Metodiche molecolari per la valorizzazione delle varietà di riso coltivate in Lombardia

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1 Metodiche molecolari per la valorizzazione delle varietà di riso coltivate in Lombardia Quaderni della Ricerca n. 123 novembre 2010

2 Sperimentazione condotta nell ambito del progetto di ricerca n Rete di sperimentazione varietale riso e messa a punto di metodiche molecolari per la valorizzazione delle varietà di riso coltivate in Lombardia (RISOVAL). Piano della Ricerca Testo a cura di: Romano Gironi, Lætitia Borgo, Aldo Carnia, Alessia Sodano Dipartimento di Ricerca, Centro Ricerche sul Riso - Ente Nazionale Risi Mauro Cormegna, Cinzia Simonelli Laboratorio Chimico Merceologico, Centro Ricerche sul Riso - Ente Nazionale Risi Pietro Piffanelli, Raffaella Greco, Laura Crispino Gruppo Genomica Riso, Centro Ricerche e Studi Agroalimentari - Parco Tecnologico Padano Foto a cura di: Bruno Villa, Romano Gironi Dipartimento di Ricerca, Centro Ricerche sul Riso - Ente Nazionale Risi Laura Crispino, Raffaella Greco Gruppo Genomica Riso, Centro Ricerche e Studi Agroalimentari - Parco Tecnologico Padano Hanno realizzato le attività sperimentali: Ente Nazionale Risi Centro Ricerche sul Riso - Dipartimento di Ricerca Strada per Ceretto, Castello D Agogna (PV) Referente: Dr. R. Gironi r.gironi@enterisi.it Parco Tecnologico Padano Centro Ricerche e Studi Agroalimentari - Gruppo Genomica Riso Via Einstein-Località Cascina Codazza, Lodi (LO) Referente: Dr. P. Piffanelli pietro.piffanelli@tecnoparco.org Per informazioni: Regione Lombardia Direzione Generale Agricoltura Unità organizzativa Innovazione cooperazione e valorizzazione delle produzioni Struttura ricerca e innovazione tecnologica e servizi alle imprese per lo sviluppo Via Pola, 12/ Milano tel Referente: Dr.ssa Elena Brugna tel elena_brugna@regione.lombardia.it Questo Progetto è stato realizzato con il coordinamento della Dr.ssa Luisa Bonomi durante la sua attività presso la Regione Lombardia, Direzione Generale Agricoltura. Si ringrazia la Dr.ssa Luisa Bonomi per la sua preziosa e pronta collaborazione per la riuscita del Progetto. Copyright Regione Lombardia

3 Metodiche molecolari per la valorizzazione delle varietà di riso coltivate in Lombardia Quaderni della Ricerca n. 123 Novembre 2010

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5 INDICE PRESENTAZIONE Assessore all Agricoltura... 3 Responsabile scientifico... 5 SELEZIONE ASSISTITA CON MARCATORI MOLECOLARI PER LA VALORIZZAZIONE VARIETALE Fenotipizzazione varietale della collezione RISOVAL DNA Fingerprinting della collezione RISOVAL Analisi fenotipica e genotipica per la resistenza a Pyricularia grisea Descrizione del patogeno Pyricularia / Magnaporthe grisea ed incidenza sulla coltivazione del riso Fenotipizzazione delle varietà della collezione RISOVAL per la resistenza a Pyricularia grisea Analisi molecolari di geni di difesa Utilizzo di marcatori molecolari per identificare geni di resistenza a Pyricularia grisea Analisi merceologica e genotipica per la determinazione del contenuto in amilosio Amilosio nel riso Uso di marcatori molecolari associati al contenuto in amilosio del granello CONCLUSIONI GLOSSARIO BIBLIOGRAFIA

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7 PRESENTAZIONE Malgrado il settore stia attraversando una fase di incertezza dovuta a diversi fattori tra cui le brusche oscillazioni di mercato e i dubbi sul futuro della Pac, è possibile stimare l entità della coltura del riso in Lombardia analizzando i dati forniti dall Ente Risi. Nel 2009, infatti, la superficie coltivata è stata di ettari (43 % del totale italiano), in incremento del 8,9% rispetto all anno precedente. Valori che confermano la tendenza degli agricoltori lombardi a mantenere il riso nel proprio ordinamento colturale. In seguito all allargamento della UE ai nuovi Paesi, si è registrato nel rapporto tra domanda e offerta un cambiamento significativo a fronte del quale è necessario elaborare nuove strategie a beneficio di tutti i componenti della filiera che devono affrontare le sfide del mercato globale. Regione Lombardia è consapevole che per valorizzare la produzione regionale si devono fornire agli imprenditori indicazioni oggettive che solo il mondo della ricerca è in grado di dare. A questo scopo la Direzione Generale Agricoltura ha finanziato il progetto Rete di sperimentazione varietale riso e messa a punto di metodiche molecolari per la valorizzazione delle varietà di riso coltivate in Lombardia (RISOVAL), con l obiettivo di valutare le caratteristiche morfofisiologiche, agronomiche e merceologiche utilizzando le più avanzate conoscenze di genomica e biologia molecolare integrate con il miglioramento genetico tradizionale. Questa pubblicazione riporta le preziose informazioni ottenute nei tre anni di sperimentazione che, sono certo, si dimostreranno utili per valorizzare la produzione lombarda. Giulio De Capitani Assessore all Agricoltura 3

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9 Il progetto RISOVAL nasce dall esigenza di fornire a tutta la filiera del riso indicazioni oggettive necessarie a valorizzare la produzione regionale del riso, tramite analisi molecolari che permettono di assistere il lavoro di miglioramento genetico e di caratterizzare le diverse varietà coltivate in Lombardia. Sul piano varietale è indispensabile effettuare osservazioni morfofisiologiche, agronomiche e merceologiche delle varietà più coltivate in regione Lombardia in modo da permettere, tramite la costituzione di un sistema avanzato di caratterizzazione ed identificazione delle varietà, una migliore descrizione delle risorse genetiche. Ad oggi la caratterizzazione varietale si basa su osservazioni morfologiche e fisiologiche che permettono la compilazione di schede descrittive. La tecnica del fingerprinting, ovvero dell impronta genetica, permette di raggruppare le varietà in pool genetici e consente di utilizzare queste informazioni per l arricchimento del panorama genetico attraverso incroci effettuati fra varietà molto distanti geneticamente. Fornisce altresì un valido strumento di tutela e di accertamento per l identificazione dei prodotti, a garanzia del consumatore finale. La presenza di geni di resistenza a Pyricularia grisea in alcuni genotipi, riveste un ruolo determinante per la creazione di varietà elite ed apre nuovi scenari di valorizzazione varietale. La resistenza di alcune varietà a Pyricularia grisea permette un aumento quantitativo e qualitativo dei raccolti, con una ricaduta economica significativa per l agricoltore che con un uso strategico e ridotto di prodotti fitosanitari ha conseguenze positive sull agro-ecosistema risaia e sulla qualità e salubrità del prodotto finale, come richiesto da un consumatore sempre più esigente. Attraverso l uso di marcatori molecolari non legati all interazione genotipo-ambiente, associati a caratteristiche merceologiche interessanti, è possibile determinare il contenuto di amilosio di un genotipo. Il progetto Risoval, finanziato dalla Regione Lombardia e sviluppato da Ente Nazionale Risi (ENR) in collaborazione con il Parco Tecnologico Padano (PTP) intende fornire, tramite la fruizione dei dati, le conoscenze acquisite ed i risultati ottenuti nei tre anni di sperimentazione. Tali informazioni intendono rispondere alle richieste di tutti gli operatori della filiera, in quanto rappresentano risposte concrete di miglioramento ed innovazione tecnologica per il settore risicolo. Dr. Romano Gironi Responsabile scientifico 5

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11 SELEZIONE ASSISTITA CON MARCATORI MOLECOLARI PER LA VALORIZZAZIONE VARIETALE Nel 2007 il Registro Nazionale delle varietà di riso contava 146 iscrizioni, di cui 72 varietà coltivate; pertanto, si è deciso di condurre le analisi morfofisiologiche e molecolari su questo pool di germoplasma (Tabella 1). Tabella 1. Varietà della Collezione RISOVAL n. Varietà n. Varietà n. Varietà 1 Aiace 25 Cripto 49 Rodeo 2 Albatros 26 Delfino 50 Roma 3 Apollo 27 Elba 51 S. Andrea 4 Arborio 28 Elio 52 Savio 5 Argo 29 Ellebi 53 Scirocco 6 Ambra 30 Eolo 54 Scudo 7 Ariete 31 Ercole 55 Selenio 8 Arpa 32 Eurosis 56 SIS R215 9 Artemide 33 Flipper 57 Sprint 10 Artiglio 34 Fragrance 58 Tea 11 Asso 35 Galileo 59 Tejo 12 Augusto 36 Gange 60 Thaibonnet 13 Baldo 37 Giano 61 Atlante 14 Balilla 38 Gladio 62 Tosca 15 Bianca 39 Karnak 63 Ulisse 16 Bravo 40 Koral 64 Venere 17 Brio 41 Libero 65 Vialone Nano 18 Cadet 42 Lido 66 Volano 19 Carmen 43 Loto 67 Opale 20 Carnaroli 44 Marte 68 Luxor 21 Castelmochi 45 Nembo 69 Carnise 22 Centauro 46 Padano (Bahia) 70 Carnise precoce 23 CRLB1 47 Perla 71 Arsenal 24 Creso 48 Poseidone 72 Samba 1- Fenotipizzazione varietale della collezione RISOVAL La ricerca di nuove varietà di riso è un processo ormai consolidato che, a seconda dell ambiente di coltivazione, persegue obiettivi diversi come l aumento delle produzioni, la resistenza alla salinità, allo stress idrico, alle malattie fungine ecc. Questi caratteri, inseriti tramite incroci tradizionali creano variabilità nel genoma del riso che ai fini della costituzione varietale, è determinante conoscere e quantificare. Le metodologie tradizionali di identificazione e caratterizzazione varietale utilizzate, sono basate su osservazione fenotipiche attraverso rilevamento, descrizione ed anche misurazione di caratteri morfologici e fenologici. Per definire uno standard di valutazione unico a livello globale sono stati creati codici descrittivi con l obiettivo di ridurre la soggettività nella valutazione e favorire le successive elaborazioni statistiche. I 37 descrittori fenotipici primari sono stati scelti prendendo come riferimento le indicazioni delle linee guida dello Standard Evaluation Sistem for Rice (SES) adottato da IRRI ( e 7

12 della Guideline for the Conduction of test for Distinctiness, Uniformity and Stability del Community Plant Variety Office (CPVO) ( Nel progetto Risoval, per effettuare le osservazioni morfofisiologiche, è stato allestito un campo sperimentale con semina interrata, a parcelle di sei file per ogni accessione, impiegando una seminatrice di precisione. La sommersione dell appezzamento è avvenuta con il riso a 3-4 foglie e durante il ciclo di crescita sono stati operati diversi interventi di controllo al fine di accertare l omogeneità dell accessione, eliminando le presenze di fuori tipo per assicurare il mantenimento in purezza. A maturazione sono state raccolte manualmente le quattro file centrali di ogni parcellina e dopo l essiccazione e sgranatura delle pannocchie, il seme è stato selezionato prima con pulitura manuale per eliminare le parti grossolane, poi, con ventilazione meccanica per le impurità leggere. Successivamente è stato stoccato in sacchetti recanti gli identificativi delle accessioni e riposto in cella climatizzata a + 4 C per la sua conservazione. Le osservazioni effettuate attraverso i descrittori standard sono state realizzate in tutte le fasi fenologiche della pianta e per ogni genotipo, rilevando anche la lunghezza degli intervalli di crescita dalla semina alla spigatura e dalla semina alla maturazione. Il seme ottenuto in purezza è servito per la rilevazione di vari parametri biometrici, come la lunghezza e la larghezza della spighetta. Altra misura realizzata, in quanto importante per la definizione della densità colturale, è stata la pesatura di 100 semi. Dopo la sbramatura sono state rilevate le variazioni nella colorazione del pericarpo, altro carattere peculiare di alcune varietà. Un aliquota del seme di ogni accessione è stata sottoposta a resatura (rimozione del pericarpo del granello) e, con l analizzatore di immagini WINSEEDLE (Reagent Instrument), sono state misurate lunghezza e larghezza del granello ed il rapporto tra le due grandezze; quindi sono state verificate la presenza o meno di perlatura, le differenze nel profilo della cariosside e il peso di 100 semi lavorati. Presso il Laboratorio Chimico Merceologico del Centro Ricerche dell Ente Nazionale Risi sono state effettuate analisi merceologiche per determinare il contenuto in amilosio, la consistenza e la collosità del granello. Per ogni varietà i dati raccolti durante il triennio di sperimentazione, sono stati utilizzati per la compilazione della propria scheda descrittiva disponibile online sul sito dell Ente Nazionale Risi ( In tabella 2 è riportata, come esempio, la scheda descrittiva della varietà Carnaroli. A completamento dei processi di fenotipizzazione varietale sono state adottate metodologie di analisi biochimica e molecolare che hanno convalidato le osservazioni fenotipiche effettuate in campo, fornendo un dato oggettivo preciso e univoco di identificazione di ogni genotipo di riso. 8

13 Tabella 2. Scheda descrittiva dei caratteri morfofisiologici della varietà Carnaroli SCHEDA DI ACCERTAMENTO DEI CARATTERI MORFOFISIOLOGICI Specie : Oryza sativa Denominazione: Carnaroli Paese di origine: Italia Genealogia: Vialone x Lencino Responsabile della conservazione in purezza: Ente Risi Introduzione: 1983 Codice Gruppo di Carattere UPOV caratteri 1 Foglia 2 a colore verde b portamento eretta pigmentato in termedia orizzontale riflessa 2 Culmo 12 a taglia (cm) 11 b diametro culmo (mm) 13 c colore nodi verde d e f g colore internodi verde colore guaina verde colore giuntura verde colore auricole verde pigmentato pigmentato pigmentato pigmentato pigmentato 3 Foglia paniculare a portamento eretta in termedia orizzontale riflessa 4 Pannocchia a lunghezza (cm) 15 b tipo compatta c d in termedia aperta eserzione molto eserta eserta inguainata portamento eretta semieretta semipendula pendula 20 e aristatura mu tica 10 f colore stigmi ialino semimutica semiaristata aristata violetto Rilievo x x 114,0 6,6 x x x x x x 26,0 x x x x x 9

14 Codice UPOV Gruppo di Carattere caratteri 5 Glumella a villosità assen te presente 19 b aristatura mutica corta lunga 9 c colore apice apigmentato pigmentato 7 e 8 d colore carena e calotta apigmentato e pigmentato colore glume apigmentato pigmentato 6 Spighetta 23 a lunghezza (mm) 24 b larghezza (mm) 22 c peso 100 semi (g) 7 Cariosside 25 a lunghezza (mm) 26 b larghezza (mm) 27 c rapporto L/l profilo arrotondato < 1,75 d peso 100 semi (g) 28 e colorazione pericarpo bianco semiarrotondato 1,76-1,99 semiaffusolato 2,0-2,45 affusolato 2,46-3,00 lungo B > 3,00 colorato 8 Caratteri merceologici 29 a cariosside: perlatura presenza b assen za aroma non aromatico aromatico 30 c endosperma: tipo non glutinoso glutinoso d contenuto in amilosio % ss e consistenza k g / cm 2 f collosità g x cm 9 Cicli vegetativi 6 a semina - spigatura (gg) 21 b semina - maturazione (gg) NOTE: Rilievo x x x x x 9,57 3,93 4,13 7,25 3,37 2,15 x 3,45 x x x x 22,10 0,91 1,

15 2- DNA Fingerprinting della collezione RISOVAL Con l intento di sviluppare una metodica per la caratterizzazione delle 72 varietà di riso della collezione RISOVAL e per la loro certificazione, si è messa a punto presso il PTP un analisi di genotipizzazione basata sull utilizzo di marcatori molecolari (DNA fingerprinting). Tale tecnica, basata sul monitoraggio della variabilità genetica presente a livello del DNA attraverso l'uso di uno o più marcatori che caratterizzano il genoma ed identificano genotipi diversi anche se molto simili, rappresenta un sistema molto efficace di identificazione varietale. Per il fingerprinting delle varietà del progetto RISOVAL sono stati utilizzati i marcatori microsatelliti, detti anche SSR (Simple Sequence Repeat). Gli SSR sono regioni di DNA caratterizzate dalla ripetizione di una stessa sequenza, generalmente molto semplice e lunga da 2 a 6 nucleotidi (nelle piante la ripetizione più frequente è AT). Un singolo microsatellite può differire tra individui diversi non per la sequenza di base, ma per il numero di volte che questa è ripetuta, dando origine ad alleli diversi (polimorfismo espresso in lunghezza della sequenza ripetuta). La scelta degli SSR deriva principalmente dal loro elevato grado di polimorfismo anche tra individui della stessa specie e dalla loro ampia distribuzione nel genoma. Questo li rende particolarmente adeguati per analizzare genotipi strettamente imparentati come le varietà di riso italiane, derivate da processi di breeding per selezionare caratteristiche adatte all areale mediterraneo. Gli SSR sono inoltre marcatori codominanti, ovvero in grado di discriminare tra individui omozigoti ed individui eterozigoti per il singolo marcatore, sono facili da analizzare e permettono un alta automazione e ripetibilità delle analisi. Un ulteriore vantaggio dell utilizzo dei marcatori SSR per l identificazione varietale, rispetto al tradizionale impiego delle caratteristiche fenotipiche, è rappresentato dalla loro totale indipendenza dalle influenze ambientali. Più di 2500 marcatori SSR sono stati sviluppati per l analisi del genoma del riso e sono stati pubblicati per un libero utilizzo ( Per la caratterizzazione delle 72 varietà di riso in studio nel progetto RISOVAL, si sono scelti 24 marcatori SSR distribuiti sui 12 cromosomi del genoma di riso, con 2 marcatori per cromosoma (Figura 1). Figura 1. Distribuzione dei 24 SSR sui 12 cromosomi del genoma di riso. Il rilevamento dei polimorfismi è stato effettuato mediante amplificazione del DNA genomico estratto dalle 72 varietà con primer marcati con molecole fluorescenti, complementari alle regioni fiancheggianti le sequenze ripetute. Queste ultime risultano essere molto conservate e consentono quindi di identificare univocamente i singoli microsatelliti. I prodotti di PCR sono stati quindi analizzati mediante elettroforesi capillare utilizzando un sequenziatore automatico AB3730 in dotazione presso la Piattaforma Genomica del Parco Tecnologico Padano, che consente di effettuare la determinazione automatizzata della lunghezza degli alleli (polimorfismi presenti per un 11

16 determinato SSR in una determinata varietà). Nella figura 2 è riportato un esempio del risultato che si ottiene da questa analisi (elettroferogramma) RM234 RM258 RM215 RM RM258 RM234 RM215 Figura 2. Esempio di elettroferogramma che mostra il profilo ottenuto per 4 marcatori SSR (RM24, RM215, RM234, RM258) nelle varietà Gange e Marte. I numeri corrispondenti ai diversi picchi indicano la lunghezza del frammento amplificato (in paia di basi). RM24 Per ognuna delle 72 varietà si è quindi ottenuto un profilo di genotipizzazione, in cui per ogni marcatore SSR (locus) è indicata l esatta lunghezza e quindi il numero di ripetizioni della sequenza base presente (allele). La combinazione degli alleli presenti nei 24 loci è in grado di distinguere le varietà e di identificare univocamente ciascuna di esse. Tale profilo costituisce l impronta genetica, o fingerprint, della varietà. I dati molecolari ottenuti dall analisi di genotipizzazione con i marcatori SSR hanno inoltre consentito di analizzare le distanze genetiche esistenti tra le varietà della collezione RISOVAL e di creare un albero filogenetico che descrive la struttura della collezione. Tale analisi è stata effettuata mediante l utilizzo del software DARWIN (Perrier and Jacquemoud-Collet 2006; DARwin software Il dendrogramma ottenuto rivela la suddivisione delle 72 varietà in tre gruppi filogenetici distinti, validati confrontando le rispettive posizioni al suo interno con le conoscenze sul pedigree di alcune varietà. In aggiunta, viene evidenziata la presenza di un quarto gruppo comprendente le varietà a pericarpo nero Artemide e Venere (Figura 3). La ripetibilità delle analisi effettuate con questo sistema è stata validata utilizzando DNA estratto da diversi tessuti della pianta, quali foglie e granello. Inoltre il pannello di 24 marcatori SSR è stato testato con risultati analoghi anche mediante rilevamento dei prodotti di PCR (alleli) per elettroforesi su gel di acrilammide, consentendo di effettuare la genotipizzazione in assenza del sequenziatore capillare automatico. Le conoscenze raccolte dall analisi con i marcatori molecolari microsatelliti hanno fornito una strategia innovativa per l identificazione e la certificazione delle varietà di riso italiane. Lo studio svolto e i risultati ottenuti garantiscono una identificazione univoca di ognuna delle varietà analizzate. 12

17 Gladio Aiace CR LB1 Thaibonnet Eolo Sprint Atlan Titano t e Libero SIS R215 Apollo Scudo Arsenal Cadet Giano Gange Fragrance Tejo Ellebi Savio Lido Eurosis Ercole Asso Koral Elba Ariete Flipper Delfino Nembo Tea Loto Luxor Carmen Augusto Rodeo Elio Cripto Arpa Centauro Marte Ambra Selenio Perla Castelmochi Scirocco Creso Balilla Samba S. Andrea Brio Padano (Bahia) Bravo Opale Vialone Nano Roma Volano Arborio Ulisse Tosca Bianca Baldo Galileo Poseidone Karnak Carnaroli Argo Carnise precoce Carnise Albatros Venere Artemide Artiglio Figura 3. Analisi filogenetica delle 72 varietà della collezione RISOVAL. 13

18 3- Analisi fenotipica e genotipica per la resistenza a Pyricularia grisea 3.1- Descrizione del patogeno Pyricularia / Magnaporthe grisea ed incidenza sulla coltivazione del riso Il brusone Con il termine brusone, in inglese blast, si indica una delle più gravi patologie fungine del riso a distribuzione mondiale. La malattia, identificata in 85 paesi produttori di riso, distrugge raccolti sia in zone tropicali che temperate; in particolare i danni maggiori sono stati riportati in aree risicole americane (Lee, 1994), africane, asiatiche (Roca et al., 1996) ed europee (Tinarelli, 1986). Ogni anno il brusone distrugge una quantità di cibo che sarebbe in grado di alimentare 60 milioni di persone (Zeigler et al., 1994). In Italia le maggiori perdite di raccolto si registrano in presenza di varietà sensibili, in suoli sabbiosi poco capaci di trattenere la concimazione, mentre danni minori sono riscontrabili in terreni argillosi e profondi (Kawai, 1952). La malattia è stata riscontrata, oltre che su riso, su una grande varietà di ospiti alternativi, tra cui orzo, grano e miglio. Pyricularia: morfologia e citologia Il microrganismo responsabile della patologia è la forma anamorfa o asessuata del fungo ascomicete Pyricularia grisea; il telomorfo o forma perfetta del fungo, Magnaporthe grisea, non si trova in natura in Italia (Hebert, 1971). Le ife sporifere di Pyricularia di forma arrotondata sono epifilliche e fuoriescono a grappoli dalla superficie fogliare o dagli stomi. I rami conidiofori cilindrici presentano da due a quattro setti e possono sostenere ognuno fino a venti conidi di colore ialinooliva pallido. La forma del conidio, settato trasversalmente, varia da piriforme a clavata e le sue dimensioni dipendono dalle condizioni ambientali (Figura 4). Alte temperature (27-30 C) e condizioni di sufficiente umidità, infatti, portano alla formazione di conidi più lunghi di quelli formatisi in ambiente secco e a basse temperature (18-22 C). In vitro il fungo produce conidi di lunghezza maggiore di quelli isolati in natura sull'ospite. P. grisea possiede un genoma relativamente piccolo (37-40 Mb) diviso in 7 cromosomi di dimensioni da 3 a 12 Kb ognuno (Valent, 1997). Nel 2005 il genoma del fungo è stato sequenziato interamente e sono stati predetti oltre geni (Dean et al., 2005). Figura 4. Conidiofori e conidi di Pyricularia grisea osservati al microscopio ottico (Bruno Villa - ENR). 14

19 Fitopatologia del brusone Il brusone del riso, in termini fitopatologici, si definisce come una malattia tossica o necrotossica, in quanto le cellule dei tessuti vegetali invasi dalle ife fungine sono rapidamente uccise dal patogeno che utilizza il materiale cellulare necrotizzato per le sue necessità alimentari. Tutti i tessuti vitali della pianta possono essere oggetto dell aggressione del patogeno. Il micelio fungino intercellulare, attraverso la produzione di due sostanze tossiche, la piricularina e l'acido alfapicolinico, causa un alterazione della permeabilità differenziale delle membrane cellulari, con conseguente diminuzione della reattività cellulare (Ou, 1985). Da un punto di vista funzionale, l invasione dei meristemi e dei parenchimi delle foglie e del culmo da parte di Pyricularia e l occlusione dei vasi xilema e floema da parte del micelio fungino, porta all arresto del trasporto di materiale alimentare, provocando un decorso acuto della malattia (Figura 5). Il numero di conidi depositati sulla foglia varia ampiamente in base alla posizione della foglia ed all'angolo di inserzione sul culmo: i conidi risultano infatti più numerosi sulla terza piuttosto che sulla seconda foglia, mentre pochi sono presenti sulla foglia apicale. Figura 5. Sintomi acuti dell attacco di Pyricularia grisea su foglie, nodi e pannocchia di riso (Bruno Villa - ENR). Epidemiologia La produzione di conidi di Pyricularia sul sito di infezione tende ad aumentare con l umidità relativa dell'aria. In vitro, infatti, valori inferiori al 90-93% di umidità relativa portano ad una produzione di conidi ridotta se non nulla. Nelle nostre regioni risicole, quando la temperatura si avvicina al limite ottimale per il patogeno (27-30 C) e si raggiungono elevati valori di umidità relativa dell'aria (80-90%), la malattia acquista una certa intensità. Nei climi temperati, la maggior parte dei conidi viene rilasciata tra le 2 e le 6 del mattino, mentre ai tropici è possibile osservare, dopo una pioggia monsonica, un secondo picco nel pomeriggio. La presenza di acqua, dunque, risulta necessaria per il rilascio dei conidi, sebbene forti e abbondanti piogge diminuiscano la loro aerodispersione. In particolare, la presenza e il tempo di persistenza di rugiada sulla pianta influenza il rilascio dei conidi di P. grisea: maggiore è il tempo di persistenza sulla pianta, maggiore sarà la quantità di conidi rilasciati (Picco et al.). I conidi di Pyricularia possono ritrovarsi sino a 24 metri d altezza dal suolo ed essere liberati a breve distanza dal vento; la maggior parte di essi, tuttavia, rimane intrappolata vicino al suolo, al di sotto della copertura fogliare della risaia (Suzuki, 1974). 15

20 Durante la stagione di crescita del riso, i conidi vengono disseminati in campo per un periodo relativamente breve: nelle regioni temperate il loro picco di diffusione è da luglio a settembre. In Italia, le condizioni ottimali per l'instaurarsi della malattia si verificano solitamente durante il mese di luglio. Il tempo necessario ad un conidio per infettare ed invadere le cellule dell'ospite varia con la temperatura ed è di 10, 8, 6 ore con temperatura di 32 C, 28 C e 24 C rispettivamente. Ciclo della malattia L attacco del fungo sul riso induce una serie di eventi morfogenetici che iniziano con la formazione di una cellula infettiva in risposta al contatto con la superficie fogliare, proseguono con lo sviluppo di strutture specializzate all'assimilazione in seguito all'ingresso nell'epidermide, e terminano con la formazione di conidi, in condizioni di temperatura e umidità favorevoli al patogeno (Figura 6). Figura 6. Ciclo biologico e infettivo di Pyricularia grisea (Dean et al., 2005). Infezione, formazione dell'appressorio e penetrazione L arrivo del fungo sulla superficie della pianta dà inizio al processo infettivo, che procede con la formazione di una serie di strutture specializzate che permettono al fungo di colonizzare l ospite. Pyricularia grisea riesce a penetrare attraverso la cuticola tramite la formazione di una struttura sferica chiamata appressorio. Durante la maturazione, si osserva un rigonfiamento del conidio seguito dal rilascio di materiale mucillaginoso che permette al corpo del fungo di aderire perfettamente ad ogni tipo di substrato (Figura 7). Condizioni ambientali, quali temperatura e umidità, giocano un ruolo fondamentale nell'instaurarsi dell'infezione fungina. In particolare, la presenza di acqua libera risulta indispensabile per la germinazione dei conidi (Lee e Dean, 1993); tale processo inizia con la formazione del tubo germinativo (10-30 µm) da una delle tre cellule del conidio, fino alla differenziazione nell appressorio (Bourret e Howard, 1990). La parete cellulare dell'appressorio è estremamente specializzata in quanto sottende al processo di melanizzazione, in cui il fungo sintetizza e deposita un strato di melanina che ricopre tutto il perimetro cellulare eccetto la regione a contatto con il substrato, formando il cosiddetto "poro dell'appressorio". Vari fattori, quali la temperatura a terra e dell'aria, le ore di bagnatura fogliare, il grado di intensità della luce e la durata del periodo di buio, influenzano il tempo necessario a Pyricularia per penetrare la superficie fogliare. In particolare, P. grisea impiega più tempo di altri patogeni a penetrare la superficie fogliare dell'ospite; risulta infatti necessario un lungo periodo (8 giorni in vitro e 2 giorni in vivo) di incubazione per la formazione dello stiletto di penetrazione. All interno dell appressorio si crea una grande pressione osmotica, necessaria per rompere la superficie dell'ospite, molto resistente alla penetrazione (Ribot et al., 2008). 16

21 Le varietà di riso resistenti, grazie alla produzione di resine e granuli scuri, bloccano la penetrazione delle ife fungine attraverso la parete cellulare vegetale, impedendo la colonizzazione dell intera pianta ospite (Kawamura e Ono, 1948). Al contrario, nelle piante suscettibili le ife fungine colonizzano lo sclerenchima, il parenchima e i tubi vascolari dell'ospite con velocità variabile in funzione della temperatura. Durante il processo di infezione della pianta, P. grisea sintetizza dei metaboliti e delle tossine; tra queste sostanze ritroviamo l'acido alfa-picolinico (C 6 H 5 NO 2 ), la "piricularina" (C 18 H 14 N 2 O 3 ), l'acido tenuazonico e il pyriculolo. A B C Figura 7. Conidi e appressori di P. grisea (A) a- Conidio sostenuto dal conidioforo, esibisce una gocciolina di mucillagine (STM) adesiva; b- Attacco del conidio tramite STM dopo il contatto con la superficie. (B) Sviluppo dell appressorio. (C) a- Collasso dell appressorio con melanina; b- appressorio turgido (Ap: Appressorio, Co: Conidio, Gt: Tubo germinativo) (Howard e Valent, 1996). Produzione e rilascio dei conidi La fase successiva all infezione è quella di formazione dei conidi, che ha inizio con la fuoriuscita del patogeno dal tessuto infetto dell ospite, attraverso le aperture stomatiche o direttamente dalla cuticola, e continua con la formazione dei conidiofori. La produzione di conidi sulle lesioni si ha circa 6 giorni dopo l'infezione. Le cellule conidiogene, dalla caratteristica forma a bottiglia, si formano secondo un meccanismo di tipo oloblastico (Cole, 1986) che prevede la scissione del nuovo conidio dall apice del conidioforo. Una tipica lesione produce da 2000 a 6000 conidi ogni giorno in condizioni di elevata umidità relativa dell'aria; inoltre, il numero di tali lesioni e la loro posizione influisce sul decorso della malattia: sulla foglia la massima fruttificazione si ottiene 3-8 giorni dopo la comparsa della lesione, mentre sul rachide sono necessari giorni. I conidi sono prodotti e liberati in prevalenza nelle ore notturne e, come detto in precedenza, il loro rilascio necessita di rugiada e di vento. Sintomi in campo e danni alle coltivazioni Il brusone può manifestarsi in ogni stadio dello sviluppo della pianta, acquistando in Italia maggiore intensità sui soggetti adulti. Il fungo attacca la pianta di riso producendo lesioni di tipo necrotico sulle foglie, a livello dei nodi e dei culmi e sulla pannocchia (Sesma ed Osbourn, 2004). Si distinguono quindi una serie di patologie legate all attacco di Pyricularia, quali il brusone fogliare, il mal dei nodi e il "mal del collo". Sintomi e danni sulle foglie I primi sintomi dell attacco del brusone appaiono durante il mese di luglio quando si verificano le condizioni ottimali per l'instaurarsi della malattia. Sulle foglie compaiono macchie rotondeggianti di 2-3 mm, di colore rosso bruno; quando la pianta è suscettibile al patogeno, tali macchie 17