DIRETTORE SOD COMPLESSA EMATOLOGIA PROF. ALBERTO BOSI Dipartimento di Medicina Sperimentale e Clinica

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1 DIRETTORE SOD COMPLESSA EMATOLOGIA PROF. ALBERTO BOSI Dipartimento di Medicina Sperimentale e Clinica UNIVERSITA DEGLI STUDI DI FIRENZE Titolo: Caratterizzazione clinica ed identificazione di markers immunopatologici della Graft versus Host Disease (GvHD) nel trapianto di sangue cordonale

2 PROBLEMA-ESIGENZA CHE SI INTENDE AFFRONTARE L'impiego di sangue di cordone ombelicale quale fonte alternativa di cellule staminali emopoietiche ha consentito l'applicazione del trapianto da donatore non correlato anche in condizioni di incompatibilità del sistema HLA, offrendo un'opportunità terapeutica ad un più elevato numero di pazienti sia in età pediatrica che in età adulta (Kurtzberg 1996, Gluckman 1997, Rubinstein 1998, Laughlin 2001, Barker 2001, Wagner 2002, Barker 2003, Barker 2005, Brunstein 2007). Il recente report dell EBMT (European Group for Blood and Marrow Transplantation) ha confermato un incremento dell uso di sangue cordonale (395 trapianti nel 2005 contro 544 trapianti nel 2006, pari al 5% di tutti trapianti allogenici effettuati) (Gratwol 2007). In Italia nel 2008 sono stati effettuati oltre 120 trapianti di cellule staminali emopoietiche da sangue cordonale (IBMDR), con costante incremento annuale. Oltre alla minore restrizione del grado di compatibilità del sistema HLA richiesto tra donatore e ricevente, tra i numerosi vantaggi dell'utilizzo di questa fonte emopoietica alternativa rispetto al midollo osseo vi sono una più rapida ricerca di un donatore non correlato rispetto a quella di un donatore da registro, una più facile reperibilità di unità conservate ed una significativa riduzione dell'incidenza e della gravità di gravi reazioni immunologiche post-trapianto, quali la malattia da trapianto contro l'ospite (Graft versus Host Disease, GvHD) (Rocha 2001, Grewal 2003, Rocha 2004). E' stato infatti dimostrato che le cellule emolinfopoietiche cordonali mostrano peculiarità immunologiche fenotipiche e funzionali rispetto al corrispondente adulto, sia midollare che da sangue periferico, quali immaturità e scarsa alloreattività, con conseguente ridotta espressione e/o produzione di citochine proinfiammatorie responsabili dello sviluppo di GvHD. A fronte di tali vantaggi, il sangue cordonale presenta un numero limitato di cellule staminali emopoietiche che comporta un tempo di attecchimento mediamente più prolungato rispetto al donatore convenzionale, ed una lenta ricostituzione immunologica, che rappresenta forse il problema clinico più rilevante, con conseguente aumentato rischio di infezioni di grado severo anche oltre 6 mesi dal trapianto (Sauter 2008). Peraltro, il problema della scarsa cellularità cordonale è stato recentemente superato grazie alla somministrazione diretta, cosiddetta "intrabone" di cellule staminali cordonali, anziché endovena, e tale tecnica innovativa consente di effettuare trapianti di sangue cordonale con successo in un numero crescente di pazienti di età adulta (Frassoni 2008). Tra i fattori di rischio associati allo sviluppo di GvHD a seguito di trapianto di sangue cordonale sono stati indicati la compatibilità HLA (Gluckman 1997, Rubistein 1998, Eapen 2007), l'età del paziente (Rubinstein 1998) ed una pregressa infezione da citomegalovirus (CMV) (Gluckman 1997), sebbene in altri studi tali associazioni non siano state confermate (Laughlin 2001, Wagner 2002, Michel 2003). Recentemente è stato dimostrato che la GvHD acuta insorge più frequentemente e più precocemente qualora si utilizzino due unità di sangue cordonale parzialmente incompatibili rispetto alla singola unità, e che quando si sviluppa una GvHD acuta a seguito di un doppio trapianto di sangue cordonale da donatore non familiare spesso si tratta di un quadro di grado II coinvolgente principalmente la cute con ridotta incidenza di mortalità correlata (MacMillan 2009). 2

3 Osservazioni recenti suggeriscono che talora i pazienti sottoposti a trapianto di sangue cordonale sviluppino eruzioni cutanee eritemato-maculari o alterazioni cutanee (in forma isolata o in associazione a sintomatologia del tratto gastroenterico) atipiche per tipologia di lesione elementare, tempo di insorgenza ed evoluzione clinica. In questo subset di pazienti l'accurato e tempestivo inquadramento della GvHD in base a dati clinici e laboratoristici può talora essere difficile ed al presente non è chiaro quale sia il reale contributo della biopsia cutanea a fini diagnostici. Attualmente è controversa anche l'utilità della biopsia cutanea nel fornire indicazioni al clinico di carattere prognostico e terapeutico, poiché è stato sottolineato che la morfologia tradizionale non sempre correla con l'entità del quadro clinico ed i singoli parametri istopatologici in fase iniziale sono associati a scarsa specificità e sensibilità (Zhou Y 2000, Firoz BF 2006). Al contrario, non vi è dubbio che la caratterizzazione immunofenotipica della componente cellulare (con particolare riferimento alle cellule presentanti l'antigene) osservata nella biopsia cutanea possa contribuire a chiarire la patogenesi della GvHD e fornire utili indicazioni inerenti il chimerismo (Willemze AJ 2009) e l'entità del danno tissutale. Studi recenti attribuiscono alle cellule presentanti l'antigene (APC) del ricevente un ruolo chiave della patogenesi della GvHD (Duffner 2004) ed è stato suggerito che la comparsa di una GvHD possa dipendere dalla protratta sopravvivenza di alcune tipologie di APC del ricevente (Haniffa 2009). Al presente tuttavia non è noto se nelle biopsie cutanee di pazienti con GvHD o con eruzioni cutanee sospette per GvHD a seguito di trapianto da sangue cordonale vi siano alterazioni quali-quantitative e funzionali delle cellule presentanti l'antigene. Sebbene la concentrazione delle APC sia sostanzialmente comparabile nel sangue cordonale e nel corrispettivo adulto, la percentuale di elementi con fenotipo maturo (CD11c - /CD123 dim ) e linfoide (CD11 + /CD123 bright ) è aumentata. Abbiamo recentemente dimostrato che nelle biopsie cutanee prelevate in corso di GvHD un aumentato numero di linfociti T con funzione regolatoria (T-Reg), FOXp3+/CD4+/CD25+ correla con una GvHD meno severa e con una risposta al trattamento (Fondi 2009). Al presente non vi sono studi che abbiano specificatamente indagato l espressione dei linfociti T-Reg in biopsie cutanee prelevate da pazienti sottoposti a trapianto da sangue cordonale. Lo studio delle APC e dei linfociti T-Reg in situ potrebbe fornire utili indicazioni di carattere prognostico in relazione alla capacità delle APC di promuovere l attivazione dei T-Reg e della loro funzione soppressiva. La possibilità di disporre di campioni di cute affetta in pazienti con eruzioni cutanee sospette di GvHD raccolti in maniera prospettica unitamente a campioni di sangue periferico, dati citofluorimetrici ed informazioni cliniche inerenti l'evoluzione della GvHD, appare indispensabile ai fini di meglio comprendere la biologia della GvHD a seguito di trapianto di sangue cordonale e di stabilire se effettivamente essa presenti delle specificità rispetto alla GvHD comunemente osservata a seguito di trapianto da altra fonte di cellule staminali emopoietiche. 3

4 OBIETTIVI STRATEGICI L'obiettivo principale dello studio è quello di identificare marker(s) immunopatologici della GvHD da trapianto di sangue cordonale che migliorino l'accuratezza della diagnosi e che forniscano dei criteri utili per la stratificazione prognostica dei pazienti. L'obiettivo principale verrà perseguito tramite la realizzazione dei seguenti obiettivi specifici: 1. Creazione di un database clinico La prima fase del progetto prevede la realizzazione di un archivio (database) nel quale registrare i singoli casi con i relativi dati clinici, comprendente la diagnosi, lo stadio di malattia al trapianto, la caratterizzazione del graft, il condizionamento e l immunosoppressione somministrata. Una sezione sarà dedicata alla descrizione clinica della GVHD che consenta di individuare anche caratteri di atipia rispetto alle classificazioni convenzionali. Una sezione infine descriverà la terapia somministrata e l outcome clinico. L'inserimento di questi dati si accompagnerà alla simultanea raccolta ed archiviazione dei campioni biologici per le successive analisi. In questa prospettiva, la definizione della tipologia dei campioni da raccogliere e delle modalità di conservazione sarà il primo compito del gruppo di lavoro. Nel trasferimento dei dati clinici e dei relativi campioni all'archivio i dati identificativi e sensibili di ciascun paziente verranno anonimizzati attraverso appropriata procedura. 2. Allestimento di un archivio di campioni biologici Il presente progetto prevede lo stoccaggio di i) campioni di sangue e ii) campioni tissutali cutanei prelevati in corso di eruzioni cutanee sospette per GvHD a seguito di trapianto di sangue cordonale. I prelievi di campioni di sangue e cute saranno effettuati presso il TMO, AOUC (Firenze). Per ogni tipologia di biomateriale, il paziente sarà informato da personale qualificato sulle finalità delle attività dell'archivio e ne sarà raccolto il consenso. Saranno affrontati aspetti etici e giuridici inerenti la tutela della riservatezza, l'identificazione del campione (rintracciabilità) e anonimato, la proprietà del materiale biologico, informativa e consenso. Verrà richiesta approvazione dello studio da parte del Comitato Etico. 3. Analisi morfologica ed immunofenotipica su biopsia cutanea Campioni tissutali prelevati in corso di biopsie cutanee su eruzioni cutanee clinicamente sospette per GvHD saranno sottoposte ad analisi morfologiche ed immunofenotipiche con lo scopo specifico di valutare alterazioni quantitative e qualitative di APC, T-Reg e chimerismo. I markers cosi identificati verranno valutati in base al decorso della malattia allo scopo di definirne il valore diagnostico e prognostico ed per il monitoraggio del successo/fallimento delle varie terapie effettuate. 4

5 ARTICOLAZIONE DEL PROGETTO IN FASI ATTIVITÀ Creazione di un database clinico Nel presente studio saranno i pazienti reclutabili sono quelli conformi ai seguenti criteri di inclusione: a. pazienti sottoposti a trapianto di sangue cordonale presso il Centro Trapianti Midollo Osseo, Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi, Firenze; b. pazienti con manifestazioni cutanee (associate o meno a sintomatologia gastro-intestinale o di altro organo) clinicamente sospette per GvHD. I dati clinici che verranno inseriti nel database sono i seguenti: età e sesso del paziente, malattia di base, status al trapianto, grado di compatibilità HLA tra donatore e ricevente, data del trapianto, status CMV per donatore/ricevente, regime di condizionamento, profilassi della GVHD somministrata sino al momento dell esordio clinico, descrizione dei sintomi associati e grading della GVHD secondo due o più scale riportate nel form, terapia somministrata, evoluzione clinica. In riferimento all'eventuale comparsa di eruzioni cutanee, verranno raccolte informazioni dettagliate sulla tipologia di lesione elementare, numero di lesioni, distribuzione anatomica ed evoluzione. Verrà allegata documentazione fotografica dell'eruzione cutanea, possibilmente in fase di esordio, fase di stato e risoluzione. Allestimento di un archivio di campioni biologici Per ciascun paziente con eruzione cutanea sospetta per GvHD è prevista la tempestiva esecuzione di una biopsia cutanea (punch di 4 mm). Il campione tissutale verrà fissato in formalina tamponata al 10% ed incluso in paraffina per l'esame istopatologico convenzionale. Inoltre, è prevista l'esecuzione di una seconda biopsia cutanea (punch da 3 mm) su una lesione cutanea rappresentativa, che verrà incluso in O.T.C. ("Tissue Tek", Miles Scientific, Naperville, IL), e conservato a -80 da ciascun paziente al momento della comparsa dell'eruzione cutanea ed in fase di risoluzione della stessa. Da ciascun paziente verrà inoltre prelevato un campione di sangue periferico da sottoporre a criopreservazione e successiva analisi citofluorimetrica. Analisi morfologica e immunofenotipica su biopsia cutanea Per ogni biopsia cutanea il protocollo prevede l'esecuzione di 10 sezioni seriate colorate con ematossilina & eosina. Lo studio di immunofenotipizzazione finalizzato allo studio delle APC e dei T-Reg su campioni tissutali sarà effettuato utilizzando gli anticorpi anti-: CD1a, CD14, FXIIIa, CD123, HLA-DR, CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, FOXP-3. Analisi del chimerismo Una analisi del chimerismo verrà effettuata su sangue periferico in base a metodiche di biologia molecolare in atto (STR). 5

6 Citometria di flusso su campioni di sangue periferico L'analisi citofluorimetrica sarà effettuata utilizzando i seguenti anticorpi: CD1a, CD1c, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD3, HLA-DR, FXIIIa. ASPETTI INNOVATIVI Un aspetto innovativo del presente progetto è rappresentato dalla creazione di un archivio specificamente dedicato ai pazienti sottoposti a trapianto di sangue cordonale. Tale archivio potrà fornire un servizio di conservazione e gestione del materiale biologico e dei relativi dati clinici, in accordo con un codice di buon utilizzo e di corretto comportamento. Come tali gli archivi/biobanche rappresentano un'indispensabile fonte di risorse/informazioni che in quanto collegano razionalmente i dati clinici con quelli di laboratorio permettono lo svolgimento di studi prospettici dedicati nel nostro progetto al miglioramento dell'appropriatezza diagnostica e prognostica. Il modello proposto, primo nel suo genere in Italia, potrebbe anche diventare un modello per altre centri specializzati in questo tipo di trattamento, in modo da implementare regole comuni e condivise, estendibili a livello nazionale. La raccolta contestuale di campioni tissutali e sangue periferico consentirà di correlare i risultati dello studio immunofenotipico in situ delle APC e linfociti T-Reg con l'evoluzione della GvHD e la prognosi. Lo studio prospettico consentirà anche di sviluppare linee di ricerche diverse da quelle attualmente suggerite, in base a quanto proposto nel prossimo futuro dalla letteratura internazionale. RISULTATI ATTESI Con i risultati del presente progetto ci attendiamo di identificare marker(s) immunopatologici della GvHD da trapianto di sangue cordonale che migliorino l'accuratezza della diagnosi e che forniscano dei criteri utili per la stratificazione prognostica dei pazienti. Il conseguimento dell'obiettivo generale è dipendente dal conseguimento degli obiettivi specifici che consistono nella realizzazione: a. di un archivio (database) clinico con la simultanea archiviazione ed appropriato stoccaggio dei campioni biologici relativi. b. di determinazioni morfologiche ed immunofenotipiche sui campioni biologici raccolti con definizione del valore diagnostico/prognostico e di monitoraggio delle terapie di markers specificamente identificati nel corso dello studio. 6

7 CRITERI DI VERIFICA Gli indicatori di successo dell'archivio saranno sia la quantità di materiali raccolti sia, soprattutto, la qualità dei biomateriali e dei dati ad essi associati, e sulla produzione scientifica associata all'attività della biobanca, e conseguentemente sulle pubblicazioni in cui la biobanca viene citata come fonte di rifornimento di biomateriali. Entrando nel merito specifico del presente progetto, i dati preliminari saranno discussi tra i partecipanti in riunioni interdisciplinari trimestrali. I risultati saranno presentati e discussi in dettaglio e dalle analisi dei risultati emergeranno gli indirizzi per le linee di ricerca future. Infine, i risultati ottenuti saranno presi in considerazione per essere utilizzati e sviluppati nell'ottica di futuri progetti di ricerca a livello nazionale o internazionale. INDICATORI ADOTTATI PER DIMOSTRARE IL RAGGIUNGIMENTO DEI RISULTATI Gli indicatori addottati per il raggiungimento dei risultati si articoleranno in incontri mensili del gruppo di ricerca. I risultati saranno descritti e riportati in un rapporto ad interim che verrà stilato tra i sei e gli otto mesi dall inizio della ricerca. Questo documento per uso interno costituirà lo strumento fondamentale per la prosecuzione della ricerca. L indicatore finale e definitivo per la dimostrazione del raggiungimento dei risultati sarà la stesura di uno o più lavori originali che saranno sottomessi per la pubblicazione a riviste scientifiche con peer review ed con elevato impact factor. L esperienza accumulata, e dimostrata da una serie notevole di lavori pubblicati su prestigiose riviste internazionali, da parte della maggior parte dei componenti del nostro gruppo di ricerca è la migliore garanzia che il programma di indicatori proposto sia reale ed efficace. 7

8 BIBLIOGRAFIA 1. Kurtzberg J, Laughlin M, Graham ML, et al. Placental blood as a source of hematopoietic stem cells for transplantation into unrelated recipients. N Engl J Med 1996;335: Gluckman E, Rocha V, Boyer-Chammard A, et al. Outcome of cord-blood transplantation from related and unrelated donors. Eurocord Transplant Group and the European Blood and Marrow Transplantation Group. N Engl J Med 1997;337: Rubinstein P, Carrier C, Scaradavou A, et al. Outcomes among 562 recipients of placental-blood transplants from unrelated donors. N Engl J Med 1998;339: Barker JN, Davies SM, DeFor T, et al. Survival after transplantation of unrelated donor umbilical cord blood is comparable to that of human leukocyte antigen matched unrelated donor bone marrow: results of a matched-pair analysis. Blood 2001;97: Laughlin MJ, Barker J, Bambach B, et al. Hematopoietic engraftment and survival in adult recipients of umbilical-cord blood from unrelated donors. N Engl J Med 2001;344: Wagner JE, Barker JN, DeFor TE, et al. Transplantation of unrelated donor umbilical cord blood in 102 patients with malignant and nonmalignant diseases: influence of CD34 cell dose and HLA disparity on treatment-related mortality and survival. Blood 2002;100: Barker JN, Weisdorf DJ, DeFor TE, et al. Transplantation of 2 partially HLAmatched umbilical cord blood units to enhance engraftment in adults with hematologic malignancy. Blood 2005;105: Barker JN, Weisdorf DJ, DeFor TE, et al. Rapid and complete donor chimerism in adult recipients of unrelated donor umbilical cord blood transplantation after reduced- intensity conditioning. Blood 2003;102: Brunstein CG, Barker JN, Weisdorf DJ, et al. Umbilical cord blood transplantation after nonmyeloablative conditioning: impact on transplantation outcomes in 110 adults with hematologic disease. Blood 2007;110: Gratwohl A. The EBMT activity survey 2006 on hematopoietic stem cell transplantation: focus on the use of cord blood products. Bone Marrow Transplant 2008;41: Rocha V, Cornish J, Sievers EL, et al. Comparison of outcomes of unrelated bone marrow and umbilical cord blood transplants in children with acute leukemia. Blood 2001;97: Grewal SS, Barker JN, Davies SM, et al. Unrelated donor hematopoietic cell transplantation: marrow or umbilical cord blood? Blood. 2003;101: Rocha V, Labopin M, Sanz G, et al. Transplants of umbilical-cord blood or bone marrow from unrelated donors in adults with acute leukemia. N Engl J Med 2004;351: Sauter C, Barker JN. Unrelated donor umbilical cord blood transplantation for the treatment of hematologic malignancies. Curr Opin Hematol 2008 Nov;15: Frassoni F, Gualandi F, Podestà M, et al. Direct intrabone transplant of unrelated cord-blood cells in acute leukaemia: a phase I/II study. Lancet Oncol 2008;9:

9 16. Eapen M, Rubinstein P, Zhang MJ, et al. Outcomes of transplantation of unrelated donor umbilical cord blood and bone marrow in children with acute leukaemia: a comparison study. Lancet 2007;369: Michel G, Rocha V, Chevret S, et al. Unrelated cord blood transplantation for childhood acute myeloid leukemia: a Eurocord Group analysis. Blood. 2003;102: MacMillan ML, Weisdorf DJ, Brunstein CG, et al, Wagner JE. Acute graftversus-host disease after unrelated donor umbilical cord blood transplantation: analysis of risk factors. Blood Mar 12;113: Zhou Y, Barnett MJ, Rivers JK. Clinical significance of skin biopsies in the diagnosis and management of graft-vs-host disease in early postallogeneic bone marrow transplantation. Arch Dermatol Jun;136: Firoz BF, Lee SJ, Nghiem P, et al. Role of skin biopsy to confirm suspected acute graft-vs-host disease: results of decision analysis. Arch Dermatol Feb;142: Duffner UA, Maeda Y, Cooke KR, et al. Host dendritic cells alone are sufficient to initiate acute graft-versus-host disease. J Immunol Jun 15;172: Haniffa M, Ginhoux F, Wang XN, et al. Differential rates of replacement of human dermal dendritic cells and macrophages during hematopoietic stem cell transplantation. Exp Med Feb 16;206: Willemze AJ, Bakker AC, von dem Borne PA, et al. The effect of graft-versushost disease on skin endothelial and epithelial cell chimerism in stem-cell transplant recipients. Transplantation Apr 15;87: Fondi C, Nozzoli C, Benemei S, et al. Increase in FoxP3+ regulatory T cells in GvHD skin biopsies is associated with lower disease severity and treatment response. Biol Blood Marrow Transplant 2009;15: