GENOMICA E FAUNA ALPINA: UN NUOVO APPROCCIO DI INDAGINE E

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1 GENOMICA E FAUNA ALPINA: UN NUOVO APPROCCIO DI INDAGINE E MONITORAGGIO DELLA BIODIVERSITÀ VALDOSTANA RICERCATORE TEAM LEADER: DOTT.SSA VELCA BOTTI

2 IL PROGETTO Intende fornire nuovi strumenti di biologia molecolare per studiare, monitorare, tutelare e valorizzare la BIODIVERSITA ANIMALE che caratterizza i territori valdostani Ricchezza Benessere degli ecosistemi

3 BIODIVERSITÀ E PANORAMA * Convenzione sulla Diversità Biologica (CBD) LEGISLATIVO * Convenzione sulle Specie Migratrici appartenenti alla fauna selvatica (CMS - Convenzione di Bonn) * Convenzione sul commercio internazionale delle specie di fauna e flora selvatiche minacciate di estinzione (CITES - Convenzione di Washington) * Convenzione per la Conservazione della vita selvatica e dell ambiente naturale in Europa (Convenzione di Berna) * Convenzione sulle zone umide di importanza internazionale (Convenzione di Ramsar) * Protocollo relativo alle Aree Specialmente Protette e la Biodiversità in Mediterraneo (Protocollo ASP) * Convenzione per la protezione del mar Mediterraneo (Convenzione di Barcellona) * Accordo internazionale Santuario Pelagos * Trattato Internazionale sulle Risorse fitogenetiche per l'alimentazione e l'agricoltura

4 OBIETTIVI DEL PROGETTO Studio della biodiversità della classe Insecta e attraverso l utilizzo della tecnica del DNA BARCODING (Odonata, Orthoptera, Lepidoptera) Messa a punto di tecniche di DNA FINGERPRINTING per lo studio dell ecologia di Circaetus gallicus (biancone) Sviluppo di protocolli per l identificazione specifica di vertebrati (per la LOTTA AL BRACCONAGGIO a partire da porzione carnee e per il MONITORAGGIO della fauna selvatica locale a partire da tracce biologiche) DNA BARCODING Allestimento una banca del DNA della fauna valdostana che possa essere sfruttata per progetti di ricerca futuri

5 IL DNA BARCODING PER INSECTA E VERTEBRATI DNA a supporto dell identificazione delle specie analisi gene mitocondriale CITOCROMO C OSSIDASI I (COI o cox1) BARCODE FAUNA 650 pb circa del COI vantaggi: buona variabilità interspecifica, bassa variabilità intraspecifica, assenza di introni, limitata esposizione ad eventi di ricombinazione, disponibilità di siti di annealing per primer robusti e universali (Folmer et al. 1994) estrazione DNA sequenziamento (cycle sequencing) elaborazione e correzione dei dati grezzi di sequenza amplificazione DNA (PCR) elettroforesi capillare

6 IL DNA FINGERPRINTING PER IL BIANCONE per valutare la fedeltà dei SINGOLI INDIVIDUI ai siti riproduttivi valdostani primo utilizzo negli anni 80, diffusasi rapidamente per l identificazione di soggetti sospettati di gravi reati tra cui l omicidio Adulto e piccolo al nido Archivio fotografico PNMA per l identificazione individuale basata su sequenze ripetute di basi che variano da individuo a individuo A. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) più comune A. B. ANALISI MICROSATELLITI o STR (Short Tandem Repeat) più recente ricerca di circa 13 loci microsatelliti B.

7 LO STATO ATTUALE DEL PROGETTO

8 LABORATORIO OPERATIVO Un laboratorio operativo costa tempo, denaro e fatica Sistema di qualità OK Reagenti e consumabili OK Strumentazione OK

9 CAMPIONAMENTI E I CAMPIONATORI SELEZIONE LUOGHI DI CAMPIONAMENTO SPECIE DA INDAGARE MODALITÀ DI CAMPIONAMENTO (a secco, buste e contenitori monouso, lontano da fonti di calore) MODALITÀ DI REGISTRAZIONE DEL CAMPIONE SUL CAMPO E IN LABORATORIO MODALITÀ DI CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE (-20 C) CAMPIONATORI Dott. Baroni Daniele Dott. Bocca Massimo Dott.ssa Bosio Gianna Dott.ssa Christille Claretta Dott. Marguerettaz Fabio Dott. Salomon CRAS Oasi di Sant Alessio (PV)

10 ANALISI MOLECOLARI: ESTRAZIONE DEL DNA CAMPIONE DI PARTENZA PROCEDURA OPERATIVA STANDARD N POS Insetti Tessuti (pelo, porzioni carnee) Sangue e fluidi corporei ESTRAZIONE DEL DNA DA INSETTI, ARTROPODI, ASCARIDI E VERMI PIATTI ESTRAZIONE DEL DNA DA TESSUTI ANIMALI ESTRAZIONE DEL DNA SANGUE E FLUIDI CORPOREI POS FA 06 POS FA 05 POS FA 09 Depositi fecali ESTRAZIONE DEL DNA DA DEPOSITI FECALI POS FA 07 Penne, piume e gusci d uovo Matrici animali ESTRAZIONE DEL DNA DA PENNE, PIUME E GUSCI D UOVO ESTRAZIONE VELOCE DEL DNA DA CAMPIONI DI ORIGINE ANIMALE POS FA 08 POS FA 02 step critico nel workflow sperimentale del sequenziamento del DNA!

11 ANALISI MOLECOLARI: ITER

12 ANALISI MOLECOLARI: ITER

13 GLI ODONATI BIOINDICATORI gestione ambientale e valutazione dei cambiamenti a breve e lungo termine 129 CAMPIONI ADULTI ESUVIE LARVE 32 SPECIE (43 segnalate) 74% BIODIVERSITA VALDOSTANA per ogni specie: 3 esemplari, luoghi diversi

14 GLI ODONATI ANISOTTERO ZIGOTTERI ESUVIA Archivio fotografico MRSN- Foto Botti Velca

15 GLI ODONATI Luoghi del campionamento AREE TUTELATE E AREE UMIDE DELLA VALLE D AOSTA

16 GLI ODONATI Archivio fotografico MRSN- Foto Marguerettaz Fabio Orthetrum coerulescens

17 GLI ODONATI ESTRAZIONI DEL DNA REAZIONI DI AMPLIFICAZIONI DEL TARGET COI CON SUCCESSO (+ quantificazione dopo gel di agarosio con GelAnalyzer software) REAZIONI DI PURIFICAZIONE DELL AMPLICONE REAZIONI DI CYCLE SEQUENCING E PURIFICAZIONE DEL PRODOTTO DI CYCLE SEQUENCING SEQUENZE OTTENUTE (FORWARD E REVERSE)!!! ELABORAZIONE E ANALISI DELLE SEQUENZE

18 GLI ODONATI!!! ELABORAZIONE E ANALISI DELLE SEQUENZE.ab1.SEQ Sequencing analysis software 6 BioEdit software FASTA BLASTn BOLD Systems

19 GLI ODONATI SPECIE di ODONATA FAMIGLIA LUOGO DEL CAMPIONAMENTO Aeshna cyanea Aeshnidae Pollein, La Thuile (Colle S. Carlo), Lago di Villa Aeshna grandis Aeshnidae Lago di Loz Aeshna mixta Aeshnidae Les Iles, Quart (stagno vicino a casello autostradale) Aeshna juncea Aeshnidae Riserva Naturale del Marais, Meyes, Parco Mont Avic Anax imperator Aeshnidae Lago di Villa, Aosta (giardinetti Champ- Bartelet) Chalcolestes viridis Lestidae Les Iles Coenagrion hastulatum Coenagrionidae Petosan (La Thuile) Coenagrion puella Coenagrionidae Lago di Villa, Lolair, Bionaz Coenagrion pulchellum Coenagrionidae Lago di Lot, Lolair Cordulegaster bidentata Cordulegastridae Pont Saint Martin, Hône Cordulia aenea Corduliidae Lago di Villa Crocothemis erythraea Libellulidae Lago di Villa, Les Iles Enallagma cyathigerum Coenagrionidae Les Iles, Lago di Lolair Erythromma viridulum Libellulidae Les Iles Ischnura elegans Coenagrionidae Lago di Lot, Lago di Villa e Les Iles Ischnura pumilio Coenagrionidae Les Iles, Lago di Lot, Aosta (giardinetti Champ- Bartelet), Quart (stagno vicino a casello autostradale)

20 GLI ODONATI SPECIE di ODONATA FAMIGLIA LUOGO DEL CAMPIONAMENTO Lestes sponsa Lestidae Lago di Loz, Champlong (Verrayes) Lestes virens Lestidae Riserva naturale del Marais Leucorrhinia dubia Libellulidae Riserva Mont Mars (Lac le long), Parco Mont Avic Libellula depressa Libellulidae Lago di Villa Libellula quadrimaculata Libellulidae Lago di Villa, Stagno di Holay Orthetrum albistylum Libellulidae Les Iles Orthetrum cancellatum Libellulidae Les Iles Orthetrum coerulescens Libellulidae Lago di Villa Platycnemis pennipes Platycnemididae Lago di Villa, Les Iles Somatochlora alpestris Cordulidae Riserva Mont Mars (Lac le long), Comba Thuilette Somatochlora arctica Cordulidae Talweg Val Ferret Sympetrum danae Libellulidae Meyes, Talweg Val Ferret, Riserva naturale del Marais, Champlong (Verrayes) Sympetrum depressiusculum Libellulidae Les Iles, Quart (stagno vicino a casello autostradale) Sympetrum flaveolum Libellulidae Lago di Loz, Champlong (Verrayes) Sympetrum sanguineum Libellulidae Lago di Loz, Riserva naturale del Marais, Teppe Sympetrum striolatum Libellulidae Lago di Villa

21 GLI ODONATI IL DNA BARCODING riconosce direttamente su BOLD Systems 21/26 specie, 4 su 26 sono in corso di valutazione ESUVIE NEGATIVE AL SEQUENZIAMENTO: DNA rilasciato dalla libellula durante lo sfarfallamento è insufficiente per essere rilevato al sequenziamento Platycnemis pennipes dà aspecifici all amplificazione del BARCODE: mutazioni nel sito di appaiamento dei primer BARCODE COI (Folmer et al. 1994)

22 IL BIANCONE (CIRCAETUS GALLICUS) VULNERABILE (VU) Lista Rossa IUCN N individui maturi < a 1000 (Brichetti & Fracasso 2003, Petretti 2008) minacciato da uccisioni illegali, declino delle popolazioni di rettili di cui si ciba e dalla sottrazione degli ambienti utili alla caccia 3 sangue intero 1 resti di borra 130 campioni 119 penne 6 Sterco 1 frammento d uovo

23 IL BIANCONE (CIRCAETUS GALLICUS) ANNO N e TIPOLOGIA CAMPIONE SITI DI PROVENIENZA penne, 1 frammento d uovo, 4 sterco, 1 resti di borra Issogne Nord, Jovencan, Morgex, Fénis, Pontey, Chambave, Saint Vincent penne + 2 sterco Issogne, Jovencan, Arvier, Pollein, Saint-Vincent, Donnas penna Issogne penna Issogne penne Issogne penne Issogne

24 IL BIANCONE (CIRCAETUS GALLICUS) PRELIEVO SANGUE INTERO SANGUE INTERO DNA BIANCONE Archivio fotografico MRSN- Foto Botti Velca Analisi Next Generation Sequencing - individuazione nel biancone di loci microsatelliti - sviluppo di un protocollo per l identificazione individuale CRAS Oasi Sant Alessio (PV) Gel di agarosio 1%, marker GeneRuler 1Kb, corsa 1 h, 120V)

25 GLI ORTOTTERI poco studiati dal punto di vista genetico e poco «barcodati» problemi di classificazione: molteplici caratteristiche morfologiche numerose sottodistinzioni es. genere Glyptobothrus ha come unici caratteri diagnostici il lobo e le carene del pronoto (angolose) pertanto una determinazione genetica può risultare fondamentale. 113 CAMPIONI ADULTI 38 SPECIE (73 segnalate) Archivio fotografico MRSN- Foto Baroni Daniele 52% BIODIVERSITA VALDOSTANA

26 GLI ORTOTTERI Archivio fotografico MRSN- Foto Baroni Daniele Archivio fotografico MRSN- Foto Baroni Daniele

27 I LEPIDOTTERI Collezione museale con specie non diagnosticate o dubbie 52 CAMPIONI Archivio fotografico MRSN ADULTI 2 ZAMPE COLLEZIONE MUSEO 2013 Archivio fotografico MRSN

28 I LEPIDOTTERI Esemplari dalla difficoltosa diagnosi morfologica FAMIGLIA GENERE INDICAZIONI PER IL DNA BARCODING Hesperiidae Carcharodus da confermare esemplari diagnosticati come Carcharodus alceaee e altri a cui non è stata attribuita la specie Hesperiidae Pyrgus da confermare esemplari a cui non è stata attribuita la specie Hesperiidae Thymelicus da confermare esemplari a cui non è stata attribuita la specie Lycaenidae Polyommatus da confermare esemplari diagnosticati come Polyommatus bellargus, come Polyommatus daphnis, Polyommatus icarus e altri a cui non è stata attribuita la specie Nymphalidae Coenonympha da confermare esemplari diagnosticati come Coenonympha arcania Nymphalidae Hipparchia da confermare Hipparchia fagi Pieridae Colias da confermare esemplari diagnosticati come Colias alfacariensis e come Colias hyales Pieridae Leptidea da confermare Leptidea sinapsis o reali Pieridae Pieris da confermare esemplari diagnosticati come Pieris (Pontia) edusa, Pieris manni, Pieris rapae, Pyeris alphacariensis, Pyeris bryoniae, Pyeris napi

29 VERTEBRATI DI INTERESSE REGIONALE Durante l autunno 2014 la struttura FLORA, FAUNA, CACCIA E PESCA del DIPARTIMENTO RISORSE NATURALI E CORPO FORESTALE (Assessorato Agricoltura e Risorse Naturali) fornirà porzioni carnee per la validazione del DNA barcoding sulle seguenti specie: Capra ibex Rupicapra rupicapra Cervus elaphus Lepus timidus

30 GRAZIE PER L ATTENZIONE!