UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA Facoltà di MEDICINA e CHIRURGIA Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia AA Human papillomavirus HPV

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1 UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA Facoltà di MEDICINA e CHIRURGIA Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia AA Human papillomavirus HPV

2 Due generi: 1) Papillomavirus (HPV) (verruche; carcinoma cervicale) 2) Polyomavirus BK virus (malattia renale) JC virus (PML, leucoencefalopatia multifocale progressiva) BK e JC causano malattia nei soggetti immunodepressi. HPV può causare infezioni litiche in cellule permissive, persistenti, latenti e trasformanti in cellule non permissive.

3 HPV Famiglia Papillomaviridae Genere Papillomavirus Morfologia virione nudo simmetria icosaedrica 72 capsomeri genoma: DNA circolare bicatenario dimensioni: 55 nm circa 100 tipi classificati in 16 gruppi virus epiteliotropo, può essere distinto in cutaneo e mucosale sulla base della suscettibilità tissutale.

4 Caratteri generali dei virus Il DNA (8000 paia di basi) codifica per 6-8 geni precoci (early, E1-E8, proteine che promuovono la replicazione cellulare) e 2 geni tardivi (late) che codificano per 2 proteine strutturali: L1 e L2.

5 Genoma di HPV-16 E1: replicazione del DNA virale E2, E4, E5: regolano la trascrizione e la replica (E3:??) E6 proteina oncogenica che lega la p53 E7 proteina oncogenica che lega la p105rb E6 ed E7 immortalizzano e promuovono la crescita. L1: proteina maggiore del capside L2: proteina minore del capside

6 Organizzazione del genoma Regione codificante proteine tardive E7 (L = Late) Regione codificante L2 Long control region (LCR) P97 E6 trasformazione (p53-prb) proteine precoci (E = Early) proteine capsidiche proteina tardiva, legame citocheratine E1 replicazione episomica L1 E4 E5 trasformazione E2 regolazione della trascrizione e replicazione DNA

7 HPV: la replica è nucleare a) Trascrizione dei geni virali precoci I geni precoci stimolano la crescita delle cellule e facilitano la replica del genoma virale, utilizzando la DNA polimerasi della cellula ospite quando le cellule si dividono. b) Trascrizione dei geni virali tardivi I geni tardivi codificanti proteine strutturali sono espressi solo nello strato superiore che si differenzia in ultimo, distruggendo la cheratina, ed il virus è diffuso con le cellule dello strato superiore. Di conseguenza l espressione dei geni virali è correlata all espressione di specifiche cheratine

8 Proteine precoci (non strutturali) Proteina maggiore E1 E coinvolta nella replicazione del DNA. Proteina regolatrice E2 La trascrizione di E2 permette di inibire l E6 e l E7. Questa proprietà viene persa quando il genoma virale si integra nel genoma dell ospite. Questo dà via libera alla soppressione dell inibizione di E6 e E7 che agiscono sui geni oncosoppressori bersaglio p53 e prb

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10 Proteina E4 è importante nella maturazione del virus nella infezione produttiva: è espressa nelle fasi tardive dell infezione durante l assemblaggio del virione. Non sembra avere proprietà trasformanti Nei cheratinociti umani sembra intaccare l integrità del citoscheletro cellulare (coilocitosi) favorendo la fuoriuscita delle particelle virali neoformate. Proteina E5 si inserisce nella membrana della cellula infetta (proteina 16K), alterando l attività delle proteine di membrana coinvolte nei segnali di proliferazione cellulare (EGF, PDGF2). Rende le cellule resistenti all apoptosi. Favorisce la formazione dei condilomi

11 E6 e E7 E6 e E7 interagiscono con molte proteine, influenzando l evoluzione di una infezione. E6 e l E7 agiscono come oncoproteine virali negli HPV ad alto rischio, non si conosce la funzione in HPV a basso rischio.

12 Proteina E6 L interazione con la p53 interferisce sia con i segnali di trascrizione e traduzione della p53 che con quelli che portano all apoptosi. L interazione con IRF-1 (Interferon Regulatory Factor 1) blocca la trascrizione di geni codificanti per proteine immunitarie indotta da IFN e contribuisce all evasione immunitaria del virus.

13 Interazione della proteina E6 di HPV con p53 La proteina p53 sopprime la crescita cellulare attivando trascrizionalmente la proteina p21, che inibisce le chinasi del ciclo cellulare cruciali per la progressione del ciclo in G1 p53 bassi livelli M Infezione virale Danneggiamento DNA Stress cellulare G1 S E6 HPV alto rischio: complessa e induce degradazione ubiquitinodipendente della p53 p53 bassi livelli (passaggio in fase S e accumulo p53 alti livelli arresto del ciclo in G1 mutazioni) G2 porta alla degradazione e alla down regolazione delle vie implicate nell arresto del ciclo e apoptosi

14 Proteina E7 si lega alla proteina retinoblastoma (prb), proteina soppressoria della crescita cellulare. interferisce con la regolazione del ciclo cellulare (induce trasformazione) Reprime la trascrizione dei geni implicati nell apoptosi. Inoltre, l interazione con ISGF-3 (Interferon- Stimulated Gene Factor 3) e IRF-1 (Interferon Regulatory Factor 1) causa l evasione delle cellule trasformate dalla risposta immunitaria innata.

15 Interazione della proteina E7 di HPV con prb E2F è un attivatore del ciclo cellulare che è regolato dal legame con prb, un soppressore della crescita della cellule tumorali La proteina E7 di HPV può legare prb In seguito a ciò prb non è più in grado di legare E2F e di regolarlo E2F-1 E7 + E2F-1 prb Repressione della trascrizione G1 E2F-1 E7 prb Complesso inattivo Attivazione della trascrizione e passaggio in fase S pprb inattiva M S pprb inattiva G2 Il risultato è che E2F può liberamente attivare il ciclo cellulare

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19 Proteine strutturali L1 e L2 sono proteine tradotte tardivamente che si assemblano spontaneamente formando il capside icosaedrico. L1 (proteina capsidica maggiore) rappresenta l 80% delle proteine capsidiche. È responsabile dell attacco del virus alle cellule suscettibili ed inoltre media la risposta umorale e cellulo-mediata all infezione L2 (proteina capsidica minore) rappresenta il restante 20% delle proteine capsidiche

20 Il potenziale oncogeno degli HPV il DNA virale è stato ritrovato sia in tumori benigni che maligni. l HPV 16 e 18 causano displasia e papillomi cervicali: almeno l 85% dei carcinomi cervicali contiene HPV integrato. l integrazione porta all inattivazione dei geni E1 e E2, limitando la replica virale e permettendo l espressione dei geni E6 e E7. E6 e E7 sono riconosciuti come oncogeni e si legano alla p53 (E6) e alla prb (E7). in assenza di queste due proteine che controllano la crescita cellulare, la cellula diventa più suscettibile a mutazioni, aberrazioni cromosomiche e subisce la trasformazione oncogena.

21 Patogenesi: verruche I papillomavirus infettano e si replicano nelle cellule dell epitelio squamoso della cute (verruche) e delle membrane mucose (papillomi genitali, orali e congiuntivali) ed inducono proliferazione epiteliale. I tipi di HPV sono tessuto-specifici, causando diverse malattie. La verruca è il risultato della stimolazione della crescita cellulare da parte del virus e dell ispessimento degli strati basale, spinoso e granuloso. I coilociti sono cheratinociti ingranditi con aloni chiari attorno a nuclei raggrinziti. Le verruche si manifestano in 3-4 mesi. L infezione virale rimane localizzata e a volte regredisce spontaneamente, ma può essere ricorrente.

22 HPV Il virus attraversa lo strato della membrana basale attraverso lesioni della pelle. i papillomavirus hanno spiccato tropismo per le cellule epiteliali di cute e mucose. La replicazione virale dipende dallo stato di differenziazione delle cellule.

23 Il ciclo vitale degli HPV si è evoluto per evadere la risposta immune cheratinizzazione rilascio strato corneo strato granuloso strato spinoso strato basale INFEZIONE Maturazione dei virioni Espress. geni tardivi Replicazione genoma (DNA pol cellulare) Proliferazione cellulare Replicazione del DNA Espressione dell E6/E7 Persistenza dell HPV e trasformazione maligna

24 Genoma di HPV e sua espressione nell epitelio

25 L acido nucleico virale si mantiene nelle cellule degli strati basali dove si replica in sincronia col ciclo cellulare (strato spinoso e strato granuloso) L espressione delle proteine del capside avviene solo nello strato più esterno (strato corneo) Le particelle virali sono evidenziabili solo nel nucleo delle cellule degli strati più superficiali dell epidermide.

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27 L infezione da HPV promuove la proliferazione delle cellule spinose (acantosi) che causa un ispessimento della cute e produzione di cheratina (ipercheratosi) portando alla formazione di escrescenze epidermiche.

28 La risposta immune all HPV L immunità innata è la prima linea di difesa contro HPV. L interferone di tipo I esercita una effetto antivirale diretto. E6 e E7 dell HPV16 direttamente inibiscono il segnale dell IFN. L infiammazione è importante per l immunità innata e adattativa. Le proteine precoci dell HPV alterano l espressione dei geni dell MHC di classe I. Cellule NK e macrofagi. La risposta immune adattativa all HPV: La risposta delle cellule T di tipo Th1 è associata con la regressione del papilloma. La risposta immune umorale protegge contro la reinfezione.

29 Clinica verruche cutanee tumori benigni della testa e del collo verruche anogenitali displasie e neoplasie cervicali

30 Verruche Genitali e Verruche Nongenitali Verruche genitali (trasmissione sessuale) Condilomi acuminati - a cavolfiore Verruche genitali - verruche lisce Verruche piane genitali - verruche piane Papulosi bowenoide - piccole, rilevate Verruche non-genitali (non a trasmissione sessuale) Verruche comuni - mani, dita e ginocchi Verruche plantari - Piedi Verruche piane - mani e viso

31 Verruche mucosali non genitali Papilloma laringeo Papilloma congiuntivale Verruche non genitali Plantar warts

32 Verruche genitali

33 Infezione da HPV Infezione si ha in genere tra i 20 e i 30 anni di età L infezione di solito si risolve spontaneamente (nel 90% dei casi si risolve in 2 anni) Alcune infezioni si stabiliscono e si manifestano con anormalità microscopiche. Vengono risolte dal sistema immune dell ospite La persistenza virale può portare al tumore

34 Condizioni per la trasformazione Caratteristiche delle cellule (in relazione con l infezione virale) Proliferazione cellulare Inibizione dell apoptosi Evasione della risposta immune Ruolo di HPV Infezione persistente-replicazione virale Espressione di proteine virali Mutazioni cellulari nell infezione persistente: assenza delle risposte cellulo-mediate dell ospite Interazioni ormonali Cambi nella trasduzione del segnale

35 HPV PUO ESSERE PRESENTE NELLE CELLULE IN MODO: a) RESIDENZIALE minima quantità può persistere non rilevato per anni può essere a basso rischio o alto rischio b) EPISOMALE l HPV è attivo localizzato nel nucleo della cellula è separato dal DNA umano può essere a basso rischio o ad alto rischio può causare pap test anormali può essere visto colposcopicamente c) INTEGRATO HPV-DNA circolare: è aperto e s integra nel DNA umano solo tipi ad alto rischio causa Pap test anormali visti colposcopicamente possono essere trattati per prevenire il tumore

36 a) RESIDENZIALE Poche cellule basali infettate da HPV Limitata riproduzione di HPV

37 b) EPISOMALE Rilascio di particelle virali Virioni di HPV multipli per cellula 8 Settimane L1/ L2 proteine del capside assemblaggio. La replica del DNA virale continua rapidamente 6 Settimane Espressione geni precoci E6/E7 4 Settimane Espressione geni precoci E4/E5 HPV Cellula basale

38 c) INTEGRATO HPV DNA Integrato nel genoma CIN 3 CIN 3 Cancro

39 c) INTEGRATO

40 Replicazione e trascrizione di HPV nell epidermide. Infetta le cellule dello strato basale dell epidermide (basso livello di trascrizione e replicazione). L amplificazione del DNA e le proteine del capside vengono prodotte nello strato spinoso superiore. La trascrizione aumenta nello strato spinoso. Le squame rilasciate in superficie rilasciano particelle virali.

41 HPV: epidemiologia HPV è resistente all inattivazione e può essere trasmesso per contatto con oggetti contaminati, superfici di banconi, o mobili, pavimenti del bagno asciugamani. L eliminazione asintomatica del virus può promuovere la trasmissione. Le infezioni da HPV vengono trasmesse: a) per contatto diretto e tramite piccole lacerazioni cutanee o delle mucose; b) durante rapporti sessuali c) durante il passaggio del neonato attraverso il canale del parto infetto.

42 Papillomavirus umani (HPV): classificazione Sono stati identificati più di 150 genotipi di HPV (35 genitali) [denominazione: HPV + numero] Un nuovo isolato per essere classificato come nuovo genotipo di HPV deve avere una omologia inferiore al 90% nella sequenza nucleotidica della regione L1 rispetto alla sequenza corrispondente del genoma dei tipi conosciuti Un sottotipo è classificato come tale quando l omologia è compresa tra 90% e 100% (tra 98% e 100% si parla di variante) DIVERSI GENOTIPI SONO ASSOCIATI A DIVERSE PATOLOGIE

43 Associazione tra lesioni cutanee e genotipi di HPV

44 Associazione tra lesioni mucose e genotipi di HPV VIE RESPIRATORIE: Papillomi Ca. laringo-bronchiali CONGIUNTIVA: Papillomi CAVITA ORALE: Iperplasia epiteliale focale Ca. oro-faringei TRATTO GENITALE: Condilomi acuminati Condilomi piani Papulosi bowenoide Ca. vulvari, penieni, anali Ca. cervice uterina 6, 11 16, 18 6, 11 13, 32 16, 18 6, 11 6, 11, 16, 18, , 18, 31, 33, 39, 40, 59, 68 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 67, 68, 71, 74

45 HPV e neoplasia cervicale HPV alto rischio: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 HPV basso rischio: HPV 6, 11, 26, 42, 43, 44, 53, 54, 55, 62, 66

46 Lesioni ano-genitali da HPV Condilomi acuminati e piani a livello dei genitali maschili (pene, scroto) e femminili (cervice uterina, vagina, vulva) e in regione perianale [HPV 6, 11, 16, 18, ecc.] Carcinomi cervicali, vulvari, anali e del pene (e lesioni intraepiteliali squamose [SIL] che li precedono) [HPV 16, 18, 31, 33, 39, 45, 52, 58, ecc.]

47 Prevalenza delle infezioni genitali da HPV Infezione a trasmissione sessuale più frequente nell uomo (50% della popolazione attiva sessualmente è stata infettata da HPV) Correlata al numero e alla frequenza dei partner Correlata all età (massima tra i 15 e i 25 anni) Correlata allo stato immunitario (maggiore in pazienti HIV positivi, in donne in gravidanza) Correlata alle abitudini di vita (fumo, alimentazione, contraccettivi orali)

48 HPV e carcinoma della cervice Prevalenza del 97%-99.7% di DNA di HPV nei carcinomi della cervice (in PCR) I carcinomi della cervice correlati ad HPV sono associati: il 53% al 16 il 15% al 18 il 9% al 45 il 6% al 31 e il 3% al 33

49 Cofattori della progressione tumorale Fattori genetici (anormalità di struttura o numeriche dei cromosomi, riarrangiamenti o sovraespressione di oncogeni cellulari) Antigeni HLA (associazione HLA-cl.IID con carcinoma della cervice) Immunodepressione (infezione da HIV) Coinfezioni con altri virus o microrganismi (HSV-2, Clamidia) Numero dei parti Fumo Contraccettivi orali Fattori ormonali Dieta (assenza di carotenoidi, vitamina C)

50 Storia naturale dell infezione di HPV L infezione persistente ha un ruolo importante per lo sviluppo della neoplasia cervicale.

51 Neoplasia cervicale: progressione della malattia Mesi Anni Dopo 30 anni Epitelio Normale Infezione HPV Coilocitosi CIN1 CIN2 CIN3 Carcinoma Screening Trattamento ASCUS / LSIL HSIL ASCUS: cellule squamose atipiche di significato non determinato SIL = Lesione intraepiteliale squamosa (low/high) CIN: Cervical Intraepithelial Neoplasia

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53 Persistenza dell infezione HPV In circa dell 1% dei casi il virus tende a persistere. L infezione attiva riemerge dalla latenza durante una immunodeficenza associata a: Gravidanza Radiazioni solari Stress emozionale Stress fisico HIV Chemioterapia antitumorale

54 Diagnosi Verruca: al microscopio si osserva il caratteristico aspetto istologico che consiste in una iperplasia delle cellule spinose e in un eccesso di produzione di ipercheratosi. Pap test: presenza di cellule epiteliali squamose coilocitiche (citoplasma vacuolizzato) che sono arrotondate e a gruppi. Acido acetico al 4% (la papula diventa bianca) Sequenza diagnostica: Pap test colposcopia PCR

55 Diagnosi: Pap Smears I cambiamenti citologici associati con infezione HPV rappresentano le basi dello screening con gli strisci del Papanicolau. Il prelievo delle cellule dalla cervice e l esame morfologico di esse per identificare segni di malignità. La diagnosi con il Pap-test permette di osservare ASCUS durante lo screening cervicale. Questa diagnosi è un indicatore dell anormalità cellulare ma non è sufficiente per una diagnosi definitiva di una lesione intraepitelaile squamosa. A donne che hanno queste anormalità si consiglia una biopsia colposcopica.

56 Diagnosi microbiologica di infezione: tests molecolari esistono diversi sistemi basati sulla PCR per evidenziare genoma di HPV in campioni biologici (tamponi cervicali e in campioni istologici)

57 Treatments for high risk HPV Colposcopia LEEP (loop electrosurgical excision procedure: procedura di escissione con elettrocauterizzazione) In alternativa metodi chimici (podofillina dal 10-25%) Laser Crioterapia chirurgica (per rimuovere le verruche) Chirurgia generale Stimolatori della risposta innata o infiammatoria quali: IFN o l imiquimod (Aldara), Cidofovir Vaccini (Gardasil)

58 Vaccini SOURCE: Merck and GSK. Science Magazine, Vol. 308, Issue 5722, pages , 29 April 2005

59 Proprietà delle proteine del capside del virus HPV L1 La proteina L1 può autoassemblarsi in particelle virus-simili (VLPs) che sono antigenicamente identiche ai virioni. Capside naturale: L1+L2 +DNA Capside costituito solo da L1 GSK: il vaccino anti-hpv contiene HPV L1 virus-like particles (VLPs) non-infettante Proteina ricombinante L1 altamente immunogeno

60 HPV L1 Virus-Like-Particle (VLP) Sintesi del vaccino L1 gene dell HPV DNA Inside HPV HPV Capside virale vuoto (VLP) Induce una risposta immune dell ospite L1 gene inserito nel plasmide Trascrizione mrna Traduzione Proteine del capside Cellula eucariotica

61 immunità aspecifica L1 Assemblaggio dei virus Infezione Immunità umorale Vaccini Preventivi per prevenire l acquisizione dei Papilloma Virus E4 E1, E2, E5, E6, E7 Replica del DNA virale Entrata del virione Immunità cellulomediata Vaccini Terapeutici per lesioni da Papilloma Virus già presenti

62 Vaccini Preventivi La protezione conferita dai vaccini è tipospecifica e specie-specifica. Non si conosce la durata della protezione. Tali vaccini non sono efficaci se somministrati dopo il contatto con il virus. Devono essere vaccini polivalenti. Devono essere somministrati prima dell inizio dell attività sessuale.

63 Il vaccino HPV Approvato per le femmine di età dai 9-26 anni 3 dosi a 0, 2, e 6 mesi Minimi intervalli: 4 settimane tra la prima e la seconda dose 12 settimane tra la seconda e la terza dose.

64 Vaccini Terapeutici Sono allo studio anche vaccini in grado di stimolare la risposta immunitaria nei confronti delle oncoproteine virali con lo scopo di indurre l eliminazione dei virus in replicazione o di eradicare tumori indotti dall'hpv. Studi su animali hanno fornito dati sull'efficacia dell'utilizzo di proteine virali (E2, E6 ed E7) come vaccini immunoterapeutici per verruche e tumori associati ai papillomavirus.

65 Vaccini terapeutici Recenti studi hanno mostrato il possibile uso di cellule dendritiche caricate con HPV E7 come vaccino in grado di stimolare una risposta immunitaria citotossica (CTL, NK) contro le cellule del cancro della cervice.

66 Polyomaviridae I polyomavirus umani (virus BK, JC) sono ubiquitari, non causano malattia. Sono virus che hanno il diametro di 45 nm (5.000 paia di basi). I genomi dei virus BK e JC e SV40 sono strettamente correlati e suddivisibili in regioni precoci,tardive e non codificanti. La regione precoce di un filamento codifica le proteine non strutturali T (trasformazione) T grande e T piccolo La regione tardiva che codifica per 3 proteine del capside virale (VP1,VP2,VP3). La regione non codificante comprende l ORI di replicazione e le sequenze di controllo della trascrizione sia dei geni precoci che tardivi.

67 Polyomavirus genome

68 Replica dei Polyomavirus Stadi del ciclo di replica virale: a) Attacco del virione sulla cellula b) Entrata per endocitosi; c) Denudamento; d) Trasporto nel nucleo della cellula ospite e) Trascrizione e formazione di mrna precoci f) Traduzione delle proteine precoci (antigene T) g) Replica del DNA virale h) Trascrizione degli mrna tardivi i) Traduzione delle proteine tardive (proteine del capside) l) Assemblaggio della progenie virale con le proteine strutturali nel nucleo; m) Entrata dei virioni nelle vescicole citoplasmatiche; n) Rilascio dei virioni per fusione delle vescicole con la membrana cellulare; o) Rilascio dei virioni.

69 Patogenesi dei Polyomavirus

70 Epidemiologia Le infezioni da Poliomavirus sono frequenti e la maggior parte della popolazione viene infettata sia dal virus BK che dal JC entro i 15 anni di età. La trasmissione avviene per via respiratoria. Le infezioni latenti possono essere riattivate in immunodepressi, quali malati di AIDS, trapiantati, o donne in gravidanza. Il 10 % dei pazienti con AIDS sviluppa PML, letale nel 90% dei casi.

71 Clinica L infezione primaria è asintomatica. I virus BK e JC sono riattivati in pazienti immunocompromessi come dimostrato dalla presenza del virus nelle urine nel 40% di questi pazienti. I virus sono riattivati anche durante la gravidanza, ma non sono stati riscontrati effetti sul feto. Sembra che il virus BK sia associato alla stenosi ureterale osservata nei trapiantati di midollo osseo. La leucoencefalopatia multifocale progressiva (PML) è una malattia demielinizzante subacuta causata dl virus JC che si manifesta nei soggetti ID. La PML si manifesta con sintomi neurologici come la parola, la vista, la coordinazione, le facoltà mentali, paralisi degli arti ed infine la morte. La morte si ha nel giro di 2 anni.

72 Diagnosi di Laboratorio La PML viene diagnosticata tramite la PCR nel liquor e con la dimostrazione di lesioni mediante risonanza magnetica oppure la TAC. L esame istologico di tessuto cerebrale mostra focolai di demielinizzazione circondati da oligodendrociti con inclusioni adiacenti alle aree di demielinizzazione. Lesioni nella sostanza bianca. La risposta infiammatoria è minima. Il JC può essere identificato in campioni di urine, liquor o materiale bioptico mediante IFI, PCR, Esame citologico delle urine rilevano la presenza dei virus BK e JC con l osservazione di cellule ingrandite con inclusioni intranucleari basofile.

73 Terapia profilassi e controllo Nessuna terapia Difficoltà nella prevenzione