituzione e delezione di aa Denaturazione Isomeri conformazionali Dimeri ed aggregati Varianti di appaiamento disolfuro Specie deamidate Frammentazione Componenti del mezzo di crescita Reagenti di purificazione Metalli Materiali della colonna

53 CONSIDERAZIONI MICROBIOLOGICHE STERILITA : i farmaci proteici devono essere assemblati in ambiente asettico, ovvero in camere di classe 100 (corrispondente ad un massimo di circa 3500 particelle 0,5 µm per metro cubo) a flusso laminare di aria filtrata tramite filtri HEPA (High Efficiency Particulate Air), perché sono sensibili al calore e non sopportano l autoclavatura, la sterilizzazione con gas o con radiazioni ionizzanti. La fase di sterilizzazione finale prima di riempire le fiale è la filtrazione attraverso filtri a membrana da 0,2 o 0,22 µm. DECONTAMINAZIONE DA VIRUS: analisi accurata di ogni materiale ed eccipiente utilizzato ELIMINAZIONE DI PIROGENI: i pirogeni sono principalmente endotossine liberate dai batteri gram-negativi (LPS). Vengono demoliti dal calore secco ma per i prodotti ricombinanti, la cromatografia a scambio ionico (utilizzando la carica negativa) può ridurre in modo efficace il livello di endotossine. Anche gli eccipienti devono essere esenti da endotossine: distillazione, osmosi inversa (le endotossine si aggregano), carbone attivo, ossidazione e riscaldamento secco.

54 Struttura generale delle endotossine

55 ECCIPIENTI AGENTI CHE MIGLIORANO LA SOLUBILITÀ: controllo del ph e della forza ionica, aggiunta di aminoacidi come lisina e arginina e tensioattivi come SDS AGENTI ANTI-ADSORBIMENTO E ANTI-AGGREGAZIONE: albumina e tensioattivi TAMPONI: tampone fosfato, citrato e acetato solubilità, stabilità fisica e chimica della proteina dipendono dal ph CONSERVANTI E ANTI-OSSIDANTI: acido ascorbico e formaldeide, antimicrobici come fenolo AGENTI ANTI-OSMOTICI: soluzioni saline, zuccheri e polialcoli

56 AGENTI CHE MIGLIORANO LA SOLUBILITA Le proteine tendono ad aggregare e a precipitare, soprattutto le non glicosilate. L aggregazione può essere di natura fisica (interazioni idrofobe e/o elettrostatiche) ma può avvenire anche mediante la formazione di legami covalenti (ponti disolfuro, legami estere o ammidici)

57 AGENTI ANTI-ADSORBIMENTO Limitano l adsorbimento della proteina attiva da parte delle interfacce: acqua/aria, acqua/parete del recipiente, fase acquosa/utensili utilizzati per la somministrazione. Agiscono da anti-aggreganti Un ottimo agente anti-adsorbimento è l albumina, usata nelle formulazioni proteiche ad elevata concentrazione (1%). Autoassociazione dipendente da: ph concentrazione di insulina forza ionica presenza di eccipienti (Zn 2+, fenolo)

58 CONSERVABILITA DEI FARMACI A BASE DI PROTEINE Le proteine si possono conservare: 1. in soluzione acquosa 2. liofilizzate 3. in forma anidra come compresse L acqua promuove processi di degradazione fisica e chimica delle proteine. Nella liofilizzazione l acqua viene allontanata per sublimazione e non per evaporazione.

59 LIOFILIZZAZIONE = crioessiccamento Tecnica di essiccamento che permette di ottenere, partendo da una soluzione, un solido poroso, friabile, igroscopico, con elevata superficie specifica e velocemente solubile (liofilizzato), per congelamento della soluzione e sublimazione sotto vuoto del solvente. VANTAGGI Scarsa perdita di attività per prodotti delicati e termolabili Ottenimento di un prodotto poroso ed immediatamente reidratabile Possibilità di ottenere prodotti sterili SVANTAGGI Elevato costo dei macchinari Elevati costi energetici Tempi di processo molto lunghi (in media 24 ore/ciclo) Dosaggio preciso ed accurato di prodotto (liquido) nei contenitori finali

60 FASI DELLA LIOFILIZZAZIONE FASE PREPARATORIA DISSOLUZIONE O SOSPENSIONE FILTRAZIONE STERILIZZANTE EVENTUALE RIPARTIZIONE IN CONTENITORI Volumizzanti (mannitolo) e lioprotettori (zuccheri e albumina) FASE DI LIOFILIZZAZIONE PROPRIAMENTE DETTA CONGELAMENTO DELLA SOLUZIONE SUBLIMAZIONE DEL GHIACCIO (essiccamento primario) ALLONTANAMENTO DEL VAPORE (essiccamento secondario) FASE CONCLUSIVA CHIUSURA E SIGILLATURA DEI CONTENITORI (se il prodotto e liofilizzato nei contenitori finali) RACCOLTA, MACINAZIONE E SUDDIVISIONE DEL PRODOTTO (se si effettua la liofilizzazione in bulk)

61 CONGELAMENTO Le proprietà del materiale liofilizzato dipendono strettamente dal metodo usato per congelare la soluzione di partenza. I metodi più importanti sono: CONGELAMENTO LENTO (1 C/min; porta alla formazione di grossi cristalli) CONGELAMENTO RAPIDO (10-60 C/sec; si formano cristalli molto piccoli e il prodotto finale sarà solubile molto più velocemente) Con un ABBASSAMENTO DELLA TEMPERATURA ANCORA PIU VELOCE si forma un solido amorfo Nella liofilizzazione industriale il congelamento avviene per raffreddamento. Il materiale può essere congelato nella stessa camera in cui avviene l'essiccamento o al di fuori, in contenitori detti precongelatori o frigocelle, ponendolo su piastre portaprodotto che vengono raffreddate. E' opportuno disporre il materiale su ampia superficie e con spessore ridotto al minimo per facilitare le fasi successive di liofilizzazione.

62 ASPETTI CINETICI DEL CONGELAMENTO I prodotti da liofilizzare sono costituiti generalmente da soluzioni più o meno concentrate, il cui congelamento è diverso da quello dell acqua pura. Quando si raffredda una soluzione diluita di un sale e si registrano continuamente le temperature si ottiene un grafico simile a quello della figura. La temperatura cade progressivamente fino a 0 C dove si ha un arresto della curva, durante il quale l acqua pura libera il suo calore latente di fusione e si congela come ghiaccio puro. Il sale avrà una concentrazione detta concentrazione eutettica. Temperatura eutettica Continuando ad abbassare la temperatura, troveremo un altro arresto della curva. A questo punto la miscela cede il suo calore latente di fusione e congela. Questa temperatura è detta Temperatura eutettica (Te). L eutettico è quindi un solido costituito da una miscela di cristalli con una composizione uguale a quella della soluzione da cui si separa. E importante conoscere la Te (=temperatura di transizione vetrosa) in quanto per effettuare una liofilizzazione corretta è necessario che la soluzione sia completamente congelata per evitare che durante l essiccamento si abbiano fenomeni di liquefazione.

63 ESSICCAMENTO SOTTO VUOTO O PRIMARIO Quando il preparato è stato congelato viene sottoposto al vuoto per permettere la sublimazione dell acqua (ESSICCAMENTO PRIMARIO). Applicare il vuoto ha il duplice scopo di consentire all acqua di arrivare sotto il punto triplo e quindi sublimare, e di permettere al vapore di allontanarsi velocemente dal prodotto. Il vapore viene convogliato verso un condensatore refrigerato su cui il vapore condensa come ghiaccio sottraendosi all ambiente (1 g di acqua a 0,1 torr = 9500 litri). Quando il prodotto ed il condensatore arrivano alla stessa temperatura (valori di vuoto tra 0.5 e 0.05 torr) il trasporto di molecole d acqua tra le due zone cessa e bisogna riscaldare la massa perchè la sublimazione continui. Ad eccezione delle piccole apparecchiature da laboratorio, dove il calore è apportato dall ambiente esterno, è sempre richiesto un sistema di riscaldamento.

64 DIAGRAMMA DI STATO DELL ACQUA La liofilizzazione consiste fondamentalmente in una sublimazione. Lo stato di aggregazione dell acqua dipende dai valori di temperatura e pressione. Punto triplo dell acqua pressione 4.58 mm Hg temperatura C Al di sotto del punto triplo l acqua sublima; poichè il suo punto triplo è al di sotto della pressione atmosferica, il ghiaccio sublimerà solo a pressione ridotta e questo spiega perchè la liofilizzazione va condotta sotto vuoto.

65 TRASFERIMENTO DEL CALORE DURANTE L ESSICCAMENTO PRIMARIO

66 ESSICCAMENTO SECONDARIO O DESORBIMENTO Quando l'ultimo frammento di ghiaccio è scomparso, si può ritenere terminato l'essiccamento primario: ciò si può apprezzare praticamente attraverso il rialzo di temperatura della massa. L'ESSICCAMENTO SECONDARIO è detto anche desorbimento perché si riferisce all'eliminazione del solvente adsorbito tramite un ulteriore innalzamento di temperatura. L essiccamento secondario serve a ridurre l'umidità dal 7 all'1% circa del peso secco e ad aumentare la conservabilità del prodotto essiccato. ALLONTANAMENTO DEL VAPORE Il vapore prodotto nella sublimazione deve essere allontanato dalla camera. Questo risultato si può ottenere in tre modi: Condensazione su superfici più fredde del prodotto (condensatori) Sottrazione diretta a mezzo di pompe Assorbimento su sostanze igroscopiche Questi tre sistemi hanno in comune la necessità di servirsi di pompe da vuoto.

67 SCHEMA DI LIOFILIZZATORE AUTOCLAVE O CAMERA DI ESSICCAMENTO 1= isolante termico 2= vassoio 3= piastra 4= collegamento col condensatore PIASTRA DI AUTOCLAVE 1= entrata fluido (Raffreddamento o Riscaldamento) 2= uscita fluido 3= piastra

68 Approfondimenti Testi di riferimento Calabrò M.L. Compendio di Biotecnologie farmaceutiche (Edises) Cap. 6, Cap. 7 Crommelin D.J.A. Biotecnologie farmaceutiche (Zanichelli) Cap. 4 Riferimenti Bibliografici