Controllo di Qualità Regionale Piemontese della tipizzazione HLA sierologica

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1 Controllo di Qualità Regionale Piemontese della tipizzazione HLA sierologica Loredana Praticò (1), Mariafederica Uboldi de Capei (1), Iolanda Borelli (1), Federica Rosati (1), Tiziana Cravero (1), Francesca Brancatello (1), Rosita Borgialli (2), Enzo Gay (3), Mariolina Iorio (4), Annamaria Mangione (5), Lia Mele (6), Giuseppe Menardi (7), Mauro Pagliarino (8), Donata Retegno (9), Lucia Zucchinetti (10), Anna Maria Dall Omo (1), Emilio Sergio Curtoni (1) (1) UOADU Immunologia dei Trapianti, Az Osp San Giovanni Battista di Torino, (2) Banca del Sangue, Az Osp San Giovanni Battista di Torino, (3) Centro Trasfusionale, Az Osp Ospedale Infantile Regina Margherita di Torino, (4) Centro Trasfusionale AVIS di Torino, (5) SIT Ospedale S. Andrea di Vercelli, (6) SIT Ospedale Civile di Alessandria, (7) SIT AO S. Croce di Cuneo, (8) SIT Ospedale Civile di Ivrea, (9) SIT Ospedale di Aosta, (10) SIT Ospedali Riuniti di Verbania The Transplantation Immunology Service of Torino, which has also the function of Regional Reference Centre for Transplants (CRRT), together with the tissue typing laboratories of the region organises since 1991 the Regional Quality Control (CQR) of tissue typing, for the following HLA antigens: HLA-A, B, C, DR, DQ. The aim of the activity is to optimise the standardisation among laboratories, and to provide them with a continuous technical updating. Up to 1999, 82 blood samples have been distributed to the laboratories. Since 1995 the results have been assessed using the EFI (European Federation for Immunogenetics) criteria. The correlation coefficient among laboratories for A, B, DR typing, rose from.75 in 1993 to 1 in 1999; the correlation for C and DQ typing rose from.65 to.99. A weight has been assigned to the errors at the different loci, comparing the number of errors with the number of antigens at each locus. This weight is: 16.1 for A, 8.29 for B, for C, for DR, for DQ. The concordance among laboratories increased in the time. The number of laboratories showing a 100% concordance for C and DQ is lower than for A, B, DR, demonstrating that serological typing for the former loci is more difficult. The overall results are however towards an improvement of quality. Parole chiave: tipizzazione, sierologia, abilità, HLA Key words: typing, serology, proficiency, HLA Introduzione Il Servizio di Immunologia dei Trapianti di Torino, in collaborazione con i Centri Donatori piemontesi, organizza Ricevuto: 13 novembre Accettato: 20 dicembre 2000 Corrispondenza: Dott.ssa Loredana Praticò Servizio di Immunologia dei Trapianti Via Santena, Torino annualmente, dal 1991, il controllo di qualità della Regione Piemonte (CQRP) della tipizzazione sierologica degli antigeni HLA di I e II classe. I campioni da tipizzare sono stati forniti dai Centri Trasfusionali piemontesi dal 1992 al 1997, mentre dal 1998 a oggi sono stati forniti da centri trasfusionali della Regione Lombardia. Il CQRP persegue tre obiettivi principali: 1- valutare la qualità delle tipizzazioni HLA tra i laboratori della Regione Piemonte; 2- raggiungere una buona standardizzazione della tecnica di sierologia; 3- consentire ai laboratori interessati di richiedere l'accreditamento EFI (European Federation for Immunogenetics) e/o ASHI (American Society for Histocompatibility and Immunogenetics), attualmente indispensabili per inserire donatori tipizzati nei registri internazionali di donatori di midollo osseo. In questo studio sono riportati i risultati ottenuti negli anni dal 1991 al Materiali e metodi Donatori e campioni di sangue È stato stabilito (al fine di evitare problemi nella spedizione dei campioni) di utilizzare le giornate d'incontro fra i diversi rappresentanti dei laboratori piemontesi come occasione per lo scambio dei campioni del CQRP successivo, permettendo così un risparmio di tempo e di denaro. Nel 1991 è avvenuto il primo incontro, con scambio di tre campioni; nel 1992 il secondo ed il terzo scambio hanno consentito in totale l'analisi di sei campioni; dal 1993 fino ad oggi è stato deciso di riunirsi tre volte l'anno e di analizzare da un minimo di nove a un massimo di dodici campioni l'anno: il numero medio annuale di laboratori partecipanti è nove. LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol num. 2 marzo-aprile 2001 ( ) 113

2 L Praticò et al. Fino al 1998 per ogni incontro quadrimestrale, a turno, ciascun Centro Trasfusionale piemontese (partecipante esso stesso del CQRP) ha fornito campioni prelevati da donatori di sangue. Dal 1991 al febbraio 1995 la scelta dei campioni è avvenuta casualmente, mentre dal giugno 1995 i campioni sono stati selezionati in modo da soddisfare gli standard EFI richiesti, secondo i quali, annualmente: a- gli antigeni da riconoscere devono comprendere almeno il 75% di quelli noti dei loci A e DR e ogni antigene del locus B deve presentarsi una volta sola; b- deve essere esaminato un numero minimo di otto campioni; c- il numero massimo di errori accettabile in un anno è due per la classe I e uno per la classe II. Dal 1998 il CQRP ha modificato la sua organizzazione poiché l'istituto Superiore di Sanità (ISS) ha fornito indicazioni secondo cui i Centri di Riferimento Regionali per i Trapianti (CRRT) avrebbero dovuto partecipare al Controllo di Qualità Nazionale e a loro volta organizzare Controlli di Qualità Regionali (CQR) per tutti gli altri laboratori. Poiché i due tipi di controlli di qualità devono essere qualitativamente simili, entrambi, annualmente, devono applicare le seguenti regole in aggiunta alle direttive EFI precedentemente esposte: 1- è necessaria la concordanza (o tipizzazione di consenso) del 75% dei laboratori per ogni antigene; 2- i registri regionali di midollo o i CRRT che non sono Centri Trasfusionali e che, quindi, non dispongono di donatori di sangue, devono usufruire di donatori che afferiscono a Centri Trasfusionali di altre regioni; 3- i campioni devono essere distribuiti quadrimestralmente (ad es.: febbraio, giugno, ottobre); 4- è necessario l'invio dei fogli di lettura che certifichino la metodica adottata e i sieri utilizzati; 5- i risultati dei CQR devono essere inviati alla fine dell'anno all'iss. Il sangue prelevato a ciascun donatore in Vacutainer (Becton Dickinson Europe, 5 Chemin des Sources BP37, Meylan Cedex, France) contenenti Eparina con Litio (LH) o ACD (soluzione B: 0,2 g. Sorbato di Potassio, 13,2 g. Citrato trisodico x 2H 2 O, 14,7 g. Destrosio x H 2 O, 4,8 g. Acido Citrico x H 2 O, ph 5,.1) è etichettato con un codice e distribuito ai laboratori partecipanti il medesimo giorno in cui sono discussi i risultati dello scambio precedente. Raccolta ed elaborazione dati Per ciascun antigene presente nei campioni scambiati sono valutati i risultati di ogni laboratorio, espressi come coefficiente di correlazione r. È valutata inoltre, globalmente, la concordanza di tipizzazione nei vari laboratori, considerando, cioè, quante volte questi hanno attribuito correttamente la tipizzazione nel suo complesso. Modalità di valutazione: a- nel caso in cui un laboratorio denunci che non ha reagenti in grado di determinare un certo antigene (che non sia fra quelli obbligatori), al termine della valutazione tale laboratorio non è penalizzato; b- poiché in questa analisi vengono distinti errori di interpretazione e di trascrizione, ma entrambi portano all'identica conseguenza di immissione di dati errati nei registri nazionali e internazionali, ambedue sono stati considerati finora del tutto equivalenti; c- nel caso di un campione definito dal 75% dei laboratori es. DR11 e da un laboratorio es. DR12, a quest'ultimo sono stati imputati due errori: uno per attribuzione errata del DR12 e uno per mancata attribuzione del DR11. Modifiche organizzative effettuate con il trascorrere del tempo: 1- abbandono dell'anonimato dei laboratori partecipanti (mantenuto dall'inizio fino al febbraio 1998); 2- riduzione del tempo concesso per la risposta: infatti dal 1991 al 1998 i laboratori avevano circa un mese di tempo per inviare per posta i risultati al CRRT, mentre dal 1999 il tempo è stato ridotto a 7 giorni per spedizione via fax e 30 giorni per spedizione postale; 3- applicazione, dal giugno 1995, delle più recenti direttive EFI; 4- dal 1996, suddivisione dell'analisi in due parti a seconda dei loci esaminati: a- nella prima sono evidenziati eventuali errori sugli antigeni dei loci A, B e DR (includendo sia le specificità must che should, cioè obbligatorie e facoltative, previste dagli standard EFI); b- nella seconda sono stati considerati anche eventuali errori commessi sugli antigeni dei loci C e DQ; 5- riconferma della tipizzazione sierologica con tecniche di analisi del DNA da parte del laboratorio regionale di riferimento; 6- a partire dal 1998, in base alle direttive nazionali, il CRRT ha partecipato ai controlli regionali solo in qualità di organizzatore. Per quanto riguarda l'analisi del DNA, dall'ottobre 1992 al 1995 è stata utilizzata la tecnica RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) per la tipizzazione dei loci DR e DQ; dal 1995 è stata utilizzata la tecnica SSP (Specific Sequence Primer), tipizzando inizialmente solo per il locus DR e dal giugno 1996 anche per il locus DQ. Dal febbraio 1998, le riconferme sono state effettuate sempre con la tecnica SSP anche per i loci A, B, C. Dal 1991 al 1998, in caso di discordanza tra la sierologia e la tipizzazione del DNA, era considerato corretto il dato molecolare; dal giugno 114

3 CQ tipizzazione sierologica HLA in Piemonte Tabella I: discrepanze fra tipizzazione sierologica e tipizzazione DNA Data camp. spec.sier. lab.conc. % conc. tip. DNA 17/02/98 III DQ8 6/8 75 DQ4 17/02/98 IV DQ6 3/4 75 DQ6 neg. 02/06/98 II Cw7 8/9 89 Cw17 Legenda: data = data in cui si sono verificati gli scambi dei campioni; camp. = campione; spec. sier. = specificità sierologica; lab. conc. = laboratori con risultati concordanti; % conc. = percentuale di concordanza; tip. DNA = tipizzazione del DNA. Per questi tre campioni l analisi del DNA ha fornito risultati discordanti rispetto a quelli ottenuti con tecnica sierologica, nonostante la concordanza del 75%. Tabella II: mancata concordanza (prima delle direttive EFI) Data camp. spec. sier. lab. conc. % conc. tip. DNA 11/02/92 III DR6 1/4 25 ND DR12 1/4 25 DR Blank 2/ /10/92 I DR0103 1/4 25 DR0103 DR2 2/4 50 DR Blank 1/ /10/92 II DQ5 1/4 25 DQ6 DQ6 1/4 25 DQ1 2/ /10/93 I B65 1/9 11 ND B64 1/9 11 B14 7/ /03/94 III DR52 4/6 67 B3 neg DR52 neg. 2/ /10/94 III DQ5 1/6 17 DQ1 DQ6 1/6 17 DQ1 4/6 66 I risultati ottenuti mediante tipizzazione del DNA sono stati considerati corretti ed elemento di riferimento per eventuali errori. Legenda: camp. = campione; spec. sier. = specificità sierologica; lab. conc. = laboratori con risultati concordanti; % conc. = percentuale di concordanza; tip. DNA = tipizzazione del DNA. Elenco di campioni per cui non si è raggiunta la concordanza del 75% (prima delle direttive EFI). 1998, in accordo con i partecipanti dei CQRP, si è deciso che se con tecniche sierologiche era raggiunto il consenso, la discrepanza con i risultati dell'analisi del DNA non era considerata errore: tale situazione si è verificata tre volte (Tabella I). Risultati Non sono state registrate alterazioni dei campioni anche se sono stati riscontrati alcuni problemi durante la tecnica di separazione dei linfociti, che non hanno permesso ad alcuni laboratori: 1- la tipizzazione per la sola classe I in 2/82 campioni; 2- la tipizzazione per la sola classe II in 17/82; 3- la tipizzazione sia di classe I sia di classe II in 8/82. Per i casi in cui non si è raggiunta una concordanza del 75%, i dati sono riportati nella tabella II (prima delle direttive EFI) e nella tabella III (dopo le direttive EFI). In quattro campioni, al fine di raggiungere il consenso del 75%, è stato deciso di utilizzare non solo i risultati ottenuti in sierologia ma anche quelli ottenuti con la tipizzazione del DNA; in questi casi, ai laboratori che avevano eseguito la tipizzazione sierologica sono stati aggiunti i laboratori che avevano eseguito l'analisi del DNA (Tabella IV). 115

4 L Praticò et al. Tabella III: mancata concordanza (dopo le direttive EFI) Data camp. spec. sier. lab. conc. % conc. tip. DNA 14/06/95 I DQ5 4/9 44 ND DQ6 2/9 22 DQ1 3/ /10/95 II DQ5 5/8 63 ND DQ5 ND 3/ /10/95 III DQ6 3/8 37 ND DQ5 1/8 13 DQ1 4/ /02/96 I A68 5/10 50 ND A68 ND 5/ /02/96 I DQ7 3/10 30 ND DQ8 5/10 50 DQ3 2/ /02/96 III DQ6 3/10 30 ND DQ6 ND 7/ /02/96 IV DQ6 4/10 40 ND DQ6 ND 6/ /06/96 I B65 3/10 30 ND B65 ND 7/ /06/96 I Cw8 2/10 20 ND Cw8 ND 7/10 70 Cw8 neg. 1/10 10 Cw7 2/10 a) 20 Cw7 neg. 8/ /06/96 III DQ6 5/8 63 DQ*0603,DQ*0601 DQ6 neg. 3/ /10/96 II Cw8 2/6 34 Cw8 Cw8 ND 4/ /10/96 IV A26 5/10 50 A26 A66 4/10 40 A66 ND 1/ /02/97 II DQ1(Iispec.) 3/13 23 DQ*0602,DQ*0603 DQ Blank 7/13 54 DQ5 ND 3/ /06/97 III Cw7 6/12 50 Cw17 Cw7 neg. 6/ /10/97 I Cw8 5/13 39 Cw8, Cw12 Cw8 ND 6/13 46 Cw8 neg. 2/13 15 Cw7 3/13 23 Cw7 neg. 10/ /02/99 III DQ4 5/8 63 DQ4 neg. DQ4 neg. 3/ /06/99 II b) DQ1(Iispec.) 4/9 c) 44 DQ6 DQ6 ND 7/9 78 Legenda: camp. = campione; spec. sier. = specificità sierologica; lab. conc. = laboratori con risultati concordanti; % conc. = percentuale di concordanza; tip. DNA = tipizzazione del DNA; a) uno dei due laboratori ha indicato il CW8 non determinato; b) campione omozigote DQ1:DQ*05, DQ*06; c) 2/4 laboratori hanno tipizzato DQ1 con DQ6 ND. Elenco di campioni per cui non si è raggiunta la concordanza del 75% (dopo le direttive EFI). 116

5 CQ tipizzazione sierologica HLA in Piemonte Tabella IV: utilizzo della tipizzazione DNA per raggiungere la concordanza Data camp. spec. sier. lab. conc. % conc. lab. conc. sier.+ tip. DNA % 05/06/96 I DQ5 4/6 66 6/ /10/96 I DQ6 5/7 71 7/ /10/96 III DR17 4/6 66 6/ /10/96 II DQ8 2/3 66 4/5 80 Legenda: camp. = campione; spec. sier. = specificità sierologica; lab. conc. = laboratori con risultati concordanti; % conc. = percentuale di concordanza; lab. conc. sier.+ tip. DNA: numero di laboratori che hanno raggiunto la concordanza con tecniche sierologiche, al quale sono stati aggiunti laboratori che hanno eseguito l analisi del DNA. Per questi campioni, al fine di raggiungere il consenso del 75%, è stato deciso di utilizzare non solo i risultati ottenuti in sierologia ma anche quelli ottenuti con la tipizzazione del DNA e quindi ai laboratori che avevano eseguito la tipizzazione sierologica sono stati aggiunti i laboratori che avevano eseguito l analisi del DNA. Tabella V: peso degli errori commessi per ciascun locus HLA Locus n err./n camp. (a) n ag./n tot.ag. (b) peso err. (a/b) x 100 A 26/777 25/120 16,1 B 29/777 54/120 8,29 C 58/750 11/120 84,02 DR 44/681 21/120 36,91 DQ 36/681 9/120 70,53 Legenda: n err./n camp. (a) = n errori rilevati rispetto al numero totale di campioni esaminati; n ag./n tot. ag. (b) = n antigeni ricercati rispetto al numero totale di antigeni noti del sistema HLA; peso err. (a/b) x 100 = peso degli errori commessi calcolato come a/b x 100. Il peso degli errori commessi per ciascun locus A, B, C, DR e DQ è stato calcolato rapportando il numero degli errori rilevati con il numero degli antigeni noti per ciascun locus. I coefficienti di correlazione relativi alla tipizzazione degli antigeni dei loci A, B, DR, e C, DQ ( ) sono esposti nella figura 1. La concordanza di tipizzazione degli antigeni dei loci A, B, DR e C, DQ ( ) è illustrata nella figura 2. Sono stati registrati errori di trascrizione della tipizzazione (dal protocollo di tipizzazione alla scheda di trasmissione dei risultati) negli scambi di campioni del 05/06/91 e 08/06/ 99 relativamente agli antigeni DQ3 e DR53 rispettivamente; per quel che riguarda gli errori di interpretazione si rimanda alla figura 3. È stato, infine, calcolato un peso degli errori commessi per ciascun locus A, B, C, DR e DQ rapportando il numero degli errori rilevati con il numero degli antigeni esistenti per ciascun locus (Tabella V). Discussione Ogni laboratorio che partecipava al suo primo scambio di campioni, tranne rare eccezioni, ha preferito inizialmente cimentarsi nella tipizzazione dei loci A e B; solo dopo aver acquisito una certa esperienza ha deciso di tipizzare anche i loci C, DR e DQ. Osservando la figura 1, è possibile notare, nel tempo, un miglioramento della tipizzazione HLA A, B, DR; lo stesso andamento si osserva per la tipizzazione dei loci C e DQ anche se non si raggiunge mai un coefficiente di correlazione pari a 1. Per quanto riguarda la concordanza di tipizzazione dei loci A, B, DR (Figura 2), eccetto il 1994 (anno in cui sono stati scambiati campioni con fenotipi più difficili), si osserva nel tempo un aumento del numero di laboratori che raggiungono una percentuale di concordanza del 100%. Nel caso di campioni tipizzati per i loci C, DQ, l'andamento è meno costante; è da considerare che nei primi anni il numero di laboratori che era in grado di tipizzare tali loci era scarso e che nel corso degli anni 1998 e 1999, a causa di discrepanza tra i risultati ottenuti con la tecnica sierologica e l'analisi del DNA, non sono stati valutati alcuni campioni. Tutto ciò sta a dimostrare che la tipizzazione di questi loci risulta comunque ancora difficoltosa e poco standardizzabile. 117

6 L Praticò et al. Figura 1: valori medi annuali del coefficiente di correlazione (Coeff. Corr.) tra laboratori che hanno partecipato ai CQRP, nel periodo , per quanto riguarda i loci A, B, DR e C, DQ Analisi degli errori: 1- quelli di trascrizione sono stati rarissimi; 2- quelli di interpretazione sono stati più frequenti. Per il locus A (Figura 3) gli errori sono stati causati da uno dei seguenti motivi: 1- antigeni difficili da tipizzare (A68, A69 e A33); 2- scarsa reattività degli antisieri; 3- presenza di antigeni rari (A66 confuso con A26); 4- cross-reattività (campione A28 omozigote A68, A69 tipizzato come A2, A28); 5- errata interpretazione dei fogli di lettura (questo tipo di errore si è verificato nei primi anni del CQRP). Per il locus B (Figura 3) sono stati riscontrati gli stessi tipi di errori del locus A. Per giustificare gli errori commessi sugli antigeni B64, B58 e B61 (subtipici rispettivamente a B14, B17 e B40) occorre ricordare che il loro riconoscimento avviene per esclusione, cioè per mancata reattività di antisieri che riconoscono l'altro subtipo e cioè gli antigeni B65, B57 e B60 rispettivamente. Non esistono, purtroppo, al momento, antisieri monospecifici in grado di riconoscere tali specificità ed è, quindi, possibile commettere errori nella loro definizione. Per il locus C (Figura 3) sono stati osservati numerosi errori sugli antigeni Cw6 e Cw7, probabilmente a causa del fatto che: a) i sieri per gli antigeni C sono scarsi poiché le molecole hanno bassa densità sulla superficie cellulare e sono poco immunogeniche; inoltre i sieri, soprattutto quelli monospecifici anti-cw6, sono pochi ed in piccola quantità; 118

7 CQ tipizzazione sierologica HLA in Piemonte Figura 2: percentuale di concordanza nella tipizzazione sierologica tra laboratori che hanno partecipato ai CQRP, nel periodo , per quanto riguarda i loci A, B e C, DQ b) le reattività extra di alcuni sieri anti-cw6 e anti-cw7 potrebbero essere dovute a reazioni crociate, cioè al riconoscimento di epitopi comuni con gli antigeni Cw15, Cw16 e Cw17, riconosciuti facilmente con le tecniche di analisi del DNA. Le stesse considerazioni sono riportate anche da altri Autori 1 che descrivono come, dal 1982 al 1994, siano stati effettuati controlli di qualità della tipizzazione sierologica dei loci A, B, C, secondo gli standard ASHI, e sia stato osservato, negli anni più recenti, un miglioramento dei risultati della tipizzazione del locus C, specialmente per antigeni come Cw6, Cw7 e Cw8 anche se il consenso tra i laboratori rimane sotto il 90%, probabilmente a causa della scarsità dei reagenti. Si spera che la scoperta di nuovi antigeni sia d'impulso per la ricerca di nuovi antisieri. 119

8 L Praticò et al. Figura 3: percentuale di errori commessi sugli antigeni noti del sistema HLA, nel periodo Gli antigeni contrassegnati dall asterisco non sono mai stati esaminati nel corso dei vari CQRP. Le % di errore mostrano le seguenti variazioni per i diversi loci: A: 0-0,8 B: 0-1 C: 0-3 DR: 0-1 DQ: 0-1,2 Per il locus DR (Figura 3) sono stati riscontrati gli stessi tipi di errori dei loci A e B. Alcuni di essi sono stati commessi sugli antigeni subtipici a DR2 e DR3 (rispettivamente DR15, DR16 e DR17, DR18); altri sono stati commessi soprattutto sugli antigeni DR11, DR12 (subtipici a DR5) e DR13 (subtipico a DR6), poiché in campioni omozigoti DR11, omozigoti DR13 oppure eterozigoti DR11, D13 è facile commettere errori di interpretazione. Per esempio, un campione tipizzato come omozigote DR11 può essere, in realtà, DR11, DR13; viceversa, un campione tipizzato DR11, DR13 può essere omozigote DR11. Tali errori di interpretazione nella tipizzazione sono imputabili ai kit tipizzanti e, quindi, alla scarsità di sieri monospecifici anti- DR13 e alla presenza di sieri anti-dr11, -DR13 che riconoscono un epitopo comune alle due molecole HLA. È da considerare, inoltre, che, fino a qualche anno fa, si era convinti che un campione positivo per DR5 e DR52 fosse positivo anche per DQ3, e un campione positivo per 120

9 CQ tipizzazione sierologica HLA in Piemonte DR6 e DR52 fosse positivo anche per DQ1; perciò, se in un campione erano presenti DQ1, DQ3 e DR52 questo era definito con sicurezza DR5, DR6. Successivamente, è stato dimostrato che le considerazioni precedenti non erano corrette poiché esistono situazioni rare in cui DR6 è in linkage disequilibrium con DQ3 e DR5 con DQ1. Poiché gli antisieri disponibili in commercio, in linea generale, sono di buona qualità, gli errori commessi fino al 1997 possono essere imputabili a una errata interpretazione dei fogli di lettura o a una inappropriata applicazione della tecnica da parte degli operatori. Dopo il 1997, si osserva un netto miglioramento delle tipizzazioni del locus DR (Figura 1), sicuramente dovuto ad una maggiore esperienza e accortezza degli operatori nell'assegnare i risultati. Analoghe considerazioni sono riportate dagli Autori precedentemente citati 1, in un diverso studio 2 nel quale sono riassunti i risultati di otto anni di esperienza ( ) di un programma di controllo di qualità della tipizzazione sierologica dei loci DR e DQ. Da tale studio emerge che l'assegnazione degli antigeni subtipici DR è poco consistente e realizzabile. In particolare, si osserva che: 1- il minor consenso sull'assegnazione di DR6 è relativo al fatto che alcuni campioni erano DR1303, antigene subtipico a DR6 difficile da tipizzare sierologicamente; 2- alcuni errori sono relativi ad assegnazione non corretta di antigeni cross-reattivi con DR5, come DR6 e DR8; 3- alcune difficoltà si sono riscontrate nell'assegnazione dei subtipici a DR2 (DR15 e DR16) ed a DR3 (DR17 e DR18). Per quanto riguarda il locus DQ (Figura 3), gli errori registrati sono stati commessi soprattutto per gli antigeni DQ5, DQ6 e DQ8 subtipici rispettivamente a DQ1 e DQ3. Tali errori sono probabilmente da imputare ai kit tipizzanti che sono privi di sieri monospecifici per questi ultimi e che, perciò, non hanno permesso agli utilizzatori di tipizzare correttamente campioni apparentemente omozigoti DQ1 (es. DQ5, DQ6) e DQ3 (DQ7, DQ8). Gli stessi errori di assegnazione di DQ6 al posto di DQ5 sono ugualmente riportati nel lavoro di Duquesnoy e Marrari 2 nel quale emerge che la definizione sierologica degli antigeni subtipici a DQ1 (DQ5 e DQ6) e DQ3 (DQ7, DQ8 e DQ) è scarsa nella maggioranza dei laboratori partecipanti. Analizzando il peso degli errori per ciascun locus (Tabella V) è possibile osservare come la standardizzazione della tipizzazione per i loci C e DQ non sia ancora soddisfacente. Conclusioni Il controllo di qualità annuale è uno strumento necessario per favorire un costante miglioramento delle tipizzazioni, permettendo a tutti i laboratori partecipanti di conoscere nuovi antigeni e nuove associazioni fra antigeni a loci diversi. Esso, inoltre, consente di richiedere l'accreditamento EFI che ha lo scopo di migliorare il livello generale dei laboratori di istocompatibilità in Europa; è pertanto importante assicurare un'alta qualità della tipizzazione, poiché l'identità HLA tra donatore e ricevente risulta essenziale per eseguire il trapianto di midollo osseo. Riassunto Obiettivi dell'indagine Il Servizio di Immunologia dei Trapianti, sede del Centro di Riferimento Regionale per i Trapianti (CRRT), in collaborazione con i centri piemontesi di tipizzazione HLA, organizza ogni anno dal 1991 il programma regionale di controllo di qualità della tipizzazione sierologica per gli antigeni HLA sia di classe I (loci A, B e C) che II (loci DR e DQ). Tale controllo di qualità coinvolge tutti quei laboratori che tipizzano i donatori di midollo intenzionati ad iscriversi al registro nazionale denominato Italian Bone Marrow Donor Registry (IBMDR). Scopo del controllo di qualità è di avere una sempre maggiore standardizzazione della tecnica di sierologia applicata alla tipizzazione degli antigeni del sistema HLA e di offrire ai laboratori partecipanti un continuo aggiornamento sulle metodologie utilizzate. Materiali e metodi Sono stati selezionati 82 campioni forniti, dal 1991 al 1997, dai Centri Trasfusionali piemontesi e dal 1998 ad oggi da Centri Trasfusionali della Regione Lombardia. Dal giugno 1995 il CRRT, con lo scopo di rendere il controllo di qualità valido a livello europeo, ha valutato i risultati ottenuti dai partecipanti secondo gli standard richiesti dall'european Federation for Immunogenetics (EFI); inoltre, dal 1998 ha modificato la sua organizzazione in base alle direttive dell'istituto Superiore di Sanità (ISS). Risultati Dal 1993 al 1999 i laboratori che tipizzano per i loci A, B, DR e C, DQ raggiungono rispettivamente un coefficiente di correlazione r variabile tra 0,75-1 e tra 0,65-0,99. Nell'ambito della concordanza tra laboratori si osserva un costante miglioramento nella tipizzazione dei loci A, B, DR e un andamento discontinuo nella tipizzazione dei loci C e DQ. Inoltre, è stato calcolato un peso degli errori commessi per ciascun locus A, B, C, DR e DQ rapportando il numero degli errori rilevati con il numero degli antigeni esistenti per ciascun locus. Questo è risultato, rispettivamente: 16,1; 8,29; 84,02; 36,91; 70,

10 L Praticò et al. Conclusioni 1- Con il trascorrere del tempo si verifica un incremento del numero dei laboratori che tipizzano correttamente. 2- Il numero dei laboratori che tipizzano i loci C, DQ in grado di raggiungere una percentuale di concordanza del 100% è incostante rispetto a quei laboratori che tipizzano i loci A, B, DR a dimostrazione del fatto che la tipizzazione dei loci C e DQ risulta ancora difficoltosa e poco standardizzabile. Tale osservazione è confermata anche dal numero e dal tipo di errori commessi, che riguardano soprattutto gli antigeni dei loci C e DQ. I risultati ottenuti mostrano comunque un miglioramento costante della qualità delle tipizzazioni da parte dei vari laboratori partecipanti. Ringraziamenti Si ringraziano il Dr. Cenzuales di Milano e il Dr. Carpanelli di Cremona che hanno collaborato fornendo i campioni per i CQRP degli anni 1998 e Bibliografia 1) Duquesnoy RJ, Marrari M: Progress report on the ASHI/CAP Proficiency survey program in histocompatibility testing. HLA- A, B, C typing, antibody screening, and lympho-cytotoxicity crossmatching. Human Immunology, 39, 87, ) Duquesnoy RJ, Marrari M: Progress report on the ASHI/ CAP Proficiency survey program in histocompatibility testing. HLA-DR, DQ serologic typing, antibody identification, and B- cell crossmatching. Human Immunology 39, 96,