suino su cellule MDBK (Madin-Derby Bovine Kidney)

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Armando Vanni
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1 Saggio biologico per IFN-α/β suino su cellule MDBK (Madin-Derby Bovine Kidney) Campioni possibili: A) Sovrastanti di colture di leucociti suini. B) Sieri o plasmi suini ex vivo. PRINCIPIO Induzione di uno stato antivirale in cellule animali in coltura di specie bovina e sua titolazione con il metodo delle diluizioni limite. Oltre a campioni di origine suina, sono idonei per il test campioni contenenti interferoni di origine umana e bovina. Il virus da impiegare è solitamente o Picornavirus, o Rhabdovirus o Alfavirus validato per le cellule in esame. Le cellule MDBK sono state impiegate anche per la determinazione di interferoni bovini ed umani. PROCEDIMENTO Preparazione dei campioni Preparare le diluizioni dei campioni da titolare in terreno MEM con il 10% di siero fetale bovino, controllato per eventuale attività antivirale aspecifica. Distribuire 100 µl. di terreno MEM + 10% siero fetale bovino (SFB) in tutti i pozzetti (pz) della piastrina, (compresi tutti i pz, destinati ai controlli cellule, KC, e ai controlli virus, KV) meno che nei pz. della riga A, destinati a contenere le diluizioni di partenza dei campioni e degli standard (STD). Nella riga A, in funzione del protocollo da seguire si distribuiranno 200µl./pz. di campione o STD se si effettuerà una diluizione in BASE 2; mentre, se si dovrà eseguire una diluizione in BASE3, si distribuiranno 150µl./pz.. Nell ipotesi di una diluizione in BASE2, si passeranno in sequenza dalla 1

2 riga A alla riga H, 100µl./pz. di campione o STD. Nell ipotesi invece, di una diluizione in BASE 3, si passeranno in sequenza, dalla riga A alla riga H 50µl./pz. di campioni o STD. Seminare 100µl./pz. di cellule MDBK alla concentrazione di cellule /ml. Incubare in termostato a CO 2 a 37 C per 16 24h. Infezione Si procede quindi all infezione con idoneo virus (saggiato per sensibilità a interferon) secondo le seguenti modalità: a) Vuotare la piastrina e tamponare su carta bibula sterile sotto cappa a flusso laminare.. b) Fare un lavaggio con terreno MEM al 2% di SFB (50 µl./pz). c) Vuotare e asciugare brevemente. d) Distribuire 100 µl./pz. in tutti i pz. del KC e 50µl./pz. di MEM al 2% SFB in tutti i restanti pz. e) Infettare con 50 µl./pz. di virus diluito in MEM + 2% SFB prediluito alla massima diluizione che fornisce il massimo dell effetto citopatico richiesto. f) Incubare in termostato a CO 2 a 37 C per 16-24h. 2

3 Lettura al microscopio Colorazione ed elaborazione dei dati In presenza, a 16-24h., di una distruzione del monostrato nei pz KV pari ad almeno il 70 80%, si procede dopo la lettura al microscopio per verificare: L integrità dei pz KC Il grado dell effetto citopatico nei pozzetti KV Il grado dell effetto citopatico nei pozzetti corrispondenti allo STD impiegato e ai campioni in esame, cercando di individuare la massima diluizione dei campioni e dello STD che fornisca il 50% di protezione del monostrato. Una volta esaurita la lettura visiva dell effetto citopatico, si procede alla colorazione con ROSSO NEUTRO. Colorazione con Rosso Neutro e lettura allo Spettrofotometro Aggiungere 10µl./pz. di soluzione di ROSSO NEUTRO 0,1%. La piastrina è incubata 2 h. a 37 C in termostato a CO 2 ; si elimina poi il colorante e si eseguono due lavaggi con PBS contenente ioni calcio e magnesio; la piastra è fatta asciugare perfettamente (servendosi di termostato a 37 C ). Si eluisce poi il colorante aggiungendo 100µl. /pz. di una soluzione 1:1 alcool etilico anidro e acido cloridrico 1N (precedentemente refrigerata a 4 C) incubando poi in frigorifero a 4-5 C per 1 h. circa.. Si esegue infine una lettura allo spettrofotometro a λ 550 nm. Elaborazione dei dati Per il calcolo finale si opera come segue applicando la seguente formula : = OD KC OD KV 50% = /2 3

4 Ep 50% = KC - 50% = end-point del titolo. Ovvero, titolo del campione sarà la diluizione corrispondente a un valore di densità ottica uguale o superiore all end-point così calcolato. Dove: ; esprime la differenza tra la media delle densità ottiche dei pozzetti del KC (controllo cellule) meno la media delle densità ottiche dei pozzetti del KV (controllo virus) 50% ; esprime il 50% del valore di Ep 50% ; esprime l END POINT al 50% Titolo in UI/ml Per esprimere il titolo del campione in Unità Internazionali (UI) sulla base di uno standard noto da 1000 UI/ml, si esegue la seguente interpolazione: 1000 : diluizione end-point dello STD = X : diluizione end-point del campione in esame. Bibliografia Meager A Quantification of interferons by anti-viral assays and their standardization. In: Clemens MJ, Morris AG, Gearing AJH, editors. Lymphokines and interferons, a practical approach. Oxford, UK: IRL Press Limited. p Referente: Massimo Amadori, massimo.amadori@izsler.it 4

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