Sviluppo e validazione di un metodo multiresiduo per la determinazione dei pesticidi negli alimenti di origine animale destinati all infanzia
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- Benedetto Castellani
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1 Sviluppo e validazione di un metodo multiresiduo per la determinazione dei pesticidi negli alimenti di origine animale destinati all infanzia Graziella Amendola ISS graziella.amendola@iss.it IX Convegno Attività dell Amministrazione Pubblica in materia di controllo dei Residui di Fitofarmaci negli alimenti - 17 Novembre
2 Perché sviluppare questo metodo: Ottimizzare un metodo già disponibile in reparto Ottenere l accreditamento del metodo (attività del NRL-AO) Programma Comunitario di Controllo 2
3 Reg. 396/2005 Articolo 29 Programma comunitario di controllo 1. La Commissione elabora un programma comunitario coordinato di controllo pluriennale che specifica i campioni da inserire nei programmi nazionali di controllo e tiene conto dei problemi riscontrati in relazione all'osservanza degli LMR stabiliti nel presente regolamento, allo scopo di valutare l'esposizione dei consumatori e l'applicazione dell'attuale legislazione. 2. Il programma comunitario di controllo è adottato e aggiornato ogni anno secondo la procedura di cui all'articolo 45, paragrafo 2. Il progetto di programma comunitario di controllo è presentato al comitato di cui all'articolo 45, paragrafo 1, almeno sei mesi prima della fine di ogni anno civile. 3
4 COMMISSION REGULATION (EU) No 915/2010 of 12 October 2010 concerning a coordinated multiannual control programme of the Union for 2011, 2012 and 2013 to ensure compliance with maximum levels of and to assess the consumer exposure to pesticide residues in and on food of plant and animal origin Allegato I: Tabella in cui sono riportate le combinazioni tra principi attivi e matrice che devono essere analizzati Allegato II: Numero di campioni relativi alle combinazioni riportate nella tabella 1 e il numero di campioni di alimenti per l infanzia, che ciascun Paese Membro deve analizzare. In dettaglio sono richieste le analisi su: 2012: 10 campioni di alimenti a base di cereali 2013: 10 campioni sugli alimenti per lattanti e per bambini 2014: 10 campioni sugli alimenti per lattanti e sugli alimenti di proseguimento L aggiornamento del Programma Comunitario per l anno in corso non è stato ancora ufficialmente pubblicato, ma esiste già un draft: SANCO/11278/2011 nel quale vengono riconfermati il numero e la tipologia dei campioni che devono essere analizzati per quanto concerne gli alimenti destinati all infanzia. In particolare, in questo aggiornamento la tabella 1 dell Allegato I è stata divisa in due parti, la parte A riguarda i prodotti di origine vegetale, la parte B i prodotti di origine animale. Nella parte B sono stati introdotti altri p.a. he possono essere analizzati su base volontaria a partire dal
5 PERCHE L INFANZIA VULNERABILITA GENERALE ELEVATO RAPPORTO QUANTITA DI CIBO INGERITA/ PESO CORPOREO DIETA POCO DIVERSIFICATA IMMATURITA DEI SISTEMI METABOLICI SUSCETTIBILITA SPECIFICA MATURAZIONE DI ORGANI E SISTEMI : NERVOSO, IMMUNITARIO, ENDOCRINO, RIPRODUTTIVO 5
6 NORMATIVA SUI FITOFARMACI IN ALIMENTI DESTINATI ALL INFANZIA DIRETTIVE COMUNITARIE DIR. 2006/141/CE ALIMENTI PER LATTANTI E ALIMENTI DI PROSEGUIMENTO Art.10 e Allegati VIII e IX DIR. 2006/125/CE ALIMENTI A BASE DI CEREALI E ALTRI ALIMENTI DESTINATI AI BAMBINI Art.7 e Allegati VI e VII...GLI ALIMENTI DESTINATI ALL INFANZIA NON DEVONO CONTENERE RESIDUI DI SINGOLI ANTIPARASSITARI SUPERIORI A 0.01 mg/kg... Eccezione per alcuni pesticidi MRLs mg/kg 6
7 ALLEGATO VI QUANTITÀ MASSIME SPECIFICHE DEI RESIDUI DI ANTIPARASSITARI O DEI METABOLITI DI ANTIPARASSITARI NEGLI ALIMENTI A BASE DI CEREALI E NEGLI ALTRI ALIMENTI DESTINATI AI LATTANTI Denominazione chimica della sostanza (definizione del residuo) Quantità massime dei residui (mg/kg) Cadusafos 0,006 Demeton-S-metile/demeton-S-metile-solfone/oxidemeton-metile (isolatamente o assieme, espressi in demeton-smetile) 0,006 Etoprofos 0,008 Fipronil (somma di fipronil e fipronil-desulfinyl, espressa in fipronil) 0,004 Propineb/propilentiourea (somma di propineb e propilentiourea) 0,006 ALLEGATO VII ANTIPARASSITARI CHE NON DEVONO ESSERE UTILIZZATI IN PRODOTTI AGRICOLI DESTINATI ALLA PRODUZIONE DI ALIMENTI A BASE DI CEREALI E DEGLI ALTRI ALIMENTI PER LATTANTI Tabella 1 Denominazione chimica della sostanza (definizione del residuo) Disulfoton (somma di disulfoton, solfossido di disulfoton e solfone di disulfoton, espressa in disulfoton) Fensulfothion (somma di fensulfothion, del suo analogo d'ossigeno e dei loro solfoni, espressa in fensulfothion) Fentin, espresso in cationi di trifenilstagno Alossifop (somma di alossifop, dei suoi sali ed esteri, compresi i composti, espressa in alossifop) Eptacloro e trans-eptacloro epossido, espressi in eptacloro Esaclorobenzene Nitrofen Ometoato Terbufos (somma di terbufos, del suo solfosside e solfone, espressa in terbufos) Tabella 2 Denominazione chimica della sostanza (definizione del residuo) Aldrin e dieldrin, espressi in dieldrin Endrin 7
8 Attività svolte dal Reparto inerenti gli alimenti destinati all infanzia : Convenzione progetto 1% Valutazione dell assunzione di residui di pesticidi tramite la dieta, indagini analitiche sui livelli di residui di pesticidi in alimenti per bambini : Piani triennali per la sorveglianza sanitaria dei fitofarmaci (Art. 17, comma 4, del D.L.vo n. 194/95) 2005: Controllo alimenti per l infanzia nell ambito del procedimento N 9013/04 della Procura della Repubblica Sviluppo metodi prodotti di origine vegetale: 88 composti OC/PYR/OP/NMC prodotti di origine animale: 50 composti OC/OP/PYR 8
9 Alimenti di origine animale: confronto metodo vecchio con metodo nuovo Metodo vecchio Campione Metodo nuovo Campione Estrazione 1 ean up Estrazione 1 ean up 2 ean up OP GC-FPD OC/PYR GC-2xECD OP/PYR/OC GC-MS/MS 9
10 Metodo vecchio Metodo nuovo Estrazione 25 g campione ml Esano/Acetone 1:1 2 min UltraTurrex Centrifuga 15 min Si ripete l estrazione con 2 aliquote da 50 ml di esano (altri 2 steps di centrifugazione da 15 min ciascuno) Gli estratti si disidratano su colonna sodio solfato anidro (25 g) e lavaggio con 15 ml esano Evaporazione dell estratto fino a secchezza Estrazione 5 g di campione + 35 ml di acetonitrile 2 min UltaTurrex + 5 g Solfato di Magnesio anidro Filtrazione sotto vuoto su Bukner, con lavaggio del filtrato con 15 ml acetonitrile Evaporazione a circa 1 ml ean up Tempo = 1h/campione Sale = 25g Solvente = 215ml ean up Tempo = 15min/campione Sale = 5g Solvente = 50ml 10
11 COMPOSIZIONE DEGLI OMOGENEIZZATI DI ORIGINE ANIMALE CARNE, PESCE, FORMAGGIO Acqua = 60% Proteine 3-12% Carboidrati 4-9% Grassi % 40% Metodo vecchio Metodo nuovo E S T R A Z I O N E In 25 g di campione Grassi: g Acqua: 15 g Esano/Acetone estratto: Residuo grasso: g Elevate tracce di acqua In 5 g di campione Grassi: g Acqua: 5 g Acetonitrile estratto: Residuo grasso: 0.05g Scarse tracce di acqua 11
12 Metodo vecchio 1 ean up: Estratto in esano su cartuccia Extrelut NT3 30 min sotto soffio di azoto Cartuccia Extrelut 1 modificata contenente C 18 (0.36g) Eluizione con 20 ml acetonitrile (Grasso residuo: 5-15 mg) Analisi OP GC-FPD (GC-MS) (22 p.a.) 2 ean up: Florisil/miscele Suzuki Analisi OC/PYR GC-2xECD (GC-MS) (28 p.a.) ean up: Metodo nuovo Estratto in acetonitrile su cartuccia di C 18 (2g) Eluizione con 20 ml acetonitrile Analisi per tutte le classi di composti GC-MS/MS (QQQ) Agilent 7000 (65 p.a.) (Grasso residuo: 2-4 mg) (Grasso residuo: 5-12 mg) 12
13 GC-MS/MS Agilent 7000 (QQQ). GC- MS/MS: Iniettore Programmed Temperature Vaporizer (PTV) modalità solvent vent Colonna HP 5MS (450 C, 30m x 250 m x 0.25 m); temperatura del forno: C Sistema backflush (0.8m x 180 m x 0 m) MS-MS: triplo quadrupolo (sorgente EI, temp. 280 C) Determinazione in Multiple Reaction Monitoring MRM (alta selettività) Software Muss Hunter 13
14 PTV: modalità solvent vent permette l iniezione in acetonitrile, non c è bisogno di cambiare il solvente. Volume di iniezione: da 2 a 5 L, consente di analizzare concentrazioni molto basse dei composti, come ad esempio richiesto dalla normativa per gli alimenti destinati all infanzia (MRL=0.003 mg/kg) Sistema Backflush: lavaggio della colonna capillare in controcorrente. Determina molti vantaggi: Aumenta la vita della colonna capillare, riducendo il tempo di esposizione ad alte temperature (bake out) riduce il run time Riduce la frequenza della manutenzione della sorgente, poiché previene il deposito di componenti alto bollenti sulla sorgente 14
15 GC-MS/MS: Triplo quadrupolo Ionizzazione del campione nella sorgente inerte: si forma lo ione precursore 1 quadrupolo: isolamento dello ione precursore cella di collisione: ione precursore viene dissociato con azoto, si generano gli ioni figli 2 quadrupolo: gli ioni figli vengono separati dagli interferenti di matrice analizzati in un rivelatore a triplo asse Multiple Reaction Monitoring MRM: La funzione MRM permette di analizzare matrici difficili a bassi limiti di determinazione Velocità di acquisizione fino a 500 transizioni MRM al secondo consente di quantificare e confermare in modo automatico molti composti in un singolo metodo Con una corsa di 42 min sono stati analizzati 65 p.a appartenenti a differenti classe di composti Si può aumentare in numero di composti fino a circa 200 Muss Hunter: un software più sofisticato che permette una rapida elaborazione dei dati, che si traduce in minori possibilità di errore e in un risparmio notevole di tempo. 15
16 Quali pesticidi sono stati considerati: Composti di interesse per le matrici di origine animale: organofosforati, organoclorurati, piretroidi (lista EURL-PT-AO) Composti con valori specifici di MRL indicati in normativa Composti nuovi inseriti nel piano triennale In totale sono stati studiati e validati 65 principi attivi 16
17 1) Aldrin 2) Bifenthrin 3) Boscalid 4) Cadusafos 5) Chlordane cis 6) Chlordane trans 22) Diclorvos 23) Dieldrin 24) Disulfoton 25) Disulfoton sulfone 26) Endosulfan (alpha isomer) 43) Lindane 44) Malathion 45) Metacrifos 46) Methoxychlor 47) Methyl parathion 48) Nitrofen 7) Chlorfenvinphos 27) Endosulfan (beta isomer) 49) Oxychlordane 8) Chlorobenzilate 9) Chlorpyrifos 10) Chlorpyrifos-methyl 11) Cyfluthrin 12) Cyhalothrin lambda 13) Cypermethrin 14) DDD o,p' 15) DDD p,p' 16) DDE o,p' 17) DDE p,p' 18) Deltamethrin 19) Demeton-S-methyl 20) Demeton-S-methylsulfon(oxy) 21) Diazinon 28) Endosulfan sulfate 29) Endrin 30) Ethion 31) Ethoprophos 32) Fenamiphos 33) Fenitrothion 34) Fenthion 35) Fenvalerate 36) Fipronil 37) Fluvalinate-tau 38) HCH (alpha isomer) 39) Heptachlor 40) Heptachlor Epoxide cis 41) Heptachlor Epoxide trans 42) Hexachlorobenzene 50) Parathion 51) Pendimethalin 52) Permethrin 53) Pirimiphos-methyl 54) Profenofos 55) Pyrazophos 56) Quinalphos 57) Quintozene 58) Resmethrin 59) Tecnazene 60) Terbufos 61) terbufos sulfone 62) Tolclofos-methyl 63) Triazophos 64) Trifluralin 65) Vinclozolin 17
18 GC-MS/MS: ALTA SELETTIVITA BIANCO CARNE BIANCO PESCE BIANCO FORMAGGIO Standard in matrice (65 composti) 18
19 ALTA SENSIBILITA TERBUFOS e TERBUFOS SULFONE Transizioni Terbufos: Quantifier Qualifier Spiking level: 0.003mg/Kg (LOQ=MRL) Rec.= 106% RSD=3% Transizioni Terbufos sulfone: Quantifier Qualifier Spiking level: 0.003mg/Kg (LOQ=MRL) Rec.= 82% RSD=9% 19
20 Dir. 2006/125/CE DEFINIZIONE DEL MRL: TERBUFOS = (Somma di Terbufos, del suo sulfosside e del suo sulfone, espressi come Terbufos) DEMETON-S-METILE, DEMETON-S-METILE SULFONE, DEMETON-S- METILE SULFOSSIDE (isolatamente o assieme, espresi in Demeton-S- Metile) DISULFOTON = (Somma di Disulfoton, del suo sulfosside e del suo sulfone, espressi come disulfoton) SULFOSSIDI non sono analizzabili in GC-MS/MS, ma possono essere analizzati in LC-MS/MS. Questa parte di lavoro rientra nei nostri obiettivi futuri 20
21 OSSICLORDANO (a) O cis-heptacloro EPOSSIDO (b)? 100 (a) O (mainlib) 2,5-Methano-2H-indeno[1,2-b]oxirene, 2,3,4,5,6,6a,7,7-octachloro-1a,1b,5,5a,6,6a-hexahydro-, (1aα,1bβ,2α,5α,5aβ,6β,6aα) (b) O (mainlib) Heptachlor epoxide
22 OSSICLORDANO (a) O cis-eptacloro EPOSSIDO (b)? Cis-Eptacloro Epossido (b) Ossiclordano (a) Transizioni OSSICLORDANO: Quantifier Qualifier Transizioni EPTACLORO EPOSSIDO: Quantifier Qualifier Quantifier E.c= 15 22
23 VALIDAZIONE METODO SANCO 10684/2009 MATRICI RAPPRESENTATIVE: OMOGENEIZZATI DI CARNE, FORMAGGINO E PESCE PROVE DI RECUPERO: CAMPIONI BIANCHI ADDIZIONATI 2 LIVELLI DI SPIKING: basso= LOQ; alto= 10XLOQ RIPETIZIONI: n= 5 PER OGNI LIVELLO E PER TUTTI I COMPOSTI STUDIATI DETERMINAZIONE DEL LOQ DETERMINAZIONE DELLA LINEARITA RISULTATI DELLA VALIDAZIONE: RIENTRANO NEI CRITERI DI ACETTABILITA INDICATI NELLA SANCO 10684/
24 GRAZIE PER L ATTENZIONE 24
Descrizione della Prova: Pesticidi negli Alimenti di Origine Animale mediante GC-MS/MS
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