3. LNR-SRM - Laboratorio Nazionale di Riferimento per i residui dei pesticidi da analizzare mediante metodiche monoresiduo

Transcript

1 CONTAMINANTI CHIMICI IN MATRICI ALIMENTARI: routine, ricerca e innovazione ARPAL - Genova, 11 dicembre 2015

2 ISTITUTO SUPERIORE DI SANITÀ - Dipartimento di Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria, reparto Antiparassitari 1. LNR-AO: Laboratorio Nazionale di Riferimento per i residui dei pesticidi nei prodotti alimentari di origine animale ed alimenti con un alto contenuto di grassi 2. LNR-FV - Laboratorio Nazionale di Riferimento per i residui dei pesticidi in prodotti ortofrutticaoli, compresi alimenti con alto contenuto di acqua e acido 3. LNR-SRM - Laboratorio Nazionale di Riferimento per i residui dei pesticidi da analizzare mediante metodiche monoresiduo ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE PLV S.S. Lab. Chimico Liguria 1. LNR-CF - Laboratorio Nazionale di Riferimento per i residui dei pesticidi sui cereali e mangimi Punti di contatto: dott.ssa Barbara Vivaldi e dott. Enrico Alesso

3 Collaborazione con il Laboratorio di Riferimento dell Unione Europea per i residui di antiparassitari di settore (EURL-CF) Assistenza scientifica e tecnica all autorità competente Workshop di settore con i laboratori ufficiali Test comparativi (Proficiency Tests) Proficiency Tests Europei (EUPTs) Proficiency Tests Nazionali

4 1. Collaborazione con EURL-SRM (2014): aggiornamento Data Base dei Laboratori Ufficiali Europei DataPool (NEW) 2. Revisione documento SANCO AQC (SANCO/12571/2013) 3. «Joint EURL/NRL Workshop 2015» 30 Settembre 2 Ottobre 2015, Stoccarda (Germania)

5 DataPool: Vari database per scambio di informazioni tra laboratori ufficiali europei Aggiornamento 2014 EURL-DataPool (NEW) «Scheda Info-Lab» in collaborazione con ISS Data Base: informazioni varie laboratori ufficiali europei Scopo dei Lab Contatti

6 Compound data Compounds Compound Information List of Physicochemical Data Stability of Compounds Method Validation Data Regulatory MRL Residue Definitions MACP My Lab Contact Data EUPTs My Method Validation Data Estimation of Measurement Uncertainty MyNRL Network - EURL Network Reference Labs Tutorials

7 Guide ed informazioni pratiche «Template for data submission» - Validazione Stabilità di composti Presentazioni su argomenti specifici (eg. incertezza di misura)

8 Autunno 2014 Selezione di argomenti da modificare - EURLs/LNRs di settore (settembre 2014) Analytical Quality Control Panel (Advisory Group) Proposte su argomenti: Laboratori Nazionali di Riferimento + Laboratori Ufficiali dei Paesi Membri AG (working groups) proposte di modifiche al documento Draft del documento SANCO AQC commenti all interno dei MS Autunno 2015 Discussione del draft finale del documento SANCO AQC a «Joint EURL/NRL Workshop 2015» - votazione di consenso del draft del documento revisionato Draft del documento revisionato votato viene sottoposto al «Standing Committee on Plants, Animals Food and Feed (PAFF pesticide residues section)» Gennaio 2016 Pubblicazione del nuovo documento SANTE AQC revisionato disponibile sul portale unico EURLs e sul portale UE

9 Sezione D - Identification of analytes and confirmation of results D2 - Tolleranza del T r tra analita nel campione e nello standard di analisi: ± 0.1 min (invece di ± 0.2 min). Valore ± 0.1 min già proposto nella revisione del Cambiamento contestato ma a maggioranza sostenuto dai MS. D3 - Identificazione sulla base di spettri di libreria (nuovo paragrafo). D9, D10 e Tabella 4 - Le informazioni della ex Tabella 4 e 5 confluiranno in un unica Tabella 4. Ion ratio è fissato per tutte le tecniche analitiche al ± 30%. Nel paragrafo D10 sono contemplate possibili eccezione sostenute da evidenze sperimentali. Sezione E - Reporting results E5 - Specificato il caso di espressione del risultato usando 2 sole repliche (the relative difference of the individual results shall not exceed 30 % of the mean). Sezione F - Pesticide standards, stock solutions and calibration standard solutions F9-F10 e Annex xx - variazione delle sezioni relative alla stabilità degli standards analitici (Testing and replacement of standards)

10 Annex A Commodity groups and representative commodities Introdotta un tabella per i mangimi con una suddivisione in commodity groups differenti in funzione della loro diversa composizione. Come per gli alimenti destinati al consumo umano individuazione di 10 commodity groups. La categoria maggiormente rappresentata è quella dei mangimi ad elevato contenuto di amido e/o proteine e basso contenuto di acqua e grasso. Rientrano infatti i mangimi a base cerealicola, le granelle incluse quelle di legumi fieno e paglia. AIUTO NELLA FASE DI VALIDAZIONE DEL METODO

11 Programmazione EUPTs 2016

12 Annuncio invito e target pesticides list: dicembre 2015 Registrazione tramite piattaforma web EURL: apertura 11/01/2016 e chiusura 01/02/2016 Distribuzione del test material: 07/03/2016 Deadline per invio dei risultati: 11/04/2016 alle ore Report preliminare: entro il 30/05/2016 Report definitivo: entro dicembre 2016 Target pesticide list contiene 141 analiti di cui 7 da analizzare su base volontaria non rientrano nella classificazione dei laboratori in categoria A e B Si tratta di analiti importanti per il feed in relazione alla Dir. 2002/32/EC (isomeri e metaboliti del clordano, endrin, eptacloro e metaboliti epossidi.) 17 nuovi pesticidi sono stati introdotti rispetto al PT precedente: Acetamiprid, Aldrin, Biphenyl, Bromuconazole, Buprofezin, Chlorantraniliprole, Cymoxanil, Dieldrin, Famoxadone, Flutolanil, Methamidophos, Pencycuron, Propamocarb, tau-fluvalinate, Tefluthrin, Tetraconazole, Tetramethrin,

13 SITUAZIONE FINO AL 2015: ERANO IN CATEGORIA A TUTTI I LABORATORI CHE NON RINVENIVANO FALSI POSITIVI E CHE IDENTIFICAVANO CORRETTAMENTE ALMENO IL 90% DEGLI ANALITI PRESENTI NEL TEST MATERIAL NUOVA CATEGORIA A (EUPT 2016): NO FALSI POSITIVI NO FALSI NEGATIVI ANALIZZARE ALMENO IL 90% DEI PESTICIDI PRESENTI NELLA TARGET LIST IDENTIFICARE E QUANTIFICARE ALMENO IL 90% DEI PESTICIDI CONTENUTI NEL TEST MATERIAL

14 Studio iniziato nel 2014 Perché? Ampliare il numero di analiti ricercati tanto nelle materie prime cerealicole che nei mangimi da esse derivati

15 1) Macinare il campione in modo da ottenere una granulometria 1mm 2) Pesare 5 g di campione e aggiungere TPP (IS) e 10 ml di acqua fredda vortex 3) Aggiungere 10 ml di ACN agitare vigorosamente 4)Aggiungere la miscela di sali (tampone citrato) ed agitare centrifugare 5) Trasferire 8 ml in provetta da 15 ml e conservare a -80 C per 1 ora centrifugare 6) Trasferire 6 ml in d-spe tube contenente PSA, MgSO 4 e C 18 7) Centrifugare, prelevare 4 ml ed aggiungere 40 µl di ACN 5% HCOOH per stabilizzare ph 8) Diluire 1:1 con ACN, matrix-matching standard, filtrare attraverso filtri da 0,200 µm ed iniettare in HPLC-MS/MS. Cambiare solvente (isottano) per analisi GC!

16 HPLC: Thermo Accela 1250 Pump + Thermo Accela AS MS: Thermo TSQ Vantage Colonna: Thermo HYPERSIL C 18 50mm*2,1mm*1,9µm Precolonna: Agilent EC- C 18 5mm*2,1mm*2,7µm Temperatura colonna: 25 C Fasi mobili: A: H 2 O, 2mM ammonio formiato, 0,1% acido formico B: MeOH, 2mM ammonio formiato, 0,1% acido formico Flusso: 450 µl/min Run Time: 12 min Tempo (min) %A %B Flusso (µl/min) Acephate Azinphos-methyl Azoxystrobin Bixafen Boscalid Carbaryl Carbendazim Carbofuran Carbofuran-3-hydroxy Carboxin Chlorfenvinphos Clothianidin Cyproconazole Cyprodinil Demeton (O+S) Demeton-Smethylsulfone Demeton-Smethylsulfoxide Diazinon Dichlorvos Difenoconazole Diflubenzuron Dimethoate Epoxiconazole Ethion Fenbuconazole Fenhexamid Fenpropidin Fenpropimorph Fludioxonil Fluquinconazole Flusilazole Hexaconazole Imazalil Imidacloprid Isoprothiolane Isoproturon Linuron Malaoxon Methidathion Metconazole Methacrifos Methomyl Omethoate Phosalone Phosphamidon Pirimiphos-ethyl Pirimiphos-methyl Thiodicarb Triazophos Thiabendazole Paraoxon-methyl Monocrotophos Methamidophos Fenamiphos Fenamiphos-sulfone Fenamiphos-sulfoxide Profenofos Phosmet Fenthion-sulfone Fenthion-sulfoxide Desmedipham Oxamyl

17 HPLC: Thermo Accela 1250 Pump + Thermo Accela AS MS: Thermo TSQ Vantage Colonna: Thermo HYPERSIL C 18 50mm*2,1mm*1,9µm Precolonna: Agilent EC- C 18 5mm*2,1mm*2,7µm Temperatura colonna: 25 C Fasi mobili: A: H 2 O, 2mM ammonio formiato, 0,1% acido formico. B: MeOH, 2mM ammonio formiato, 0,1% acido formico.

18 1) Macinare il campione in modo da ottenere una granulometria 1mm 2) Pesare 5 g di campione e aggiungere TPP (IS) e 10 ml di acqua fredda vortex 3) Aggiungere 10 ml di EtoAC agitare vigorosamente 4) Sonicare per 30 minuti a T = 30 C 5) Aggiungere 10 g di Na 2 SO 4 6) Centrifugare a 3500 rpm per 10 minuti 7) Prelevare 1 ml cambiare solvente (90% H 2 O 10% MeOH), filtrare attraverso filtri in PTFE da 0,200 µm ed iniettare in HPLC-MS/MS. Per analisi GC: diluire 1:1 con isottano

19 Forma dei picchi migliorate soprattutto nella parte iniziale del cromatogramma

20

21

22 GC: Thermo TRACE Thermo AI 1310 MS: Thermo TSQ 8000 EVO Colonna: RESTEK Rxi -5Sil MS 20m*0,18mm*0,18µm Iniettore: Splitless (2µl) a 260 C Programma termico Rampa ( C/min) Temp. ( C) Hold (min) Transfer-line: 250 C Ion source: 260 C Ionizzazione: EI Acquisizione: SRM 2 transizioni per molecola 2-Phenylphenol Acrinathrin Aldrin Alfa-Endosulfan Alfa-HCH Beta-Endosulfan Beta-HCH Bifenthrin Bromopropylate Cadusafos Chlorpropham Chlorpyrifos Chlorpyrifos-methyl Chlorotalonil Cis-Chlordane Cyfluthrin Cypermethrin Deltamethrin Dieldrin Diphenylamine Endosulfan sulphate Endrin Endrin ketone EPN Esfenvalerate Etofenprox Fenitrothion Fenpropathrin Fenthion Fenvalerate Fipronil Fipronil sulfone Gamma-HCH (Lindane) HCB Heptachlor Heptachlor-endo-epoxide Heptachlor-exo-epoxide Iprodione Isocarbophos Lambda-Cyhalothrin Malathion Methoxychlor o,p -DDT Oxadyxil Oxychlordane p,p -DDD p,p -DDE p,p -DDT Parathion Parathion-methyl Pendimethanil Permethrin Phentoate Piperonyl butoxide Procymidone Resmethrin Tau-Fluvalinate Trans-Chlordane Trifluralin Vinclozolin

23 Risultati EUPT-CF8 Pesticidi in EUPT-CF8 Concentrazione trovata Concentrazione Test Item (mg/kg) assegnata (mg/kg) z-score Chlorthalonil 0,034 0, Cypermethrin 1,07 0, Deltamethrin 0,055 0, Endosulfan sulphate , Lindane 0,053 0, Trifluralin 0,045 0,

24 Valori di recupero a mg/kg, e mg/kg compresi nel range % La selettività degli strumenti permette di minimizzare l interferenza di matrici complesse anche minimizzando la purificazione Analisi di Ring-test permettono di ottenere z- score inferiori a 2 in valore assoluto ACCETTABILI

25 VALIDAZIONE METODO GC-MS/MS ed HPLC-MS/MS (al momento sono state verificate solamente linearità in solvente, in matrice, effetto matrice e recupero %) Validazione verrà condotta in accordo con la linea guida SANCO e coprirà: Cereali e derivati destinati al consumo umano Legumi secchi destinati al consumo umano Mangimi a base cerealicola e a base di leguminose Mangimi a base di farina di pesce Inclusione nel metodo in HPLC-MS/MS ed in GC-MS/MS di ulteriori pesticidi in modo da coprire lo spettro di analiti del programma europero di monitoraggio pluriennale Sviluppo di metodiche a singolo residuo per la determinazione di residui non analizzabili con metodiche multiresiduo... Gliphosate?? Partecipazione ad EUPT-CF10 e follow-up delle performance dei laboratori italiani.

26 Grazie per l attenzione