I vasi sanguigni hanno la funzione di fornire ossigeno e nutrienti ai tessuti e agli organi dei diversi distretti corporei dell organismo

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2 I vasi sanguigni hanno la funzione di fornire ossigeno e nutrienti ai tessuti e agli organi dei diversi distretti corporei dell organismo Il processo mediante cui si generano nuovi vasi sanguigni è definito angiogenesi Capillary Blood Vessel

3 Nell adulto ci sono circa EC che delimitano un area di 1000 m 2 in un organismo adulto di circa 70 kg. Il tasso di proliferazione di queste cellule EC è molto basso con un turnover di circa 1000 giorni. embrione adulto

4 Vascular Anatomy

5 L alterazione dell angiogenesi è implicata in diverse patologie umane

6 The hallmarks of cancer Lifelines of Cancer

7 Angiogenesis & Cancer J. Folkman

8 Il concetto che la crescita tumorale è dipendente dall angiogenesi fu presentato da J. Folkman nel 1971 e nella sua forma iniziale sosteneva: Every increment of tumor growth requires an increment of vascular growth

9 Oggi tale concetto è stato validato da > 3000 pubblicazioni scientifiche che mostrano come l angiogenesi sia legata strettamente alla crescita tumorale

10 Without Angiogenesis Tumor Growth stops

11 L importanza dell angiogenesi per la crescita dei tumori è dimostrata da esperimenti effettuati in animali deficitari per l angiogenesi

12 Without Angiogenesis Tumor Growth stops

13 Growth Factors regulate Tumor Angiogenesis Hypoxia Oncogenes

14 Activators of Angiogenesis

15 Modello paracrino di neo-angiogenesi tumorale

16 L attivazione delle cellule endoteliali durante la neoangiogenesi tumorale Distacco periciti Degradazione membrana/matrice Migrazione/proliferazione dilatazione vasi fusione vasi

17 VEGF Family: Ligands & Receptors

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19 La famiglia delle Vasculotropine Esistono 5 membri nei mammiferi: VEGF-A,B,C,D e PlGF Interagiscono con 3 recettori di tipo TK: VEGF-R1,2,3 VEGF-A ha azione mitogenica e chemioattrattante per le cellule EC in coltura VEGF-A induce sprouting e formazione di strutture tubulari VEGF-A induce angiogenesi in vivo VEGF-A induce permeabilizzazione in vivo

20 La famiglia delle Angiopoietine Esistono 2 membri: Ang1 e Ang2 Interagiscono con 2 recettori di tipo TK: Tie1 e Tie2 Ang1 e Ang4 sono agonisti e Ang2 e 3 sono antagonisti Ang1 non è mitogenico non induce formazione di strutture tubulari ma promuove sprouting Ang1 agisce in maniera complementare a VEGF e sembra mediare l interazione fra le EC e le cellule di supporto

21 Angiopoietin Family: Ligands and Receptors

22 L interazione fra Ang1 e Tie2 promuove l associazione fra le cellule endoteliali dei nuovi tubuli e le cellule peri-endoteliali Maturation

23 Sprouting Quando Ang2 interagisce con Tie2, l integrità del vaso è destabilizzata, il che facilita la formazione Maturation di nuovi vasi in risposta a VEGF.

24 Inhibitors of Angiogenesis

25 Endostatin

26 Endostatina Inibisce legame di VEGF a suo recettore Inibisce rottura delle interazioni fra EC/EC e EC/ membrana basale indotta da Inibisce MMP Inibisce neoangiogenesi in vivo

27 Lo Switch Angiogenico A, Tumors less than 1 mm 3 receive oxygen and nutrients by diffusion from host vasculature. B, Larger tumors require new vessel network. Tumor secretes angiogenic factors that stimulate migration, proliferation, and neovessel formation by endothelial cells in adjacent established vessels. C, Newly vascularized tumor no longer relies solely on diffusion from host vasculature, facilitating progressive growth.

28 Lo Switch Angiogenico è un processo efficiente Impianto di cellule tumorali 3 cellule tumorali sono sopravvissute all impianto Le cellule tumorali hanno raggiunto i vasi dell ospite cellule tumorali sono in grado di sviluppare un asse vascolare funzionante

29 Lo Switch Angiogenico: (i) inizio avascolare VEGF Ang2 (Carcinomi)

30 I vasi presenti all interno del tessuto sano presentano caratteristiche diverse dai vasi presenti all interno dei tumori I vasi tumorali sono funzionalmente e strutturalmente anormali, disorganizzati, tortuosi, dilatati, caratterizzati da un diametro irregolare e da un eccessiva ramificazione Il flusso circolatorio è irregolare e caotico, con il risultato di indurre ipossia e acidificazione I vasi hanno numerose fenestrazioni con giunzioni discontinue e membrana basale spesso assente I vasi linfatici funzionali mancano all interno del tumore a causa della ipertensione interstiziale

31 I vasi tumorali hanno caratteristiche patologiche: a,b) una certa frazione di vasi sono rivestiti da cellule tumorali c) le giunzioni fra le cellule endoteliali sono anomale d) i vasi sono fenestrati

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33 Survival: Correlation With Blood Vessel Number and VEGF Levels Predicting distant recurrence in patients with node-negative colon cancer

34 La terapia anti-angiogenetica La terapia anti-angiogenetica del cancro presenta numerosi vantaggi: Può essere utilizzata per molti tumori compresi quelli ematologici Non presenta lo svantaggio della farmaco-resistenza in quanto il suo bersaglio è rappresentato da cellule normali e quindi geneticamente stabili

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36 Strategies to Inhibit Tumor Angiogenesis

37 Strategies to Inhibit Tumor Angiogenesis Target molecules involved in blood vessel formation Tumor-/host-derived angiogenic factors Upstream mediators of angiogenic factor expression (eg, ras) Target endothelial cell survival VEGF Integrins Angiopoietin-1 Target MMPs

38 Storia naturale di un Tumore Maligno Tumore primario Invasione dei tessuti circostanti Metastasi

39 INVASIONE e METASTASI La capacità delle cellule neoplastiche di invadere i tessuti circostanti (invasione) e di disseminarsi in siti non contigui formando nuovi centri di crescita (metastasi) è tipica delle neoplasie maligne

40 Le metastasi peggiorano il quadro clinico Le metastasi sono responsabili della maggior parte dei decessi nei pazienti oncologici e causano un notevole incremento della morbilità. La presenza di metastasi riduce le possibilità terapeutiche peggiora la prognosi. rende difficile o impossibile l eradicazione totale della neoplasia.

41 Le metastasi costituiscono lo stadio finale della progressione neoplastica. DCC p53 APC K-ras Demetilazione Mucosa normale Iperplasia Displasia Carcinoma in situ Carcinoma invasivo

42 Diffusione tumorale (i) Locale (ii) Linfatica (iii) Ematica (iv) Transcelomatica

43 Disseminazione metastatica in specifici organi bersaglio Tumore Modo di disseminazione Bersaglio Sarcoma Ca Polmone Ca Colorettale Ca Prostata Ca Mammella Ca Ovaio Ematogena attraverso le vene intra-tumorali all arteria polmonare Ematogena e linfatica per accesso alla vena polmonare Sistema linfatico mesenterico e vascolatura Portale Vene periprostatiche Ematogena e linfatica Inseminazione su superficie peritoneale, Ematogena e linfatica Polmone Fegato, CNS Fegato, Polmone Osso Polmone, Fegato, Osso, CNS Intraperitoneale, Fegato, Polmone

44 Teorie sulla formazione delle metastasi Seed and Soil (S Paget, 1889) Blood-flow pattern (J Ewing, 1920) Le metastasi si formano nei tessuti dove le cellule trovano condizioni favorevoli (fattori di crescita e citochine) La preferenzialità di organo si può spiegare sulla base di considerazioni emodinamiche

45 Teorie sulla formazione delle metastasi Seed and Soil (S Paget, 1889) Blood-flow pattern (J Ewing, 1920) Metastasi osse di carcinoma mammario e della prostata Metastasi epatiche dei carcinomi gastro-intestinali

46 Teorie sulla formazione delle metastasi I dati sulle metastasi nell uomo indicano l esistenza di una preferenzialità di organo I siti di metastasi sono per la maggior parte gli organi contenenti il primo letto capillare incontrato: Polmone x gli organi che drenano nel circolo venoso sistemico Fegato per gli organi che drenano nel sistema venoso portale

47 Esiste un homing delle cellule tumorali verso organi specifici??

48 HOMING? Le cellule tumorali circolanti si arrestano passivamente al primo letto capillare che incontrano Le cellule (20 µ) si arrestano perchè si bloccano negli stretti (3-8 µ) letti capillari. Esiste una certa specificità di organo che è dovuta più ad una CRESCITA organo-specifica che ad un HOMING preferenziale verso un certo organo

49 HOMING? La disseminazione delle cellule tumorali in un dato organo è dettata inizialmente da cause MECCANICHE e EMODINAMICHE (dimensioni e deformabilità delle cellule, velocità del flusso) Una volta che le cellule hanno attecchito la crescita susseguente dell embolo metastatico dipende dalla compatibilità fra il seed ed il soil che incontrano in quel organo La crescita della metastasi dipende dalle interazioni molecolari fra le cellule tumorali e il microambiente del nuovo organo

50 Chemochine (citochine chemiotattiche) quattro sottogruppi, > 100 membri. due gruppi: α o CXC e β o CC. Due recettori principali (7 TMD accoppiati a proteine G): CXCR 1-N e CCR 1-N monocyte T cell NK dendritic cell JE CXCR2 CXCR3 CXCR4 GROα neutrophil SDF1 mob1

51 Chemochine e cancro Ruolo nel processo metastatico I recettori CXCR4 e CCR7 sono espressi fortemente in ca. mammario I ligandi per questi recettori CXCL12 (SDF-1α) e CCL21 (6Ckine) sono espressi abbondantemente nei siti primari di metastasi

52 Metastasi Ca Mammella Melanoma X

53 La colonizzazione metastatica di un altro organo dipende dalla presenza di adeguati fattori di crescita CXCL12 CCL27 Cute Polmone CXCR4 Ca Mammella

54 La colonizzazione metastatica di un altro organo dipende dalla presenza di adeguati fattori di crescita CXCL12 CCL27 CCR10 Cute Polmone Melanoma

55 Metastasi Chemochine Attivazione MAP chinasi Motilità, migrazione, invasione

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57 Il processo metastatico è altamente inefficiente Melanoma B16: ~ cellule vengono rilasciate nel sangue; le metastasi sono <100

58 Il processo metastatico è composto da più passaggi Tessuto normale Trasformazione Metastasi Vaso Invasione

59 Quali sono i passaggi inefficienti del processo di metastasi??? (che fine fanno le cellule tumorali?) Intravasazione & extravasazione sono fenomeno efficienti (80-90% a 90 ) Solo poche cellule nel sito secondario cominceranno a dividersi per formare una micrometastasi (2% a 3 giorni) Solo una piccola frazione di micrometastasi persisterà, diventerà vascolarizzata e cresceranno fino a diventare macrometastasi (0.02%)

60 La formazione di una metastasi è un processo Darwiniano di mutazione ->selezione -> crescita Cellula staminale tumorale Proliferazione Morte cellulare Morte cellulare

61 Cellula staminale tumorale La capacità metastatica è preesistente in poche cellule all interno della grande etererogeneità fenotipica e genotipica che caratterizza i tumori. Loop Autocrino Non-proliferante Metastatica Independente da GF Non-antigenica

62 La capacità metastatica è preesistente Metastatica Non-proliferante Independente da GF

63 Membrana Basale Matrice Extracellulare Tumore Adesione & Invasione della Membrana Basale Membrana Basale Intravasazione Metastasi Ematogene Adesione alla Membrana Basale & Extravasazione Metastasi

64 Invasione Carcinoma in situ Le cellule tumorali diventano capaci di invadere (esprimono molecole di adesione di superficie) Le cellule tumorali rilasciano proteasi, che degradano l ECM

65 Sulla capacità di invadere si basa la differenza fra tumori benigni e maligni Tumori Benigni Circoscritti Capsulati Differenziati Tumori Maligni Invasivi Metastatici Indifferenziati

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67 Cambiamenti durante l acquisizione del fenotipo metastatico Inattivazione delle E-caderine e/o di β-catenina Cambiamento nell espressione delle Integrine α e β (avβ3/avβ1) Aumento dell espressione delle Proteasi della ECM (upa, MMP-2, MMP-9) Espressione di Chemiochine e relativi Recettori

68 Migrazione Perdita di adesione cellulare (dovuta a downregolazione di E-caderine e integrine ) La perdita e/o la ridotta adesività si associa a segnali di survival e proliferazione

69 Molecole di Adesione Integrine - transmembrane receptors that mediate cell-cell and cell-ecm interactions Famiglia delle Ig - ICAM1, MUC18, VCAM Caderine - glicoproteine di adesione cellulacellula Catenine - interagiscono con i domini intracellulari di E-caderina

70 Integrine Glicoproteine eterodimeriche recettori per ECM. Segnalano per adesione al substrato, apoptosi, proliferazione, angiogenesi, invasione Segnalano alle Placche focali di adesione, siti di contato fra cellule e ECM Ligandi sono: collageno, tenascina, fibronectina, vitronectina, Fattore VIII, trombospondina

71 Le integrine proteggono dall apoptosi avb3: espressa nel melanoma a6b4: espressa nei ca tiroidei

72 Caderine Glicoproteine transmembrana che mediano interazioni cellula-cellula Ca ++ dipendenti. Si trovano nelle Giunzioni Adherens con a- e b-catenina. E-Caderina funziona da soppressore di metastasi E-caderina è la caderina epiteliale V-caderina è la caderina endoteliale

73 La E-Caderina viene eliminata dalle cellule tumorali

74 Effetti della perdita di E-Caderine Perdita di E-Caderina β-catenina nel citoplasma β-catenina nel nucleo

75 Crescita e sviluppo della metastasi Chemokine receptors CXCR4 and CCR7 are highly expressed in human breast cancer cells Ligands for these receptors CXCL12 (SDF-1a) and CCL21 (6Ckine) are abundantly expressed in the primary sites of breast cancer metastasis

76 ECM & membrana basale ECM consente l adesione delle cellule tramite molecole come le integrine. Trasmette segnali alle cellule mediante recettori di adesione. Composta da collagene, proteoglicani, laminina e fibronectina La membrana basale è una forma specializzata di ECM che separa l epitelio dal derma sottostante. Composta da collagene IV, proteoglicani, laminina e entactina

77 MMPs - famiglia di proteasi zinco-dipendenti TIMPs - inibitori tissutali di MMP (1, 2 & 3) L equilibrio è fra MMPs e TIMPs strettamente regolato in cellule normali, e disregolato nei tumori TIMPS MMPs Aumentata capacità invasiva

78 Proteasi Le MMP sono prodotte dalle cellule tumorali e da quelle stromali: Collagenasi Gelatinasi (MMP-2 & 9), Stromielisine (MMP-3), Mt-MMP, Matrilisine Contribuiscono a invasione, angiogenesi e metastasi Degradano ECM e liberano Fattori di crescita

79 La cascata enzimatica di attivazione è confinata alla membrana a livello dei siti di microinvasione della ECM

80 La cascata enzimatica di attivazione è confinata alla membrana a livello dei siti di microinvasione della ECM

81 Le MMP sono secrete sia da cellule tumorali che da quelle stromali

82 Invasione Degradazione matrice migrazione

83 Ingresso nel vaso Poche cellule sopravvivono a causa di : Traumi meccanici Azione del sistema immune (NK e CTL) Anoikis. Meccanismi di difesa: formazione di aggregati di cellule neoplastiche e piastrine. Ridotta esposizione molecole MHC di classe I. Altri vantaggi selettivi.

84 Blocco ed uscita dal vaso Membrana basale esposta. La composizione della ECM favorisce alcuni tipi cellulari

85 L ipotesi della neo-angiogenesi tumorale presentata da Folkman nel 1971 La crescita tumorale è dipendente dall angiogenesi I processi di invasione e metastatizzazione dipendono dall angiogenesi L instaurarsi del fenotipo maligno dipende dallo switch angiogenico Le cellule tumorali stimolano la proliferazione delle cellule endoteliali mediante la secrezione di un Tumor Angiogenesis Factor (TAF) Gli inibitori dell angiogenesi inibiscono sia la proliferazione delle cellule endoteliali in coltura che la crescita dei tumori in vivo Tumori solidi di dimensioni superiori ai 2 mm richiedono un supporto vascolare per crescere ulteriormente

86 L ipotesi di Folkmann oggi I processi di invasione e metastatizzazione dipendono dall angiogenesi L angiogenesi e la disseminazione metastatica sono legate strettamente in quanto entrambe richiedono la degradazione proteolitica della matrice extracellulare. Gli antagonisti dell angiogenesi spesso sopprimono le metastasi. L instaurarsi del fenotipo maligno dipende dallo switch angiogenico In diversi tumori si è osservato che l acquisizione del fenotipo angiogenico correla con l acquisizione di un fenotipo maligno.

87 Le cellule tumorali stimolano la proliferazione delle cellule endoteliali mediante la secrezione di un Tumor Angiogenesis Factor Si genera un circuito di stimolazione bidirezionale fra cellule tumorali, endoteliali e stromali. Le cellule tumorali, le cellule stromali e i linfociti che infiltrano il tumore così come le cellule endoteliali dei vasi intratumorali producono una serie di fattori di crescita, agonisti ed antagonisti dell angiogenesi, proteasi e inibitori delle proteasi, accendono e spengono il fenomeno angiogenico. Gli inibitori dell angiogenesi inibiscono sia la proliferazione delle cellule endoteliali in coltura che la crescita dei tumori in vivo Gli inibitori dell angiogenesi inibiscono la proliferazione e inducono l apoptosi nelle cellule endoteliali. Tumori solidi di dimensioni superiori ai 2 mm richiedono un supporto vascolare per crescere ulteriormente La terapia anti-angiogenetica limita la crescita dei tumori solidi in maniera efficace

88 Programma di crescita invasiva mediato da MET -down-regolazione di E-caderine - switch nell espressione delle integrine -up-regolazione delle MMP

89 Programma di crescita invasiva mediato da MET