Un nuovo semplice metodo per l'ottenimento della colla di fibrina autologa ad uso chirurgico

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1 Un nuovo semplice metodo per l'ottenimento della colla di fibrina autologa ad uso chirurgico Flavio Tarantino (1), Antonio Flores (2), Aldo Gobbi (3), Daniele Salomé (4) (1) Servizio di Anestesia e Rianimazione Generale, Istituto Clinico Humanitas, Rozzano (Milano) (2) Servizio di Immunoematologia e Trasfusionale, Azienda Ospedaliera Fatebenefratelli e Oftalmico, Milano (3) Servizio di Immunoematologia e Trasfusionale, Presidio Oaspedaliero Fornaroli, Magenta (Milano) (4) Servizio di Ricerca e Sviluppo, LP Italiana SpA, Milano Authors present new simple and economic method for autologous fibrin glue production and its surgical immediate risk-free application. Fibrin glue so obtained offers some evident advantages: free-risk safety, simple operativeness, low cost, no problem application. Parole chiave: colla di fibrina, autotrasfusione, Buon Uso del Sangue, rischio trasfusionale Key words: fibrin glue, autotransfusion, blood "good use", transfusion risk Introduzione La colla di fibrina, di derivazione animale od umana, è da tempo impiegata con successo in differenti condizioni chirurgiche 1, 2, 4, 5, 8. La fibrina deriva dalla trasformazione del fibrinogeno, glicoproteina di p.m D, tramite l'azione della trombina. La colla di fibrina di derivazione omologa è stata largamente impiegata in chirurgia 7 per la sua capacità di unire, in maniera rapida e duratura, varie componenti biologiche quali: cute, sottocute, fasce muscolari, vasi, protesi, tessuti d'organo come fegato, milza, rene, polmone ecc. La colla di fibrina, inoltre, può essere utilmente impiegata in sostituzione o a complemento delle suture chirurgiche e per la loro impermeabilizzazione 3. La colla autologa è in grado di formare un coagulo di fibrina che possiede le stesse capacità biologiche: - emostatica, - adesiva, grazie alla formazione di fisiologici legami covalenti fra fibrina, fibronectina e collageno tissutale, Ricevuto: 10 settembre Accettato: 31 ottobre 2000 Corrispondenza: Dott. Antonio Flores Via A. Lecchi, Milano - stimolante tissutale, per la presenza di sostanze quali la fibronectina, con, in più, la possibilità di predeterminare la consistenza e il tempo di coagulazione, in modo da poter coprire tutte le necessità del chirurgo in termini di plasmabilità della colla in situ. Con l'aggiunta, inoltre, di materiale quale biovetro, sostituto d'osso o, meglio, di materiale bio-autologo, quale frazione d'osso del paziente e similari, la colla di fibrina autologa consente la ricostituzione d'osso per i grandi riempimenti. In tutti i casi, il mescolamento del sostituto osseo col collante biologico consente di: 1- posizionare agevolmente il materiale (o il biomateriale), che rimane in situ più agevolmente; 2- creare un supporto stabile che facilita l'utilizzo di biomembrane; 3- riempire agevolmente e stabilmente anche grosse cavità. Tutto questo rappresenta, ad esempio, un valido aiuto nella comune routine chirurgica orale, grazie ad una tecnica semplice, poco costosa e scevra da rischi intrinseci. Gli Autori hanno ideato e sperimentato una metodica molto semplice ed economica per ottenere colla di fibrina ad uso chirurgico. Diversamente da tutte le altre metodologie presenti in letteratura sino al 96, che prevedono l'utilizzo di metodica chimica (estrazione etanolica 4,6 ) o di diversa metodica fisica (crioprecipitazione 3-5 ), la tecnica proposta prevede la preparazione per centrifugazione e la separazione fisica mediante una speciale membrana (Figura 1) idonea a concentrare il fibrinogeno. Questa tecnica: - semplifica e velocizza la preparazione di colla di fibrina autologa ad uso chirurgico; - ne consente l'ottenimento estemporaneo, perioperatoriamente, in tempi molto contenuti (fra 30 e LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol num. 1 gennaio-febbraio 2001 (37-46) 37

2 F Tarantino et al. Figura 1 60 minuti, vedi materiali e metodi), mediante un semplice prelievo ematico venoso e l'uso di una comune centrifuga da laboratorio. La resa del metodo è, inoltre, molto elevata, in quanto si riesce ad ottenere una quantità di colla variabile tra il 40 ed il 50 % rispetto al volume di sangue prelevato. Si basa, infatti, su di una doppia separazione in centrifuga: - prima centrifugazione: si ottiene plasma per un volume pari a circa il 50% del volume di sangue iniziale; - seconda centrifugazione: (vedi Grafici 3 e 4) si ottiene fibrinogeno concentrato per un volume indicativamente pari al 50% del plasma; - miscelazione finale: in rapporto volumetrico 1:1 con attivatore, durante la fase di dispensazione, riporta il volume finale della colla di fibrina ottenuta a circa il 50% del volume di sangue prelevato. Materiali e metodi La tecnica prevede di partire da un semplice prelievo di sangue, reso incoagulabile mediante citratazione (con sodio citrato, biidrato, al 3,2%, molarità 0,1088, in ragione di 100 µl/ml di sangue). La quantità prelevata deve essere naturalmente commisurata all'entità di colla che si vorrà ottenere, tenendo conto del rendimento citato. Si è impiegato un modello sperimentale molto semplice, che prevede: 1- prelievo di sangue mediante provetta contenente sodio citrato, in quantità predeterminata, secondo necessità e tenendo conto della resa come sopra indicato; 2- prima centrifugazione a rpm per 10 minuti primi, per ottenere un plasma completamente privo di cellule (G.R, G.B, piastrine)*; 3- trasferimento del plasma, in condizioni di sterilità, in apposita provetta filtro (Figura 1); 4- seconda centrifugazione a rpm (2.028 x g nella centrifuga utilizzata per la sperimentazione) per un tempo variabile da 30 a 60 primi (vedi Grafici 1-4) per ottenere il concentrato di fibrinogeno dalla provetta col filtro, * La sottrazione di queste sue componenti riduce il plasma a "frazione di plasma", il che rende la metodica proposta ben accetta anche da parte dei Testimoni di Geova. 38

3 Nuovo metodo per la colla di fibrina autologa Figura 2 5- trasferimento del concentrato di fibrinogeno in apposita siringa di miscelazione e dispensazione (Figura 2). L'intera operazione può essere effettuata durante la fase di preanestesia del paziente, utilizzando per il prelievo la stessa via praticata dall'anestesista. La centrifugazione per concentrare il fibrinogeno avviene mediante la speciale provetta (Figura 1), dotata di idoneo tappo a tenuta che garantisce il mantenimento della sterilità anche durante la successiva fase di prelievo del fibrinogeno concentrato. Al fondo della camera superiore è collocato il supporto per la membrana specifica del sistema. La porosità della membrana è elemento fondamentale per il risultato che si vuole ottenere. Gli Autori hanno determinato che è possibile operare soddisfacentemente con taglio molecolare nominale (MWCO o porosità) fra e D: quanto più la membrana ha porosità vicina al p.m. del fibrinogeno, tanto più rapidamente si ottiene il concentrato e viceversa; contemporaneamente, però, si ottiene una resa volumetrica tanto più bassa quanto più alta è la porosità della membrana. Nel corso della sperimentazione cui fanno riferimento i dati presentati, gli Autori hanno utilizzato una membrana da D, porosità, considerata adeguata per gli utilizzi normali. In tali condizioni, è possibile concentrare il fibrinogeno e tutte le altre proteine ad alto peso molecolare al disopra della membrana. I parametri di centrifugazione, durata e accelerazione, forniti a titolo indicativo, influiscono sul livello di concentrazione del fibrinogeno ricercato. Come è intuitivo, maggiori sono l'accelerazione ed il tempo di centrifugazione, più alto sarà il dosaggio (titolo della concentrazione) del fibrinogeno ottenuto (Grafico 1). Vediamo nel dettaglio. Per quanto riguarda il tempo di centrifugazione indicato, possiamo distinguere le fasi che seguono. 1- Tra 0 e 30' si verificano un notevole incremento della concentrazione del fibrinogeno ed una vistosa riduzione volumetrica del campione, tanto maggiore quanto maggiore è l'accelerazione raggiunta. 2- Tra 30' e 45' questi fenomeni rallentano notevolmente, sino quasi ad azzerarsi dopo 45' (limite consigliato, agli effetti pratici, con qualsiasi centrifuga). 3- A 60' si ottengono pressoché le massime concentrazioni ed i minimi volumi raggiungibili. Possiamo riassumere, indicando il limite temporale di 30' quale ottimale nel caso si utilizzi un sistema di centrifugazione che consenta di lavorare attorno a x g, mentre consigliamo di usare i 45' laddove il sistema lavori attorno a x g. 39

4 F Tarantino et al. Grafico andamento della concentrazione del fibrinogeno, in funzione dell'accelerazione (xg) e del tempo di centrifugazione a 38 C Grafico andamento della concentrazione del fibrinogeno a 4.500xg in funzione del tempo, a 5 C Segnaliamo, infatti, che con tale sistema si perviene, nel tempo indicato di 45 minuti primi, a circa il 75-80% della concentrazione massima ottenibile partendo da plasma fresco non congelato, proveniente da sangue prelevato da non più di 4-6 ore (Grafico 2, in cui si riporta un caso ritenuto rappresentativo della casistica osservata). Ogni variazione di porosità, durata ed accelerazione influisce come descritto e come rilevabile dai grafici 1 e 2. Alla fine di questa seconda centrifugazione si ottiene un emoderivato, precursore della colla autologa, vale a dire il liquido collante, contenente il concentrato di fibrinogeno. Questo è un vero preparato autologo, cioè la base di partenza per l'ottenimento della colla di fibrina, che viene ad essere prodotta semplicemente miscelando intimamente il concentrato con un opportuno catalizzatore (Figura 2 ). Con l'uso di trombina, ad esempio, il clotting time è di pochi secondi (3-4), e tale si mantiene anche se si 40

5 Nuovo metodo per la colla di fibrina autologa Grafico 2 - andamento medio della concentrazione del fibrinogeno in centrifugazione a 38 C - accelerazione 2.028xg aggiungono, con effetto diluizione, sensibili quantità di altre sostanze che hanno lo scopo di migliorare la performance del coagulo finale: ad esempio antifibrinolitici (aprotinina, acido ε-amino caproico, acido tranexamico) e cloruro di calcio. È chiaro che per ottenere un coagulo rigorosamente autologo si debba utilizzare trombina autologa (oggi non disponibile) o tromboplastina ricombinante, disponibile sul mercato ma non per uso clinico; ricordiamo, però, che l'uso di tromboplastina ha provocato, nel corso dei nostri esperimenti, un allungamento intollerabile dei tempi di formazione del coagulo bianco (2-3 minuti). Quello che abbiamo potuto rilevare è che nel collante la concentrazione del fibrinogeno è funzione di vari parametri: 1- gravità raggiunte (funzione del numero di giri e del raggio della centrifuga); 2- concentrazione del fibrinogeno nel plasma di partenza ; 3- temperatura del campione; 4- tempo di centrifugazione; 5- porosità della membrana adottata. Considerando variabile indipendente la concentrazione iniziale del fibrinogeno nel plasma di partenza, quindi alla stregua di una costante su cui non possiamo influire, esaminiamo l'effetto di ciascuno degli altri parametri, modificando i quali risulta possibile variare e prevedere la concentrazione e il volume finale del fibrinogeno concentrato, raggiungibili, e, quindi, il volume finale del collante a disposizione. Della porosità della membrana e dei suoi effetti si è già detto; così pure del tempo di centrifugazione e dell'accelerazione applicata. A questo riguardo, si noti che l'accelerazione è funzione del raggio di centrifugazione e della velocità angolare raggiungibile, entrambi parametri dettati dai limiti della centrifuga a disposizione, ma fortunatamente, nei casi meno felici, in larga misura compensabili con la durata dell'operazione. Mentre si rimanda al grafico 1 per i limiti di applicabilità, si riporta che, come ovvio, al diminuire del volume del concentrato si ottiene un incremento della concentrazione di fibrinogeno (dosaggio). Da ultimo, si noti che trattandosi di materiale biologico fresco, da usare fresco, si è riscontrato che una temperatura di centrifugazione di 38/39 C contribuisce ad un aumento di circa il 5-10 % della concentrazione finale, rispetto alla stessa operazione condotta con analoga centrifuga termostatata a 5 C. In merito, si vedano i grafici 3 e 4 e la Tabella I in cui per "Dos. Iniz." si legga Dosaggio iniziale del fibrinogeno dei campioni di Pool e per "Dos. 60'" si legga Dosaggio dopo 60' di centrifugazione a x g. Nei grafici 3 sono rappresentati l'andamento della contrazione volumetrica e della concentrazione del fibrinogeno di 8 campioni conservati a temperatura ambiente, prima del passaggio in centrifuga refrigerata a 5 C, mentre 41

6 F Tarantino et al. Grafico andamento volumetrico - 8 campioni a 5 C Grafico andamento Dosaggio Fibrinogeno - 8 campioni a 5 C Grafico campioni a 20 C Grafico campioni a 20 C 42

7 Nuovo metodo per la colla di fibrina autologa Tabella I Campione T C Dos. Dos. Fattore iniz. 60 di Concentr. A 5 192,3 382,2 2,0 B 5 232,8 406,4 1,7 C 5 259,7 433,8 1,7 D 5 275,3 415,1 1,5 E 5 263, ,5 F 5 275,3 453,8 1,6 G 5 151,5 433,7 2,9 H 5 245,6 374,7 1,5 I 5 263,1 398,1 1,5 J 5 263,0 423,9 1,6 K 5 262,9 414,9 1,6 L 5 263,1 476,1 1,8 M 5 288,1 476,0 1,7 N 5 252,2 423,9 1,7 O 5 258,8 443,1 1,7 P 5 258,9 499,9 1,9 250,4 428,4 1,7 medio Q , ,0 R ,1 475,8 2,7 S ,9 475,8 2,0 T ,3 453,8 1,9 U ,1 453,8 1,9 V ,8 475,8 2,0 W ,9 525,9 1,9 X ,1 513,1 2,2 Y ,9 475,9 1,8 234,9 476,2 2,1 medio Generale 244,8 445,6 1,9 media Grafico 5 nei grafici 4 si rilevano gli stessi di 3 campioni conservati analogamente ma centrifugati a 20 C. Il mantenimento a C del fibrinogeno contribuisce in maniera considerevole alla formazione della massa gelatinosa prima e del coagulo poi, allorché intimamente miscelato con opportuno starter della coagulazione, pure mantenuto alla stessa temperatura. Pur disponendo di una massa di dati molto dispersiva, si è osservato che il tempo di gelificazione/coagulazione si riduce di circa il % rispetto allo stesso effettuato con fibrinogeno e starter mantenuti tra temperatura ambiente e di refrigerazione (a 5 C). Il grafico 5 rivela inoltre che, quanto meglio si miscela intimamente il fibrinogeno con lo starter (tempo di eiezione più lungo significa miglior reciproca compenetrazione per maggior permanenza all'interno del miscelatore), tanto più rapida risulta la formazione del coagulo dall'uscita dal miscelatore, fino a risultare già compiuta nel momento stesso della fuoriuscita. Si noti che l'utilizzo di starter da 1 UI induce la permeazione del fibrinogeno da parte dello starter con tempi mediamente superiori ai 2 minuti, scarsamente influenzabile dalla modalità della miscelazione. Altre esperienze (Grafico 6) ci portano ad affermare che, a parità di contenuto in UI di trombina, l'aumento della "diluizione" dello starter nel fibrinogeno (rapporto fibrinogeno/starter che passa da 1:1 fino a 7:1) hanno un 43

8 Grafico 6 - influenza del rapposrto tra fibrinogeno e starter effetto ritardante nei tempi di coagulazione. Al contrario l'inversione di tale rapporto (aumento della quantità di starter nel fibrinogeno, da 1:1 fino a 9:1) non ha effetto significativo. Il cambiamento si verifica a partire dal rapporto paritetico. Naturalmente, supponendo non aumentabili né l'accelerazione a disposizione, né (per altri ovvi motivi) la temperatura di 38 C, l'unico parametro veramente a disposizione per aumentare la concentrazione risulta il tempo di centrifugazione. Potremmo provare a variare all'infinito questi parametri, ma il nostro obiettivo è il raggiungimento di una concentrazione finale di fibrinogeno nel campione almeno doppia, rispetto a quella di partenza. Questo è il vero dato sensibile che può far variare realmente le performances del coagulo di fibrina ottenibile (Grafico 7) in cui si è voluta riproporre la condizione di centrifuga più comune nei laboratori. Abbiamo, infatti, osservato che, aldilà dei tempi di coagulazione di cui ai vari grafici forniti, quanto più alto è il dosaggio iniziale del fibrinogeno, tanto migliore è la gelatinificazione della fibrina, la sua consistenza e tanto minore è la fase liquida residua finale, la quale nelle condizioni migliori risulta addirittura assente. Nel nostro modello sperimentale presentiamo 11 casi ed in ciascuno di essi abbiamo rilevato la concentrazione del fibrinogeno basale, a 30', 45' e 60'; tutti questi dati sono contenuti nella tabella II e nel grafico 7. La rilevazione nei campioni è stata fatta mantenendo costanti la temperatura (38 C) e le gravità (2.028 x g pari a circa rpm nella nostra centrifuga: ALC 4239). Come si può notare l'unica variabile introdotta è stato il tempo di centrifugazione. Mediante una normale siringa sterile, passando attraverso il tappo perforabile (Figura 1), si preleva quindi il fibrinogeno concentrato e lo si trasferisce in uno dei due cilindri dell'apposita siringa (Figura 2) dotata di miscelatore statico. Analoga operazione si effettua con lo starter della coagulazione prelevato alla stessa temperatura e immesso, approssimativamente in rapporto 1:1, nel secondo cilindro della stessa siringa. L'introduzione del doppio stantuffo conclude l'operazione rendendo la colla pronta per l'utilizzo. Il chirurgo può eiettare l'insieme dei due prodotti, intimamente miscelati per effetto del passaggio attraverso il miscelatore statico, pronti a divenire a questo punto già colla di fibrina in formazione o formata, con la possibilità di stenderlo direttamente sulla parte cruentata. A seconda dei casi, può essere richiesto un coagulo di più o meno rapida formazione e di maggiore o minore consistenza. Due sono i parametri che consentono un più fine controllo dell'operazione: 44

9 Grafico 7 - concentrazione fibrinogeno/tempo a 2.028xg Tabella II: andamento della Concentrazione del Fibrinogeno in centrifugazione a 38 C - accelerazione xg Campione Tempi di centrifugazione (minuti) A B C D E F G H I L M la concentrazione dello starter espressa in unità internazionali (NIH) per ml di iniettabile; 2- la velocità impressa allo stantuffo dal chirurgo ossia il tempo impiegato per l'eiezione della colla di fibrina che fuoriesce. Si rileva che, utilizzando come starter una sostanza ad attività trombinosimile, le concentrazioni utili possono variare da 1 a 3 NIH/mL. Nel corso della sperimentazione riferita, quale starter si è preferito impiegare un farmaco iniettabile (Botropase) già in commercio, derivato da veleno di serpente, per motivi di disponibilità e di sicurezza: non sussistono, infatti, rischi di trasmissione di malattie infettive (AIDS o sindrome detta della "mucca pazza") come potrebbe avvenire con trombina di derivazione umana o bovina (per questa ragione l'fda non ha mai concesso la relativa approvazione all'uso negli Stati Uniti), al contrario le differenze tra l'animale a sangue freddo e l'uomo sono tali da consentirne l'uso per via iniettabile. Usando 1 NIH (Grafico 5) otteniamo il coagulo bianco entro secondi, mentre con 3 NIH lo 45

10 otteniamo nel breve spazio di pochi secondi. In ogni caso, possiamo utilizzare eiezioni rapide o molto lente: per molto lenta si intende una eiezione di circa secondi, che corrisponde alla fuoriuscita praticamente goccia a goccia direttamente sopra il sito desiderato. In merito, si evidenzia che il mantenimento a circa 38 C fino alla eiezione di entrambi i componenti esalta la performance complessiva rispetto alla stessa se attuata a temperature più basse (4-10 C) nell'ordine di un 15-25% in termini di aumento della reattività e quindi, in ultima analisi, dei tempi di gelificazione. Risultati e conclusioni Con il nostro metodo sono difficilmente raggiungibili concentrazioni finali di fibrinogeno analoghe a quelle presenti nell'unico emoderivato pronto all'uso presente in commercio (Tissucol); ciò nonostante, non abbiamo notato differenze sostanziali né nel clotting time, né nella capacità adesiva del coagulo ottenuto. Queste due caratteristiche rappresentano un indubbio vantaggio del nostro sistema, in quanto, se per ottenere performance simili noi dovessimo raggiungere nel nostro campione finale concentrazioni di fibrinogeno analoghe al Tissucol, necessariamente dovremmo impiegare temperature molto alte e tempi di centrifugazione molto dilatati, con fatale perdita di praticità del sistema. In alternativa, potremmo agire sulle gravità raggiunte nella centrifugazione aumentandole in modo sensibile. È chiaro che per attuare ciò dovremmo impiegare ultracentrifughe, con necessità, quindi, di attrezzature speciali molto costose. Una spiegazione plausibile del fatto che, comunque, la nostra colla si comporti come il Tissucol, risiede nel fatto che probabilmente nel nostro concentrato di fibrinogeno non ritroviamo fibrinolitici, forse perché, date le loro piccole dimensioni, passano la membrana del sistema e finiscono nell'ultracentrifugato. Un'altra sostanziale differenza tra il nostro metodo e quelli proposti sino ad ora in letteratura è che noi otteniamo la separazione e la concentrazione del fibrinogeno unitamente ad una serie di proteine della coagulazione ad alto peso molecolare, quali fattore V, VIII, IX, X, XI e XIII, nel comparto superiore (sezione 1) della nostra provetta. Potremmo, inoltre, sfruttare le proprietà terapeutiche di queste ultime nei casi di loro carenza (Emofilia, CID, ecc.). Nello scomparto inferiore, invece, si concentrano - oltre all'albumina, acqua ecc. - tutta una serie di sostanze (per es. fibronectina) le cui potenzialità a tutt'oggi non risultano del tutto chiarite. Esistono per ora alcuni dati sperimentali che sembrano indicare come l'uso delle sostanze presenti in questo liquido (ultrafiltrato: sezione 2 della provetta) abbiano un effetto stimolante tissutale favorenti la guarigione delle piaghe da decubito e delle ulcere, oltre ad avere un effetto antalgico notevole sulle stesse (fonte: prove sperimentali dirette su paziente). Riassunto Gli Autori presentano un metodo innovativo, semplice, economico per l'ottenimento di colla di fibrina autologa ad uso chirurgico. La metodologia si differenzia da tutte quelle proposte in letteratura, sostanzialmente per l'utilizzo di un sistema mediante centrifugazione. Questa metodica prevede l'impiego di una speciale membrana a porosità nota per concentrare il fibrinogeno nel plasma di partenza. La colla che si ottiene offre tre enormi vantaggi rispetto a metodiche o prodotti attualmente disponibili sul mercato: sicurezza, operatività semplice, economicità. Bibliografia 1) Reiss RF, Oz MC: Autologous fibrin glue: production and clinical use. Transfus Med Rev, 10, 85, ) Isaacson G, Herman JH: Autologous plasma fibrin glue: rapid preparation and selective use. Am J Otolaryngol, 17, 92, ) Silver FH, Wang MC, Pins GD: Preparation of fibrin glue: a study of chemical and physical methods. J Appl Biomater, 6, 175, ) Silver FH, Wang MC, Pins GD: Preparation and use of fibrin glue in surgery. J Appl Biomater, 16, 891, ) Tawes RL Jr, Sydorak GR, DuVall TB: Autologous fibrin glue: the last step in operative homostasis. Am J Surg, 168, 120, ) Kjaergard HK, Weis-Fogh US: Important factors influencing the strength of autologous fibrin glue: the fibrin concentration and reaction time-comparison of strength with commercial fibrin glue. Eur Surg Res, 26, 273, ) Quigley RL, Perkins JA, Gottner RJ et al.: Intraoperating procurement of autologous fibrin glue. Ann Thorac Sur, 56, 387, ) Casali B, Rodeghiero F, Tosetto A et al.: Fibrin glue from single-donation autologous plasmapheresis. Transfusion, 32, 641,