CONTROLLO DEI PRODOTTI FARMACEUTICI NON STERILI: ARMONIZZAZIONE DELLE FARMACOPEE

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1 numero 6 febbraio 2008 CONTROLLO DEI PRODOTTI FARMACEUTICI NON STERILI: ARMONIZZAZIONE DELLE FARMACOPEE Le Farmacopee Europea, Americana e Giapponese si stanno avvicinando a grandi passi alla completa armonizzazione, che garantirà l uniformità dei metodi microbiologici nel controllo qualità farmaceutico. I capitoli della Farmacopea Europea 6.0 dedicati al Controllo dei Prodotti Farmaceutici Non Sterili (cap e cap ) riportano una sezione armonizzata in parallelo alla sezione classica, per favorire l adeguamento graduale delle società farmaceutiche prima della definitiva entrata in vigore delle sole normative armonizzate. I test da effettuare per la conta totale e per la ricerca selettiva di microrganismi specifici sono descritti in dettaglio in questi capitoli della Farmacopea, con particolare attenzione alla formulazione dei terreni di coltura e alla verifica delle loro performance. E quindi necessario che gli operatori del controllo microbiologico prestino molta attenzione ai requisiti dei terreni di coltura che utilizzano, compiendo una scelta mirata dei fornitori tra coloro che possono garantire la piena conformità. I paragrafi che seguono vogliono rappresentare una guida riassuntiva alle novità introdotte dall armonizzazione, con tutti i dettagli relativi ai terreni di coltura cosigliati e al loro controllo qualità. Ci concentreremo quindi sulle indicazioni riportate nella sezione Armonizzata. 1. METODICHE PER LA CONTA TOTALE Il capitolo include i test da effettuare per la Conta Totale nel prodotto, allo scopo di verificare e quantificare la presenza di batteri aerobi e funghi nel prodotto. Indicazioni vengono date per la preparazione del campione, le procedure di conta e i metodi di convalida. 1.1 Preparazione del campione I metodi di preparazione del campione dipendono dalle caratteristiche del prodotto stesso. Vediamo qui di seguito come vengono differenziati i vari prodotti e quali sono i diluenti e i tamponi previsti: - prodotti solubili in acqua: vengono diluiti con Buffered Peptone Water ph 7.0, Phosphate Buffer ph 7.2 o TSB - prodotti non grassi ma insolubili in acqua: vengono diluiti con Buffered Peptone Water ph 7.0, Phosphate Buffer ph 7.2 o TSB, con l eventuale aggiunta di un detergente come il polisorbato 80 KAIROSafe review n. 6, febbraio /10

2 - prodotti grassi: vengono dissolti in isopropil miristato o mescolati con polisorbato 80, quindi diluiti dopo eventuale riscaldamento nel diluente prescelto aggiunto di polisorbato 80 - prodotti liquidi o solidi in forma di aerosol: vengono trasferiti su membrana filtrante o in contenitore sterile per successivo campionamento - cerotti transdermici: una volta rimosse le alette protettive e coperta la parte adesiva con garze sterili, vengono trasferiti nel diluente prescelto aggiunto di inattivanti come polisorbato 80 e/o lecitina. I diluenti e i tamponi utilizzati in questa fase sono sintetizzati nella Tabella 1. Buffered Peptone Water ph 7 Buffered Peptone Water ph 7 + polisorbato80 (1-10 g/l) Casein Soy Bean Digest Broth (TSB) Phosphate Buffer ph 7.2 Tabella 1: Diluenti e tamponi per la preparazione dei campioni Nel caso in cui il prodotto contenga agenti antimicrobici, che potrebbero interferire con il test, alla soluzione diluente vanno aggiunti degli agenti neutralizzanti, riportati nella Tabella 2. Sostanza interferente Gluteraldeidi, mercuriali Fenoli, Alcoli, Aldeidi, Sorbato Agente Neutralizzante Sodio idrogensolfato (sodio bisolfito) Diluizione Aldeidi Composti di ammonio quaternario, paraidrossibenzoato, bis-biguanidi Composti di ammonio quaternario, ioduri, paraben Mercuriali Mercuriali, alogeni, aldeidi Glicina Lecitina Polisorbato Tioglicollato Tiosolfato Tabella 2: Comuni agenti neutralizzanti per sostanze interferenti 1.2 Procedure di Conta Una volta preparato il campione, questo può essere analizzato secondo una delle metodiche seguenti: - Metodo della Membrana Filtrante: il campione viene trasferito su membrana filtrante (pori < 0.45 µm) ed incubato su TSA o SDA. - Metodo della Conta su Piastra: il campione viene incluso direttamente in SDA o TSA oppure viene strisciato sugli stessi. - Metodo MPN ( Most Probabile Number ): si preparano diluizioni seriali del campione in TSB che vengono incubate, quindi piastrate in TSA se necessario. La scelta del metodo dipende dalla natura del prodotto e dal limite microbiologico che si intende dimostrare. Viene sottolineato che il metodo MPN non è affidabile per la conta KAIROSafe review n. 6, febbraio /10

3 di lieviti e funghi e va tenuto presente per la conta dei batteri aerobi solo se non vi è alternativa. 1.3 Convalida delle procedure L armonizzazione introduce, in aggiunta alla descrizione delle procedure generali appena viste, una descrizione dettagliata dei test di convalida dei metodi adottati. Il metodo scelto deve essere infatti convalidato in tutte le sue fasi, per verificarne l idoneità all esame del prodotto. I terreni di coltura utilizzati per l incubazione dei campioni vanno convalidati verificandone la fertilità con ceppi microbici di riferimento. Gli stessi ceppi vanno anche utilizzati per convalidare l idoneità del metodo di conta prescelto. In particolare, l armonizzazione definisce: - le caratteristiche dei ceppi microbici da utilizzare nel controllo fertilità dei terreni di coltura (Tabella 3): le sospensioni utilizzate per l inoculo dei terreni devono essere standardizzate o preparate nel laboratorio secondo le indicazioni date dalla farmacopea - i dettagli relativi ai test di fertilità dei terreni di coltura: ceppi, numero di CFU, temperatura e tempo di incubazione (Tabella 4); - l affidabilità del metodo in presenza del prodotto, con protocolli di verifica che includono la contaminazione del prodotto con Microrganismi di riferimento: anche in questo caso vengono indicati i ceppi standard, le loro caratteristiche e le modalità di incubazione (Tabella 4). Particolare attenzione va osservata in questa fase per quei prodotti che possono interferire con il test, sia per la loro natura (agenti antimicrobici) sia per il metodo di preparazione (se è previsto l utilizzo di detergenti). Ceppi ATCC di riferimento Terreni di coltura per Conta Totale S. aureus ATCC 6538 TSA, TSB P. aeruginosa ATCC 9027 TSA, TSB B. subtilis ATCC 6633 TSA, TSB C. albicans ATCC TSA, SDA A. niger ATCC TSA, SDA Tabella 3: Ceppi microbici per Test di Fertilità Caratteristiche per l inoculo Non più di 5 passaggi dalla sorgente originaria 100 CFU Terreno TSA TSB SDA Utilizzo Conta totale batteri aerobi Conta totale batteri aerobi Conta totale muffe e lieviti Ceppi microbici di riferimento S. aureus ATCC 6538 P. aeruginosa ATCC 9027 B. subtilis ATCC 6633 C. albicans ATCC A. niger ATCC S. aureus ATCC 6538 P. aeruginosa ATCC 9027 B. subtilis ATCC 6633 C. albicans ATCC A. niger ATCC Test di fertilità/ Test di Idoneità del metodo 100 CFU C 3 giorni 100 CFU C 3 giorni 100 CFU C 5 giorni Tabella 4 : Terreni di coltura e ceppi di riferimento nella Conta totale KAIROSafe review n. 6, febbraio /10

4 2. METODICHE PER RICERCA SELETTIVA DI MICRORGANISMI Il capitolo include i test da effettuare per verificare e quantificare la presenza di specifici microrganismi nel prodotto in esame. Vengono indicate le procedure da seguire a seconda dei microrganismi, segnalando i terreni di coltura da utilizzare e le condizioni di incubazione. Come si è visto per la Conta Totale, anche qui la convalida delle metodiche usate acquista con l armonizzazione una particolare importanza. Le performance dei terreni di coltura previsti e l affidabilità delle procedure utilizzate vengono infatti valutate nel dettaglio. 2.1 Test sui prodotti: Terreni di Coltura e Condizioni di incubazione Le procedure da seguire per le analisi dei campioni sono differenziate sulla base della natura del microrganismo da ricercare. Per ogni categoria, vengono indicati i terreni da impiegare per le fasi di prearricchimento, arricchimento ed isolamento (Tabelle 5 e 6). Test per enterobatteriacee Test per Escherichia coli Test per Salmonella Test per Pseudomonas aeruginosa Test per Staphylococcus aureus Terreni di Coltura Enterobacteria enrichment broth-mossel Violet red bile glucose lactose agar (VRBGL) MacConkey broth MacConkey agar Tetrathionate Bile Brilliant Green Broth (TBG) Deoxycholate Citrate Agar Xylose, lysine, deoxycholate agar (XLD) Brilliant Green Agat Triple Sugar Iron Agar (TSI) Cetrimide agar Baird Parker Agar Condizioni di incubazione C per hr, hr (test quantitativo) dopo prearricchimento in Lactose Broth hr per i cerotti transdermici Subcultura da Mossel Broth: C per hr C per hr dopo Subcultura da MacConkey Broth: C per hr C per hr dopo Subcultura da TBG Broth: C per hr Conferma in provette C per hr o hr (cerotti transdermici) dopo C per hr o hr (cerotti transdermici)dopo Reinforced medium for C per 48 hr clostridia Test per Clostridi Subcultura da Reinforced Medium: Columbia agar C per 48 hr Lactose Monohydrate Sulphite Metodo MPN Medium (per C. perfringens) C per hr Tabella 5: Terreni di coltura previsti per la ricerca selettiva, secondo il Metodo EP. Le metodiche armonizzate appaiono semplificate; inoltre, è prevista la ricerca di Candida albicans, non contemplata dalla Farmacopea Europea (Tabella 6). KAIROSafe review n. 6, febbraio /10

5 Test per enterobatteriacee Test per Escherichia coli Test per Salmonella Test per Pseudomonas aeruginosa Test per Staphylococcus aureus Test per Clostridi Terreni di Coltura Enterobacteria enrichment broth-mossel Violet red bile glucose agar (VRBG) MacConkey broth MacConkey agar Rappaport Vassiliadis Salmonella enrichment broth Xylose, lysine, deoxycholate agar (XLD) Cetrimide agar Mannitol salt agar Reinforced medium for clostridia Columbia agar Condizioni di incubazione C per hr dopo Subcultura da Mossel Broth: C per hr C per hr dopo Subcultura da MacConkey Broth: C per hr C per hr dopo Subcultura da RVS Broth: C per hr C per hr dopo C per hr dopo C per 48 hr Subcultura da Reinforced Medium: C per 48 hr C per 3-5 giorni Test per Candida Sabouraud dextrose broth albicans (SDB) Sabouraud dextrose agar Subcultura da SDB: (SDA) C per hr Tabella 6: Terreni di coltura previsti per la ricerca selettiva, secondo il Metodo Armonizzato. In rosso, i terreni non contemplati dal Metodo della Farmacopea Europea (EP) Nel dettaglio, l armonizzazione prevede: - Enterobatteriacee:, arricchimento in Mossel Broth, isolamento in VRBG Agar - Escherichia Coli:, arricchimento in MacConkey Broth, isolamento in MacConkey Agar - Salmonella:, arricchimento in RVS, isolamento in XLD - Pseudomonas aeruginosa: arricchimento in TSB, isolamento in Cetrimide Agar - Staphylococcus aureus: arricchimento in TSB, isolamento in Mannitol Salt Agar - Clostridi: arricchimento in Reinforced Clostridial Medium, isolamento in Columbia Agar - Candida albicans: arricchimento in Sabouraud Dextrose Broth, isolamento in Sabouraud Dextrose Agar Le formulazioni complete dei terreni di coltura sono riportate dalla Farmacopea nello stesso capitolo, consentendo così agli operatori del controllo microbiologico di verificare la conformità dei terreni pronti all uso o disidratati che vengono acquistati o di prepararli personalmente partendo dai singoli ingredienti. 2.2 Convalida delle procedure: Verifica delle Performance dei Terreni di coltura L armonizzazione prevede una descrizione dettagliata della convalida delle metodiche utilizzate. Le performance dei terreni previsti vanno convalidate, per verificare che i requisiti di fertilità siano conformi con quanto richiesto, alle condizioni del test. KAIROSafe review n. 6, febbraio /10

6 Il test di convalida va effettuato su ogni lotto di terreno, sia esso in formato disidratato, pronto all uso o preparato nel laboratorio. Vengono definite: - le proprietà di crescita da verificare - i ceppi microbici di riferimento - le condizioni del test di convalida (temperatura e tempo di incubazione, CFU da inoculare) Proprietà di crescita I terreni di coltura vanno testati per verificarne la capacità di promuovere o inibire la crescita di un determinato microrganismo, o semplicemente la capacità di indicarne la presenza/assenza. Il metodo armonizzato definisce per ogni terreno le proprietà da testare, indicando anche i microrganismi di riferimento da utilizzare (Tabella 7). Terreni di coltura Proprietà Ceppi microbici di riferimento Enterobacteria enrichment broth-mossel Violet red bile glucose agar MacConkey broth MacConkey agar Rappaport Vassiliadis Salmonella enrichment broth Xylose, lysine, deoxycholate agar Inibizione + indicazione Inibizione + indicazione Inibizione + indicazione P. aeruginosa S. aureus P. aeruginosa S. aureus Salmonella enterica ssp. enterica serotype typhimurium or Salmonella enterica ssp. enterica serotype abony S. aureus Salmonella enterica ssp. enterica serotype typhimurium or Salmonella enterica ssp. enterica serotype abony P. aeruginosa S. aureus Indicazione Cetrimide agar Inibizione Mannitol salt agar + indicazione Inibizione Reinforced medium for Cl. sporogenes clostridia Columbia agar Cl. sporogenes Sabouraud dextrose broth C. albicans Sabouraud dextrose agar C. albicans + indicazione Tabella 7: Test di fertilità per i Terreni di Coltura previsti dal Metodo Armonizzato Ceppi microbici di riferimento Vanno utilizzate sospensioni già standardizzate o preparate secondo le indicazioni della farmacopea. I microrganismi utilizzati per l inoculo non devono aver subito più di cinque passaggi dalla sorgente originaria. KAIROSafe review n. 6, febbraio /10

7 I ceppi ATCC indicati sono i seguenti: - Staphylococcus aureus ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Escherichia Coli ATCC Salmonella thyphymurium ATCC Candida albicans ATCC Clostridium Sporogenes ATCC o Il metodo della Farmacopea Europea prevede anche l utilizzo di Clostridium Perfringens ATCC Condizioni del test Le condizioni alle quali effettuare il test di convalida dipendono dalla proprietà che si intende verificare nel terreno di coltura - Promozione delle crescita Inoculare non più di 100 CFU del microrganismo appropriato (Tabella 7); incubare alla temperatura specifica per non più del tempo inferiore indicato per il test (Tabella 5). Ad esempio, volendo verificare il MacConkey Broth, si dovrà inoculare Escherichia Coli ATCC 8739 o Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 a C per non più di 24 hr. - Inibizione della crescita Inoculare almeno 100 CFU del microrganismo appropriato (Tabella 7); incubare alla temperatura specifica per non meno del tempo superiore indicato per il test (Tabella 5). Ad esempio, volendo verificare il MacConkey Broth, si dovrà inoculare Staphylococcus aureus ATCC 6538 a C per non meno di 48 hr. - Indicazione presenza/assenza Effettuare lo striscio su piastra, inoculando non più di 100 CFU del microrganismo appropriato (Tabella 7); incubare alla temperatura specifica per un tempo incluso nel range indicado per il test (Tabella 5). Ad esempio, volendo verificare l XLD Agar, si dovrà inoculare Escherichia Coli ATCC 8739 a C per hr. 3. SCELTA DEI MATERIALI Vista l importanza data dall armonizzazione ai metodi di convalida delle procedure utilizzate, diventa fondamentale per l operatore del Controllo Microbiologico l utilizzo di prodotti pienamente conformi e standardizzati. 3.1 Terreni di Coltura I terreni di coltura, sia pronti all uso che disidratati, devono presentare formulazioni pienamente conformi e devono essere accuratamente certificati. KAIROSafe propone una gamma completa di terreni di coltura, sia disidratati che pronti all uso in vari formati, che garantiscono il rispetto dei requisiti della Farmacopea, per accompagnare i propri clienti durante il processo di armonizzazione e garantire loro l utilizzo di materiale pienamente conforme (Scheda 1). KAIROSafe review n. 6, febbraio /10

8 SCHEDA PRODOTTO 1 TERRENI DI COLTURA CONFORMI ALLA FARMACOPEA EUROPEA KAIROSafe propone tutti i terreni di coltura conformi alle richieste della Farmacopea Europea, in formato disidratato e pronto all uso. La gamma include i terreni previsti dal Metodo della Farmacopea Europea e quelli previsti dal Metodo Armonizzato. I prodotti sono sempre accompagnati da Certificazione di Qualità lotto-specifica, con i dettagli relativi ai test fisici e microbiologici. Terreni di coltura Baird Parker Agar Brilliant Green Agar Buffered Peptone Water Cetrimide Agar Columbia Agar Desoxycholate Citrate Agar Lactose Broth Lactose Sulphite Broth MacConkey Agar MacConkey Broth Mannitol Salt Agar Mossel EE Broth Potato Dextrose Agar R2A Agar Reinforced Clostridial Medium RVS Enrichment Broth Sabouraud Dextrose Agar (SDA) Sabouraud Dextrose Broth (SDB) SDA + CAF50 TBG Broth TSA TSB Triple Sugar Iron Agar (TSI) Violet Red Bile Glucose Agar (VRBG) Violet Red Bile Glucose Lactose Agar (VRBGL) XLD Formati 500 g, piastre pronte 500 g, flaconi 500 g, piastre, flaconi 500 g, piaster pronte, flaconi, provette 500 g, piastre, flaconi 500 g, piastre pronte, provette, flaconi 500 g, piastre pronte, provette, flaconi 500 g, piastre pronte, provette, flaconi 500 g, piastre pronte, provette, flaconi I terreni in polvere sono disponibili anche in Bulk da 5, 10 o 25 kg. KAIROSafe review n. 6, febbraio /10

9 3.2 Ceppi microbici di riferimento Per effettuare la convalida delle metodiche utilizzate ed i test di fertilità dei terreni di coltura, è previsto l utilizzo di sospensioni standardizzate già pronte o preparate in laboratorio. KAIROSafe propone ceppi microbici standardizzati già pronti, semplicissimi da utilizzare, derivati con licenza da colture ATCC, che consentono di svolgere le convalide secondo i requisiti della Farmacopea (Scheda 2). SCHEDA PRODOTTO 2 CEPPI MICROBICI LIOFILIZZATI MECCONTI KAIROSafe propone in esclusiva in Italia i ceppi microbici Mecconti, derivati con licenza da colture ATCC, per effettuare in piena conformità i test di fertilità dei terreni di coltura. I microrganismi sono liofilizzati in forma di pellet e sono confezionati singolarmente in modo da ottimizzarne l uso, evitando sprechi o contaminazioni, in tre formati: MicroPellets: ceppi titolati, <100 CFU/0.1 ml, a 3 passaggi Il Set è costituito da due piccole provette di plastica, una contenente il pellet liofilizzato e l altra 1 ml di liquido per la ricostituzione. Lo scioglimento del pellet è istantaneo e la sospensione ottenuta contiene 10 dosi da CFU MicroSwabs e MicroSwabs Plus: ceppi non titolati, > CFU/pellet, a 4 o 2 passaggi rispettivamente Il pellet liofilizzato si trova all interno di una provetta con tapposerbatoio, a cui è applicato un tampone ovattato. Il sistema consente lo scioglimento del pellet e i successivi strisci senza alcuna manipolazione da parte dell operatore. I prodotti sono accompagnati da Certificazione di Qualità lotto-specifica, scheda tecnica e scheda di sicurezza. Microrganismi MicroPellet MicroSwab MicroSwabPlus Aspergillus niger ATCC MP-GP-A01 MS-A017 MS2-A17 Bacillus subtilis ATCC 6633 MP-GP-B03 MS-B007 MS2-B007 Candida albicans ATCC MP-GP-C01 MS-C005 MS2-C005 Clostridium perfringens ATCC MP-GP-C05 MS-C026 MS2-C026 Clostridium sporogenes ATCC MP-GP-C03 MS-C030 MS2-C030 Clostridium sporogenes ATCC MP-GP-C04 MS-C029 MS2-C029 Escherichia Coli ATCC 8739 MP-GP-E01 MS-E032 MS2-E032 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 MP-GP-P02 MS-P030 MS2-P030 Salmonella tiphymurium ATCC MP-GP-S02 MS-S018 MS2-S018 Staphylococcus aureus ATCC 6538 MP-GP-S03 MS-S047 MS2-S047 * The ATCC Licensed Derivative emblem, the ATCC Licensed Derivative word mark and the ATCC catalog marks are trademarks of ATCC used under license. Kairosafe is licensed to use these trademarks and to sell licensed products manufactured for Mecconti using ATCC materials derived from ATCC cultures. Look for the ATCC Licensed Derivative emblem for products derived from ATCC cultures. KAIROSafe review n. 6, febbraio /10

10 Per informazioni e richieste: KAIROSafe S.r.l. Sistiana, 41/D Duino Aurisina (TS) Tel/fax: web: KAIROSafe review n. 6, febbraio /10

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