Definizione dell informazione desiderata

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1 Università Ca Foscari di Venezia Dipartimento di Chimica Fisica VALUTAZIOE DEL DATO AALITICO Dr. Ligia Maria Moretto AA. 006/07 1

2 Definizione dell informazione desiderata Scelta del metodo di analisi (necessità di esperimenti preliminari?) Campionamento appropriato Determinazione della quantità di campione in: massa, volume, superficie Preparazione al fine di ottenere il campioni nella forma idonea per l analisi Solido omogeneizzazione Liquido solubilizzazione Gas vaporizzazione Eliminazione dei possibili interferenti Eseguire l analisi chimica: Standard di calibrazione e campione Convertire i dati in risultati numerici Eseguire un analisi statistica Corredare le risposte numeriche con i relativi limiti di errore Interpretare i risultati per risolvere il problema

3 L importanza della valutazione del dato analitico ottenuto in laboratorio 3

4 Grafico dei risultati dello studio interlaboratorio sulla determinazione dell aflatossina nei semi di cacao [Aflatossina] aggiunta Laboratorio Aflatossina totale (ppb) 4 Horwitz, W., Anal.Chem.54 (198) 67A-76A.

5 Valutazione dei dati analitici Replicati: campioni identici analizzati esattamente nello stesso modo. Media: la media di due o più misure si identifica con la media aritmetica. x i= = 1 x i Mediana: la mediana è il valore centrale di un set di dati che sono stati ordinati in ordine di grandezza. E usata spesso quando un set contiene un outlier, cioè un valore che differisce significativamente del resto dei dati. Un outlier può avere un effetto marcato sulla media, ma non sulla mediana.. 5

6 ACCURATEZZA: grado di concordanza tra valore misurato e valore vero. Viene espresso il termini di ERRORE - normalmente errore percentuale. Valore vero di una misura: in generale è sconosciuto. Per determinare l accuratezza di un metodo analitico si può ricorrere a: -materiali di riferimento certificati -confronto con altri metodi d analisi standard - intercalibrazione tra laboratori diversi 6

7 PRECISIOE: grado di concordanza tra misurazioni diverse di un campione eseguite nello stesso modo. Si determina mediante analisi replicata. E espressa mediante la DEVIAZIOE STADARD. 7

8 Ripetibilità e riproducibilità sono due tipi di precisione: RIPETIBILITA : analisi replicata del campione nelle stesse identiche condizioni all interno di un set di misure (within-run precision) RIPRODUCIBILITA : analisi replicata del campione in condizioni diverse (es. diverso giorno, diverso operatore, diverso reagente, etc) (between-run precision) 8

9 A: buona precisione, buona accuratezza B: buona precisione, scarsa accuratezza C: buona accuratezza, scarsa precisione D: scarsa accuratezza, scarsa precisione valore vero valore misurato 9

10 Cifre significative Dato analitico Risultato di una prova Da misura sperimentale umero ottenuto dopo elaborazioni, calcoli, ecc Cifre significative Prestazioni degli strumenti (incertezza della misura) Dal metodo usato Riportare le cifre significative note con la certezza più la prima cifra incerta indicando l intervallo di incertezza. 10

11 Esempio di grandezze e relative incertezze: Bilancia digitale con precisione di ± 0.1 mg ± g Bilancia digitale con precisione di ± 0.0 g 4.00 ± 0.0 g Potenziometro digitale con precisione di ± 1mV 434 ± 1 mv Potenziometro analogico con precisione di ± 5mV 434 ± 5 mv Buretta con divisioni da 0.05 ml e tolleranza di ± 0.03 ml 5.5 ± 0.03 ml Spettrofotometro con precisione di ± A ± A Massa molare di a C O ±

12 Calcoli e arrotondamento Addizione e sottrazione Risultato: deve avere tante cifre decimali quante ne possiede il termine che ne ha di meno incertezza: uguale alla radice quadrata della somma dei quadrati delle singole incertezze (10.1 ± 0.)+ (3.3 ± 0.01)+ ( ± 0.05) = Incertezza: ( 0.) + ( 0.01) + ( 0.05) = ± 0. 1

13 Moltiplicazione e divisione Calcoli e arrotondamento Risultato: deve avere tante cifre decimali quante ne possiede il termine che ne ha di meno incertezza: radice quadrata della somma dei quadrati delle singole incertezze, espresse come percentuale rispetto al valore cui si riferiscono. ( 56 ± 1) ( ± 0.00) ( 15.0 ± 0.5) ( 39.7 ± 0.15) = Incertezza: = % = ±

14 Errore assoluto di una misura è la differenza, compreso il segno, tra il valore misurato (x i ) e il valore vero (x t ) E= x x i t Errore relativo di una misura è dato dall errore assoluto diviso per il valore vero E r = x i x t x t 100% Tipi di errori nei dati sperimentali 1. errori sistematici (o determinati): influenzano l'accuratezza. errori casuali (o indeterminati): influenzano la precisione 3. errori grossolani (responsabili per gli outliers) 14

15 1. Errori sistematici: Errori strumentali: causati da malfunzionamento degli strumenti, strumenti starati, instabilità sorgenti di energia, ecc. controllo: calibrazione periodica degli strumenti, ecc Errori di metodo: sono i più difficili da identificare e correggere. Es: incompletezza di reazioni, perdita per evaporazione, adsorbimento di analita, interferenti, ecc. Rivelazione: analisi di campione standard, analisi indipendenti, determinazione del bianco, usare metodo analitico diverso. Errori personali: es: stima posizione indicatore, colore di una soluzione, livello del menisco di un liquido, ecc. Minimizzazione:attenzione e autodisciplina, controllo dati di partenza, calcoli, ecc. 15

16 . Errori casuali: Errore casuale o errore indeterminato: Deriva dall effetto prodotto dalla presenza di variabili incontrollate (o incontrollabili) nelle misure. L errore casuale ha identiche probabilità di essere positivo o negativo. La statistica fornisce strumenti utili per decidere di accettare conclusioni che hanno elevata probabilità di essere corrette e rifiutare altre che non ne hanno. 16

17 Tabella 1. Dati replicati per la calibrazione di una pipetta da 10 ml (dati riportati nell ordine ottenuto) prova Volume (ml) prova Volume (ml) prova Volume (ml) 1 9, , ,976 9, , , , , , , , , ,975 9, , ,98 3 9, , , , , ,98 5 9, ,98 9 9, , , , , , , , , , , , , , , , , , ,98 3 9, , , , , , ,983 Distribuzione di frequenza dei dati della tabella 1. Volume in ml nell'intervallo umero di prove a a a a a a a a a % Volume medio = 9.98 ml Volume mediano = 9.98 ml Range o dispersione = 0.05 ml Deviazione standard = ml 17

18 Curva Gaussiana o curva normale degli errori La Gaussiana rappresenta la frequenza relativa y di varie deviazioni dalla media in funzione della deviazione dalla media. Data: Data9_Count Model: Gauss 0 15 Chi^ = R^ = y ± xc ± w ± A ± frequenza intervallo dei valori misurati 18

19 y = e ( x µ ) / σ σ π Dove: µ = media σ = deviazione standard 1.0 µ frequenza relativa 0.5 σ curva gaussiana normale : è una curva gaussiana in cui µ = 0 e σ = z=(x-µ)/σ 19

20 Intervallo percentuale misure µ ± 1σ 68.3 % La probabilità di ottenere un valore di z compreso in un certo intervallo equivale all area di quell intervallo. µ ± σ 95.5 % µ ± 3σ 99.7 % 0

21 Trattamento statistico dell errore casuale Proprietà di una curva Gaussiana Espressa in termini di: media della popolazione µ e deviazione standard della popolazione σ. POPOLAZIOE: il numero infinito di dati viene definito una popolazione o universo di dati. µ = media lim i= 1 x i σ = Deviazione standard i= 1 ( x µ) i CAMPIOE: un numero finito di osservazioni sperimentale viene definito un campione di dati media Deviazione standard x i= = 1 x i s = i= 1 ( x ( i x) 1) (-1) = numero di gradi di libertà 1

22 Misura della precisione Deviazione standard del campione: s = i= 1 ( x ( i x) 1) Varianza: s = i= 1 ( x i x) 1 Deviazione standard relativa: RSD = ) 1000 ( x s s Coefficiente di variazione: CV = ( ) 100 x

23 Esempio: el corso di una analisi replicata relativa al contenuto di piombo nel sangue, sono stati ottenuti i seguenti risultati: ,756 0, ppm di Pb Calcolare la media e la deviazione standard di questo insieme di dati. Eq. 3.4 : riarrangiamento dell equazione di s s = i= 1 x i ( i= 1 x 1 i ) Fare con foglio excell o origin! 3

24 Per l insieme dei dati dell esempio precedente, calcolare: a) la varianza b) la deviazione standard relativa in parti per mille c) il coefficiente di variazione d) la dispersione X = ppm Pb s = ppm Pb 0,75 0,756 A) s = (0.0038) = 1.4x10-5 0,751 B) RSD = (0.0038/0.754)x1000 = 5.0 ppt c) CV = (0.0038/0.754)x100 = 0.5% media sdt dev varianza 0,760 0,75 0,754 0, , D) w = =

25 Si esegue un analisi per la determinazione delle proteine in un lotto di proteina nitrogenasi ferro-molibdeno in soluzione 0.1 M acl ph 7.35 con tampone tris. I valori trovati per i cinque campioni sono: 7.5, 8.3, 9.0, 8.5 e 8. mg di proteina per ml. Calcolare il valore medio della concentrazione della proteina e la mediana delle misure, la deviazione standard, la deviazione standard relativa e la dispersione. Media: x xi ( ) i = x = = 8.3mg/L 5 Dati ordinati: 7.5, 8., 8.3, 8.5, 9.0 Mediana: 8.3 mg/l Deviazione standard: s = i= 1 ( x i ( x) 1) 0.54 mg/l Deviazione standard relativa: RSD = (s/x)100 = (8.3/0.54)x100= 1.9% Dispersione: w = = 1.5 mg/l 5

26 L affidabilità di s come misura della precisione Raccolta di dati per aumentare l affidabilità di s Deviazione standard cumulata s cumulata = 1 ( xi x ) + 1 i= 1 j= ( x j +... x t ) +... Dove: 1 è il numero di dati nell insieme 1, è il numero di dati nell insieme, ecc. t è il numero degli insiemi di dati che sono campionati. 6

27 E stato determinato il mercurio in sette pesci pescati nella Baia di Chesapeake con un metodo basato sull assorbimento di una radiazione da parte del mercurio gassoso elementare. Calcolare una stima accumulata della deviazione standard per il metodo utilizzato, basata sulle prime tre colonne di dati: Campione campioni analizzati [Hg] (ppm) [Hg] Media (ppm) Somma quadrati deviazione dalla media Calcolo della media (4 colonna): X= ( )/3= Somma dei quadrati della deviazione della media: misure ,1.58, , 0.98, 1.0, , , 1.93,.1,.16, 1.89, ,0.58, 0.64, ,.44,.70,.48, , 1.15, 1., Somma dei quadrati ( ) +( ,58) +( ) = s s cum cumulata = = 1 ( xi x1 ) + i= 1 j= S cum = 0.10 ppm Hg ( x Si noti che viene perso un grado di libertà per ognuno dei sette campioni. Poiché restano più di 0 gradi di libertà, comunque il valore calcolato di s può essere considerato una buona Approssimazione di σ, ovvero s σ = 0.10 ppm Hg. 7 j x t ) +...

28 LIVELLI DI FIDUCIA O DI COFIDEZA Limiti di fiducia: definiscono un intervallo intorno a xche con una certa probabilità contiene µ. Intervallo di fiducia: è definito dai limiti di fiducia ed si riferisce alla probabilità che la vera media µ si trovi ad una certa distanza della media misurata x. Livello di fiducia: fissa i limiti entro cui deve trovarsi il valore vero. LF per µ = x ± zσ LF per µ = x ± zσ Livelli di fiducia, % z

29 ITERVALLO DI FIDUCIA QUADO σ O E E OTA: la t di Student Un singolo insieme di misure replicate non solo deve fornire una media, ma anche consentire una stima della precisione. Il valore di s calcolato da un piccolo insieme di dati può essere piuttosto incerto. quindi: i limiti di fiducia sono necessariamente più ampi! Parametro t: tiene in considerazione la variabilità di s t = x µ s Livello di fiducia per la media x di misure replicate: µ = x ± ts 9

30 t di Student Valori per t per vari livelli di fiducia Gradi di libertà Fattore relativo all'intervallo di fiducia 80% 90% 95% 99% 99,9%

31 Il test t viene utilizzato per confrontare fra loro due serie di misure, al fine di decidere se esse sono o non sono in accordo. Ipotesi nulla: i valori medi non differiscono tra loro Statistica: fornisce una stima della probabilità che la differenza osservata sia dovuta semplicemente a errori casuali. Decisione arbitraria: Si rifiuta l ipotesi nulla nel caso in cui le probabilità di ottenere la differenza osservata a causa di errori casuali siano inferiore al 5%. In base a questo criterio vi è il 95% di probabilità che le relative conclusioni siano vere. t calc > t tab : risultati sono diversi t calc < t tab : risultati sono statisticamente identici 31

32 Caso esempio 1: COFROTO TRA RISULTATO MISURATO E VALORE VERO Campione di riferimento (materiale certificato): carbone con 3.19% di zolfo Risultati ottenuti con un nuovo metodo analitico: 3.9%, 3.30 %, 3.% e 3.3% media = 3.6% deviazione standard = 0.04 Il nuovo metodo è valido? Calcoliamo il valore di t per questo set di misure e lo confrontiamo con il valore tabulato: µ = x ± ts t calc t calc = = x x " vero" s = 3.4 Dalla tabella: al 95% con 3 gradi di libertà: t tab = 3.18 t calc > t tab il risultato ottenuto è diverso dal valore vero 3

33 Considera l esempio della determinazione del mercurio nei pesci visto prima. Calcolare i limiti di fiducia all 80% e al 95% per (a) il primo dato (1.80 ppm di Hg) e (b) il valore medio (1.67 ppm di Hg) per il campione 1. Assumere in ogni caso che s σ=0.1. Dalla tabella t si ricava:t=1.9 per LF 80% t=1.96 per LF 95% Per una misura: 1.9x0.10 LF80 % = 1.80 ± = 1.80 ± x0.10 LF95 % = 1.80 ± = 1.80 ± Osservando questi dati, si conclude che ci sono 80 probabilità su 100 che µ, la media della popolazione (ovvero, in assenza di errori sistematici, il valore vero) abbia un valore compreso tra 1.67 e 1.93 ppm di Hg. Inoltre, c è una probabilità del 95% che essa abbia un valore compreso tra 1.60 e.00 ppm Hg. Per tre misure: 1.9x0.10 LF80 % = 1.67 ± = 1.67 ± x0.10 LF95 % = 1.67 ± = 1.67 ± Cosi, la probabilità che la media della popolazione sia compresa tra 1.60 e 1.74 ppm di Hg è 80 su 100, mentre è di 95 su 100 che la media sia compresa tra 1.56 e 1.78 ppm. 33

34 Confronto tra due metodi Si vuole valutare un nuovo metodo di preparazione del campione per la determinazione della concentrazione di acido palmitico nell olio di semi di lino mediante gascromatografia, previa esterificazione del campione. ella seconda e terza colonna della tabella vengono riportati i risultati ottenuti dall analisi di campioni di olio provenienti da diversi fornitori. Ci si chiede, al livello di probabilità del 95% e del 99%, se i risultati dei due metodi possono ritenersi diversi. Campione Metodo Standard uovo metodo d i d i =differenza tra i valori nei due metodi A B D: media dei valori di d i = C D E s D ( d = i D) 1 s D = F Valore medio =D D 0.07 ± t = ± = 6 = s t calc D Dalla tabella t, per =6, t 95 =.57 e t 99 =4.03; dal confronto con t calc =1.13 si conclude che i due metodi danno risultati si conclude che i due metodi danno risultati statisticamente coincidenti sia al 95% che al 99% di probabilità. Ricordare che più grande è il valore di t calc, più si è certi che due risultati siano diversi! 34

35 E stato determinato il mercurio in sette pesci pescati nella Baia di Chesapeake con un metodo basato sull assorbimento di una radiazione da parte del mercurio gassoso elementare. Calcolare una stima accumulata della deviazione standard per il metodo utilizzato, basata sulle prime tre colonne di dati: Campione campioni analizzati [Hg] (ppm) [Hg] Media (ppm) Somma quadrati deviazione dalla media Calcolo della media (4 colonna): X= ( )/3= Somma dei quadrati della deviazione della media: misure ,1.58, , 0.98, 1.0, , , 1.93,.1,.16, 1.89, ,0.58, 0.64, ,.44,.70,.48, , 1.15, 1., Somma dei quadrati ( ) +( ,58) +( ) = s s cum cumulata = = 1 ( xi x1 ) + i= 1 j= S cum = 0.10 ppm Hg ( x Si noti che viene perso un grado di libertà per ognuno dei sette campioni. Poiché restano più di 0 gradi di libertà, comunque il valore calcolato di s può essere considerato una buona Approssimazione di σ, ovvero s σ = 0.10 ppm Hg. 35 j x t ) +...

36 Quante misure replicate del campione 1 dell esempio del Hg sono necessarie per ridurre l intervallo a ± 0.07 ppm di Hg ad un livello di fiducia del 95%? L intervallo di fiducia (IF) è dato dal secondo termine sulla destra dell equazione: IF = ± zσ quindi: IF = 0.07 = ± zσ = ± = 7.8 Con otto misure e di conseguenza una probabilità leggermente superiore al 95% si potrebbe ottenere una media della popolazione compresa nell intervallo ±0.07 ppm rispetto alla media sperimentale. 36

37 Un chimico ha ottenuto i seguenti risultati relativi al contenuto di alcol in un campione di sangue: 0.084%, 0.089% e 0.079%. Calcolare i limiti di fiducia della media al 95% assumendo che: a) on si ha alcuna conoscenza aggiuntiva sulla precisione del metodo; b) Sulla base di esperienza precedenti, si sa che s σ= 0.005% di alcol. a) s x ( i x = 1 i ) / s = % C H 5 OH In questo caso, la media è 0.5/3= Dalla tabella t=4.30 per due gradi di libertà e al livello di fiducia del 95%. Cosi: 95% LF b) ts = x ± = ± 3 Poiché è disponibile un valore accettabile di σ: =0.084±0.01% C H 5 OH 95% LF = x ± ts = ± 3 =0.084±0.006% C H 5 OH Si nota che l intervallo di fiducia decresce notevolmente quando σ è nota. 37

38 Confronto tra la media sperimentale e il valore vero BIAS (errore sistematico) µ A =µ v µ B BIAS 38

39 ESEMPIO Si desidera valutare l esattezza di un nuovo metodo di analisi elettrochimica del cobalto nelle ceneri di inceneritori comunali. Allo scopo, un operatore analizza ripetutamente il materiale di riferimento certificato CRM176 (cenere di inceneritore cittadino contenente la concentrazione di analita C Co = 30,9 mg/kg). I risultati delle 11 analisi sono i seguenti : C Co (mg/kg) : 8,9; 9,8; 9,9; 30,6; 8,5; 31,; 3,1; 30,6; 30,9; 31,7; 30,0 Il risultato del bianco non è significativamente diverso da zero. Valutare l esattezza del risultato fornito dal nuovo metodo (P = 95%). Calcolo del valore medio e stima della deviazione standard: C mco = 30,38 mg/kg s = 1,103 mg/kg t 1-α/,10 =,8 Intervallo di fiducia: s t1 α /, 10 = Risultato: C exp = 30,38 ± 0,74 mg/kg (α = 0,05; ν = 10) L intervallo di fiducia comprende il valore certificato, 30,9 mg/kg, e quindi non si ha evidenza di bias nei limiti del livello di fiducia prescelto. 39

40 E stata verificata una nuova procedura per la rapida determinazione dello zolfo nei cheroseni; è noto è noto dal suo metodo di preparazione cheil campione analizzato contiene lo 0.13% (x v =0.13) di S. I risultati sono stati: %S: Sulla base di questi dati è possibile affermare che il metodo presenta un errore sistematico? xi = = x = 0.464/4 = % S x x v = = %S xi = = s = (0.464) 4 1 / 4 = Per LF 95% e tre gradi di libertà, t=3.18. Quindi: ts 4 = = ± Ci si può aspettare che una media sperimentale presenti deviazioni di ± o maggiori non più frequentemente di 5 volte su 100. Cosi, se concludiamo che x x è una differenza significativa e che un errore v = sitematico è presente, ci sbaglieremo, in media, meno di 5 volte su

41 Confronto tra due medie sperimentali x 1 x = ± ts cumulata E stato analizzato il contenuto di alcool di due botti di vino, per determinare se essi avessero origine diversa. Sulla base di sei analisi, è stato stabilito che il contenuto medio in etanolo della prima botte è 1,61%. Per la seconda botte, la media di quattro analisi è risultata 1.53% di alcool. Le dieci analisi hanno prodotto un valore cumulato di s pari allo 0.070%. Sulla base di questi dati, è possibile affermare che c è una differenza tra i due vini? In questo caso è possibile impiegare l equazione sopra, utilizzando t per otto gradi di libertà (10-). Al livello di fiducia del 95%: ± ts = ± = 0.10% 6 4 ± 1 La differenza osservata è: x x = % 1 = Con una media di 5 volte su 100 l errore casuale causerà una differenza pari a 0.10%. Al livello di fiducia del 95% dunque, non è stata 41 dimostrata alcuna differenza tra i contenuti di alcool nei due vini!

42 DETERMIAZIOE DI ERRORI GROSSOLAI Quando un insieme di dati contiene un risultato che sembra differire eccessivamente dalla media (outlier), bisogna adottare dei criteri opportuni per decidere se scartalo o meno. Gli outliers o dati anomali sono il risultato di errori grossolani on esiste una regola universale che consenta di decidere di scartare o di accettare un outlier! Il test Q: Qsper = xq xn / X q : risultato dubbio w x n : risultato più vicino al risultato dubbio w : dispersione (differenza tra il valore più grande e quello più piccolo dell insieme) Confrontare Q sper con Q crit dalla tabella: Se Q sper > Q crit : SCARTARE CO L ITERVALLO DI FIDUCIA IDICATO ELLA TABELLA. 4

43 Il test Q: d x 1 x x 3 x 4 x 5 x 6 w d = x 6 x 5 w = x 6 x 1 Q sper = d/w Se Q sper > Q crit allora si scarta x 6 43

44 CIFRE DI MERITO PER VALUTARE LA PRECISIOE DEI METODI AALITICI Termini Definizione Deviazione standard assoluta Deviazione standard relativa (RSD) s = i= 1 ( x RSD = i x) 1 s x Deviazione standard della media (S m ) s m = s Coefficiente di variazione (CV) CV 100% = x s Varianza s xi = valore numerico dell iesima misura x i= = 1 x i = media di misure 44

45 Applicazione della statistica alle misure effettuate nell analisi chimica METODO DI TARATURA Curva di taratura Metodo delle aggiunte standard Standard interno 45

46 DETERMIAZIOE QUATITATIVA: Curva di calibrazione (retta di taratura) La curva di calibrazione ricavata sperimentalmente riporta una quantità misurata, y, (segnale - variabile dipendente) in funzione della concentrazione nota, x, (serie di standard - variabile indipendente). 0.5 La composizione degli standard deve essere quanto più possibile vicina a quella del campione incognito! 0.4 Absorbance [Pb] / mg L -1 Concentrazione nel campione trovata per interpolazione Retta di calibrazione per l analisi del piombo tramite AAS. Un campione che presenta una assorbanza di 0.3 dovrebbe avere una concentrazione di Pb di 1 mg L-1. 46

47 Retta di taratura Determinare l equazione di regressione della retta di taratura. Controllare che il coefficiente di determinazione (R ) sia il più possibile vicino a 1. Controllare ed eventualmente scartare i punti aberranti. Controllare che l intercetta sia significativamente diversa da zero. Se questo non si verifica, indagare sulle cause. Determinare le concentrazioni incognite, magari su campioni replicati più volte, con il relativo intervallo di fiducia. Riutilizzare la retta in più sessioni analitiche, fino a quando i reagenti con i quali è stata determinata non sono terminati. Per sicurezza si possono preparare ogni volta uno o più standard di controllo, verificando che i segnali misurati cadano entro l intervallo di fiducia della misura attesa. 47

48 Sensibilità di un metodo La sensibilità (S) di un metodo è data dal rapporto tra la variazione del segnale (dy) in funzione della corrispondente variazione della concentrazione (dx), che esprime la variazione del segnale per ogni variazione di concentrazione unitaria S = dy dx Corrisponde alla pendenza della retta di calibrazione 48

49 Il metodo dei minimi quadrati per la realizzazione di curve di calibrazione A causa degli errori indeterminati associati al processo di misurazione, non tutti i dati si trovano esattamente sulla retta. Per cercare di derivare la migliore retta che interpoli i punti si usa la tecnica statistica chiamata analisi di regressione - essa consente di ottenere tale retta in maniera obiettiva e di specificare le incertezza associate. Useremo il metodo dei minimi quadrati. La retta di calibrazione viene definita algebricamente come: dove: Y i = mx i + b Y i è il risultato analitico X i è la concentrazione dell analita corrispondente a Y i m è la pendenza della retta (ossia la sensibilità del metodo) b è una costante chiamata intercetta, che rappresenta il valore di Y i quando X i = 0. (non considerare questo valore contribuisce all errore sistematico del metodo). 49

50 Metodo dei minimi quadrati: Si considera che: -ci sia una relazione lineare tra y e x - ai valori di x non viene associato errore Y i 10 8 Ŷ i Y (segnale) 6 4 Linear Regression for Data1_B: Y = A + B * X X (concentrazione) Parameter Value Error A B R SD P <

51 segnale 4,0 3,5 3,0,5,0 1,5 1,0 06/03/007 1:06 "/Graph1" (454165)] Linear Regression for Data1_B: Y = A + B * X Parameter Value Error A 0,5674 0,1583 B,0951 0, Deviazione standard dell intercetta Deviazione standard della pendenza 0,5 0,0 0,0 0, 0,4 0,6 0,8 1,0 1, 1,4 1,6 1,8 Conc analita Y = 0,5674 +,0951 X R SD P , , ,8034E Deviazione standard della retta di regressione ± ts È analoga alla deviazione standard di dati monodimensionali 51

52 DETERMIAZIOE QUATITATIVA: Metodo dell aggiunta standard Si basa su la relazione lineare tra segnale e concentrazione. È particolarmente indicato quando la composizione del campione è incognita o difficile da riprodurre. [Cu] campione Altezza del picco / cm lettura del campione incognito Retta delle aggiunte standard. La concentrazione nel campione è determinata per estrapolazione alla ascissa. In questo caso la concentrazione di rame nel campione è di 3.3 mg L [Cu] aggiunto /mg L -1 5

53 Aggiunta standard Effetto matrice 53

54 Metodo dell aggiunta standard o multipla Determinare l equazione di regressione della retta dei risultati delle aggiunte Controllare che il coefficiente di determinazione (R ) sia il più possibile vicino a 1. Controllare ed eventualmente scartare i punti aberranti. Controllare che l intercetta sia significativamente diversa da zero. Se l intercetta non è diversa da zero, esprimere un responso negativo (analita assente o inferiore ai limiti di rivelabilità o di quantificazione). Determinare la concentrazione incognita ponendo y (segnale) = 0 e calcolare l intervallo di fiducia. 54

55 L analisi dell acido ascorbico presente in una soluzione campione con il metodo dell aggiunta multipla, mediante la tecnica della voltammetria differenziale ad impulsi ha fornito il seguente risultato: Determinare la concentrazione incognita e l intervallo di fiducia. [AA] aggiunto µg/l 0 (Campione) I p (µa) Equazione della retta di regressione: Ip = C Ip (ma) [AA] (µg/l) Coefficiente di determinazione: R = Valore della concentrazione incognita: si trova in corrispondenza di Ip = 0. C = 1.6 µg/l di AA Intervallo di fiducia del valore della concentrazione incognita: Per α= 0.05 (p= 0.95) e v = si ha: t= Intervallo di fiducia = 7.4 b 0 ± t α ; ν. n 1 ( s n b s 1 ) + n x ( xi ) n y 1 x xi Si puo affermare con 95% di possibilità di non sbagliare che la retta passa per lo zero, cioè, si puo ragionevolmente affermare che il campione O 55 COTIEE ACIDO ASCORBICO.

56 Ip (ma) y = 15,57x + 4,85 R = 0,995 Fiducia al 95% per l intercetta [AA] (µg/l) ts ± = ± = B DATA1B UCL LCL 800 Y Axis Title X Axis Title Linear Regression for DATA1_B: Y = A + B * X Parameter Value Error A 4,85 9,15163 B 15,57 0, R SD P , , ,

57 RAGE DIAMICO E LIEARE Il range è l intervallo di concentrazione esplorato nel corso delle misurazioni. Il range dinamico è l'intervallo di concentrazione nel quale il segnale varia con la concentrazione: i limiti inferiore e superiore del range dinamico corrispondono, rispettivamente, al limite di rivelabilità ed alla più alta concentrazione alla quale un incremento di concentrazione produce ancora un incremento di segnale. Il range lineare esprime l'intervallo di concentrazione nel quale il segnale varia linearmente con la concentrazione. La costruzione del diagramma di calibrazione implica l adozione di un metodo di regressione. Quello più generalmente adottato è il metodo di regressione lineare ordinaria dei minimi quadrati (OLLSR). 57

58 [Analita]/mg/L ABS 1 0,03 0, , , , ,11 8 0, , ,51 0 0,3 5 0, , ,5 40 0, ,6 50 0,64 ABS 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, 0,1 0, [analita] /mg/l 58

59 DETERMIAZIOE QUATITATIVA: Metodo dello standard interno Lo standard interno è una specie chimica diversa dall analita, che viene aggiunta in quantità nota al campione incognito. La quantificazione viene fatta dal confronto tra il segnale dell analita con il segnale dello standard interno Quando si usa: Sono piu usati in cromatografia. quando la quantità di campione varia da una prova all altra in condizioni difficili da controllare; Per aiutare a identificare un evento di perdita del campione durante il processo analitico Lo standard interno deve avere proprietà note e stabili. 59

60 Metodo dello standard interno: è il metodo di quantificazione più usato nell analisi gascromatografica, in quanto consente di ottenere risultati più accurati ed affidabili, soprattutto se applicato al metodo della retta di taratura. In pratica, non si fa riferimento al picco dell analita, ma al rapporto dell area di questo e l area di un componente (lo standard interno), aggiunto in quantità nota alla miscela da analizzare. In questo modo si prepara la retta di taratura ovviando a problemi tecnici quali la riproducibilità del sistema di iniezione ed eventuali derive della sensibilità del rivelatore. La sostanza scelta come standard interno deve obbedire ad una serie di requisiti: non essere presente nel campione da analizzare; Essere stabile termicamente; Fornire un picco cromatografico ben risolto (non sovrapposto) da quello degli altri componenti Avere un tempo di ritenzione simile a quello dei componenti da determinare; Essere strutturalmente simile a questi ( e quindi avere un fattore di risposta simile) Essere sufficientemente pura e non reagire con i componenti del campione. 60

61 segnale del rivelatore Campione incognito Standard interno Le aree relative ai segnali dell analita e dello standard interno consentono di ricavare la quantità di campione incognito. Tempo (min) E necessario conoscere la risposta strumentale del rivelatore allo standard interno nei confronti di quella dell analita. 61

62 Segnale misurato Zona di quantificazione Segnale dovuto al solo analita Zona di rivelazione Segnale al Limite di quantificazione: sf+10σb 10σ b Valore medio del segnale del fondo sf 3σ b Segnale al Limite di rivelabilità: sf+3σ b zero Probabilità di ottenere il segnale 6

63 LIMITE DI RIVELABILITÀ E DI QUATIFICAZIOE Il limite di rivelabilità, o minima quantità rivelabile, ldr o lod (limit of detection) o DL (detection limit), è la concentrazione di analita che produce un segnale significativamente diverso da quello del bianco, ovvero la concentrazione corrispondente al minimo segnale significativo, S s. S s è un segnale vicino a quello del bianco (soluzione in cui l'analita è virtualmente assente) ma da esso significativamente differente, e quindi assegnabile all'analita sulla base di un criterio specifico. La definizione del DL discende dal criterio usato per accertarsi che il segnale sia significativamente diverso da quello del bianco. Il DL espresso in unità di concentrazione si ricava da S s tramite la curva di calibrazione. DL = 3σ b Segnale ldr S s. m Concentrazione 63

64 Stabilire il limite di rivelabilità e il limite di quantificazione per la determinazione del rame in voltammetria di stripping anodico a impulsi differenziali. Determinare la concentrazione incognita e l intervallo di fiducia. Misure del bianco (na) [Cu] aggiunto µg/l 0 (Campione) I p (na) I (na) [Cu] agg (µg/l) Equazione della retta di regressione: Coefficiente di determinazione: R = Ip = C + 9 Deviazione standard del bianco: s b = 30.4 Valore della concentrazione incognita: si trova in corrispondenza di Ip = 0. C = 51.5 (± )µg/l di AA Limite di rivelabilità: Limite di quantificazione: DL = 3σ b /m QL = 10σ b /m DL = µg/l QL = µg/l

65 In teoria, per valutare il ldr (lod) è quindi necessario eseguire un numero adeguato di misurazioni replicate del bianco, in modo da stimare la distribuzione del segnale ad esso relativo (per ipotesi affetto da rumore Gaussiano). È quindi possibile individuare il minimo segnale significativo, S s. Avendo scelto come limite decisionale un segnale a nostro giudizio maggiore di quello medio del bianco. Frequenza relativa µ B -4σ µ B -σ µ B µ B +σ µ B +4σ Segnale ammettiamo di poter individuare la presenza dell analita ogni volta che il segnale del campione in esame risulta maggiore del segnale prescelto. 65

66 Riportando in grafico i punti sperimentali, si può notare che la sensibilità (segnale/concentrazione) è circa uguale a 15 u.a. (stima grafica), ed è costante fino a livelli di concentrazione dell ordine di 70 nl/l. Il range dinamico sembra estendersi da 0,1 nl/l a circa di 90 nl/l Segnale (u.a.) Concentrazione (nl/l) Il range lineare si estende, approssimativamente, fino a C = nl/l. 66

67 CRITERI UMERICI PER LA SCELTA DI U METODO AALITICO Precisione Accuratezza Criterio Cifra di merito Deviazione standard assoluta, deviazione standard relativa, coefficiente di variazione, varianza Errore sistematico assoluto, errore sistematico relativo Sensibilità Sensibilità di calibrazione, sensibilità analitica Limite di rivelabilità Intervallo di concentrazione Bianco più tre volte la deviazione standard Dalla concentrazione relativa al limite di misurazione quantitativa (LOQ) alla concentrazione limite di risposta lineare (LOL) Seletività Coefficiente di selettività 67

68 L importanza dell incertezza di misurazione è stata pienamente recepita dalla norma UI CEI E ISO/IEC Stima dell'incertezza di misura (dalla UI CEI E ISO/IEC 1705) Un laboratorio di taratura, o un laboratorio di prova che esegue le proprie tarature, deve avere e deve applicare una procedura per stimare l'incertezza di misura per tutte le tarature e tipi di taratura I laboratori di prova devono avere e devono applicare procedure per stimare l'incertezza delle misure. In certi casi la natura dei metodi di prova può escludere il calcolo dell'incertezza di misura rigoroso e valido dal punto di vista metrologico e statistico. In questi casi il laboratorio deve almeno tentare di identificare tutte le componenti dell'incertezza e fare una stima ragionevole, e deve garantire che l'espressione del risultato non fornisca un'impressione errata dell'incertezza. Una stima ragionevole deve essere basata sulla conoscenza del metodo e sullo scopo della misura e deve far uso, per esempio, delle esperienze precedenti e della validazione dei dati. 68

69 (dalla UI CEI E ISO/IEC 1705) ota 1 Il livello di rigore necessario in una stima dell'incertezza di misura dipende da fattori come: - i requisiti dei metodo di prova; - i requisiti dei cliente; - l'esistenza di limiti stretti su cui sono basate le decisioni della conformità ad una specifica. ota In quei casi in cui un metodo di prova ben conosciuto specifica i limiti delle maggiori sorgenti di incertezza e specifica la forma di presentazione dei risultati calcolati, si ritiene che il laboratorio abbia soddisfatto questo punto, seguendo i metodi di prova e le istruzioni per la presentazione dei risultati (vedere 5.10). 69

70 (dalla UI CEI E ISO/IEC 1705) Quando si stima l'incertezza di misura, devono essere prese in considerazione, utilizzando appropriati metodi di analisi, tutte le componenti dell'incertezza che sono di rilievo in una data situazione. ota 1 Le fonti che contribuiscono all'incertezza di misura includono, in modo non esaustivo, i campioni di riferimento e i materiali di riferimento utilizzati, i metodi e le apparecchiature utilizzate, le condizioni ambientali e le condizioni degli oggetti da provare o da tarare, e l'operatore. ota Il comportamento previsto a lungo termine dell'oggetto sottoposto a prova e/o taratura non è, di regola, preso in considerazione quando si stima l'incertezza di misura. ota 3 Per ulteriori informazioni vedere ISO 575 e la Guida all'espressione dell'incertezza di misura (vedere bibliografia). 70

71 (dalla UI CEI E ISO/IEC 1705) Rapporti di prova In aggiunta a quanto indicato in 5.10., i rapporti di prova devono includere, se necessario per l'interpretazione dei risultati, quanto segue: c) quando applicabile, una dichiarazione circa l'incertezza di misura stimata; informazioni circa l'incertezza sono necessarie nel rapporto di prova quando ciò influisce sulla validità o sull'applicazione dei risultati di prova, quando le istruzioni dei cliente lo richiedono, o quando l'incertezza ha influenza sulla conformità con un limite specificato; 71

72 Dai primi anni 80 sono stati proposti numerosi modelli per la stima dell incertezza di misurazione. Un primo modello, proposto da Wernimont [1], prevedeva la valutazione dell UOM per mezzo delle stime di precisione eseguite in prove di confronto interlaboratorio (method-performance inter- laboratory studies). Successivamente, ISO ha proposto un modello completamente differente, noto come bottom-up (o o error-budget, o component-by by- component ), basato sui principi di propagazione degli errori. Le linee guida del modello sono descritte nella Guide to the expression of uncertainty in measurement [], (nota come GUM). Il modello bottom-up è stato poi adottato da EURACHEM [3]. 1. G.T. Wernimont, Use of statistics to develop and evaluate analytical methods, AOAC, Arlington, VA, 1. G.T. Wernimont, Use of statistics to develop and evaluate analytical methods, AOAC, Arlington, VA, (1985) (1985). ISO, Guide to the expression of uncertainty in measurement, Geneva (1993). ISO, Guide to the expression of uncertainty in measurement, Geneva (1993) 3. EURACHEM, Quantifying uncertainty in analytical measurement, 1st Ed. (1995) 3. EURACHEM, Quantifying uncertainty in analytical measurement, 1st Ed. (1995) 7

73 In seguito alle perplessità avanzate da numerosi operatori, l Analytical Methods Committee (AMC) della Royal Society of Chemistry (RSC) ha proposto un modello [4], noto come top-down, basato su quello di Wernimont. Due anni dopo MKL (ordisk Metodik Komité for Levnedsmidler), giudicando il modello bottom-up più adatto a misurazioni fisiche che a misurazioni chimiche, ha sviluppato un modello alternativo più semplice e, allo stesso tempo, utile alla stima dell incertezza complessiva connessa con l intera procedura analitica totale [5]. Almeno in linea di principio, la norma UI CEI E ISO/IEC 1705 ha adottato il modello bottom-up, riferendosi esplicitamente alla GUM nelle sue linee guida. 4. Analytical Methods Committee, Uncertainty of Measurement: Implications of Its Use in Analytical 4. Analytical Methods Committee, Uncertainty of Measurement: Implications of Its Use in Analytical Science, Analyst, 19 (1995) 303 Science, Analyst, 19 (1995) MKL Procedure. 5, Estimation and expression of measurement uncertainty in chemical analysis, 5. MKL Procedure. 5, Estimation and expression of measurement uncertainty in chemical analysis, MKL (1997) MKL (1997) 73

74 Successivamente, la seconda edizione della Guida EURACHEM [6] e la IUPAC [7] hanno proposto, per la stima dell incertezza di misurazione, di usare anche i dati acquisiti nel corso di studi di validazione (modello bottom-up integrato). Infine, Barwick ed Ellison [8] hanno predisposto un protocollo per utilizzare i risultati degli studi di validazione nella stima dell incertezza di misura. In pratica l approccio, sempre del tipo bottom-up integrato, descrive come i dati ottenuti nei test di robustezza permettano di valutare opportunamente tutte le sorgenti d incertezza non considerate dagli studi di esattezza e precisione. 6. EURACHEM, Quantifying 6. EURACHEM, Quantifying uncertainty uncertainty in in analytical measurement, nd Ed. (000) analytical measurement, nd Ed. (000) 7. Report on the FAO, 7. Report on the FAO, IAEA, IAEA, AOAC AOAC Int., Int., IUPAC IUPAC International International Workshop Workshop on on Principles Principles and and Practices Practices of of Method Validation, Budapest (1999) Method Validation, Budapest (1999) 8. V.J. Barwick, S.R.L. Ellison, VAM Project 3..1 Development 8. V.J. Barwick, S.R.L. Ellison, VAM Project 3..1 Development and and Harmonisation Harmonisation of of Measurement Measurement Uncertainty Principles. Part d. Protocol for uncertainty evaluation from validation data. Version 5.1 Uncertainty Principles. Part d. Protocol for uncertainty evaluation from validation data. Version 5.1 (000) (000) 74

75 ICERTEZZA DI MISURAZIOE La norma ISO 5, Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement (ISO, Geneva, 1993), definisce l incertezza di misurazione (UOM)* come un parametro, associato al risultato di una misurazione, che caratterizza la dispersione dei valori che possono essere ragionevolmente attribuiti al misurando qualora siano state considerate tutte le sorgenti d errore. Il risultato di una misurazione rappresenta la migliore stima del valore del misurando e l incertezza, valutata considerando tutte le sorgenti d errore, quantifica la qualità del risultato. Una misura non completata dalla sua incertezza non può essere confrontata né con altre misure né con valori di riferimento o con limiti legali o composizionali. * * Sebbene Sebbene Uncertainty Uncertainty of of measurement measurement debba debba essere essere correttamente correttamente tradotto tradotto in in Incertezza Incertezza di di misurazione, misurazione, è è frequente frequente l uso l uso di di Incertezza Incertezza di di misura. misura. 75

76 Procedura per la valutazione della ripetibilità: analizzare 10 () standard, o materiali di riferimento o bianchi fortificati indipendenti a diversi livelli di concentrazione entro il range dinamico (stesso operatore, strumento, laboratorio; tempo limitato); determinare la deviazione standard e calcolare il limite di ripetibiltà: r = α, υ t 1 σ r dove t 1-α/,ν è la t di Student per il livello di fiducia desiderato e ν = (-1) gradi di libertà. In pratica, si accetta come possibile l uso di ν = e quindi, per 1-α = 0,95, si usa t 1-α/, = 1,96 ); σ r è la deviazione standard della ripetibilità. 76

77 L attuale coesistenza di diversi modelli per la valutazione dell incertezza di misurazione, e l aumento dei costi e tempi di analisi derivante dalla loro applicazione, hanno trasformato la stima dell incertezza di misurazione in uno dei maggiori problemi affrontati dai laboratori che vogliono introdurre un sistema di controllo qualità, o che hanno come obiettivo l accreditamento dei loro metodi di analisi. 77