ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLE REGIONI LAZIO E TOSCANA

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1 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLE REGIONI LAZIO E TOSCANA Relazione conclusiva del progetto di ricerca corrente: ORGANIZZAZIONE DI UN SISTEMA DI SORVEGLIANZA NAZIONALE EPIDEMIOLOGICO MOLECOLARE PER IL CONTROLLO DELL INFEZIONE DA VIRUS DELL ANEMIA INFETTIVA EQUINA Identificativo progetto: IZS LT 02/03 RC; Responsabile scientifico Dr. Riccardo Forletta

2 Elenco delle 2 di 27

3 INDICE Premessa Pag. 5 Allestimento e definizione di un piano di sorveglianza Pag. 6 di AIE nel territorio Introduzione Pag. 8 La malattia Pag. 8 La diagnosi Pag. 9 Materiali e metodi Pag. 11 Messa a punto di test molecolari per la diagnosi di AIE Pag. 11 Estrazione degli acidi nucleici dai campioni in esame Pag Estrazione di DNA da tessuti e pellet di colture cellulari Pag Estrazione di DNA da sangue (buffy coat) Pag Estrazione di RNA da plasma Pag. 14 Saggi molecolari per la ricerca del genoma virale Pag Controllo positivo Pag Protocolli di amplificazione Pag. 15 Nested PCR Pag. 15 RT-nested PCR Pag. 17 Real-Time TaqMan PCR Pag. 18 Sviluppo di algoritmi diagnostici per definire la provenienza Pag. 19 geografica del ceppo EIAV 3 di 27

4 Risultati e discussione Pag. 21 Nested PCR Pag. 21 RT-Nested PCR Pag. 22 Real-Time TaqMan PCR Pag. 23 Conclusioni Pag. 25 Bibliografia Pag di 27

5 controllo dell infezione da virus dell Anemia Infettiva Equina - Premessa Premessa Nel 2004 il Centro di Referenza Nazionale Anemia Infettiva Equina (CRAIE) dell Istituto Zooprofilattico Sperimentale Lazio e Toscana Sezione di Pisa ha iniziato un attività di ricerca in collaborazione con il Centro Retrovirus, Dipartimento di Patologia Sperimentale, Biotecnologie Mediche, Infettivologia ed Epidemiologia dell Università di Pisa. La ricerca è finalizzata all introduzione di tecniche biomolecolari nella diagnostica dell infezione da virus dell Anemia Infettiva Equina (AIE), che consentirà di rafforzare il sistema di sorveglianza della malattia. I protocolli di analisi messi a punto infatti consentiranno di identificare, quantificare e sequenziare il genoma del virus in animali infetti e le informazioni ottenute di definire lo stato di infezione e malattia (fase acuta e cronica) degli animali interessati. Il progetto prevede, oltre al lavoro sperimentale vero e proprio, un azione di coordinamento ed istruzione su modalità di raccolta ed invio dei campioni da parte dei centri preposti. Per tutta la durata del progetto il CRAIE, grazie alla collaborazione dei diversi Istituti Zooprofilattici Sperimentali (II.ZZ.SS.), ha coordinato un attività di raccolta, di materiale biologico (campioni di sangue ed organi) dei soggetti sieropositivi macellati in seguito all adozione dei provvedimenti di polizia veterinaria. I campioni si sono rivelati di fondamentale importanza per la messa a punto di metodi per la diagnosi molecolare rapida di AIE come previsto dal progetto. I campioni biologici finora raccolti dal CRAIE, conservati a -80 C, sono stati utilizzati per la messa a punto della metodica di diagnosi diretta di AIE mediante Polymerase Chain Reaction (PCR). Il lavoro sperimentale si articola essenzialmente nei seguenti punti: 1. Allestimento di un protocollo di diagnosi molecolare rapida di infezione da virus dell AIE; Questo obiettivo è a sua volta diviso i tre punti distinti: a) Estrazione degli acidi nucleici dai campioni in esame; b) Saggi molecolari per la ricerca del genoma virale; c) Analisi dei prodotti di reazione ed interpretazione dei risultati. 5 di 27

6 controllo dell infezione da virus dell Anemia Infettiva Equina - Premessa 2. Allestimento di un protocollo di rilevazione quantitativa del genoma di virus AIE; 3. Sviluppo di algoritmi diagnostici per definire la provenienza geografica dei ceppi AIE in esame. I protocolli definiti ai punti 1 e 2 consentiranno di effettuare diagnosi diretta qualitativa e quantitativa di AIE in soggetti con infezione in fase acuta e cronica. Allestimento e definizione di un piano di sorveglianza di AIE nel territorio Per condurre approfondimenti di tipo epidemiologico sulle positività per AIE riscontrate a livello nazionale il CRAIE ha utilizzato le schede anamnestiche messe a punto a tal fine. Nell ambito del sistema di sorveglianza per il controllo dell infezione sul territorio sono state predisposte dal CRAIE le seguenti schede: 1. scheda invio campioni per diagnosi di AIE 2. scheda anamnestica focolaio AIE 3. scheda segnalamento animali presenti nel focolaio 4. scheda modalità di prelievo materiale biologico da equidi presenti nel focolaio di AIE La prima scheda accompagna i campioni che vengono inviati dagli altri laboratori al CRAIE per la conferma sierologica di AIE, come previsto dalla normativa, e contiene informazioni specifiche relative al soggetto ed all allevamento di provenienza. La conferma di sieropositività per AIE è seguita dal controllo di tutti i soggetti presenti nell azienda di origine del capo positivo. La seconda scheda, di anamnesi vera e propria, consente di raccogliere informazioni relative all allevamento, ovvero: tipologia, consistenza, recenti scambi e movimentazioni. Nella terza scheda è riportata una tabella per il segnalamento dei soggetti presenti nell allevamento infetto. La compilazione di questa scheda, che completa la fase anamnestica, dovrebbe consentire di formulare ipotesi sull origine del focolaio. La quarta ed ultima scheda è un modulo di accompagnamento di campioni biologici che vengono inviati al CRAIE per effettuare la ricerca diretta del virus mediante tecniche di biologia molecolare. 6 di 27

7 controllo dell infezione da virus dell Anemia Infettiva Equina - Premessa Tali schede, di seguito allegate, sono state inoltrate al Ministero della Salute per la distribuzione agli II.ZZ.SS., al fine di acquisire informazioni utili sui focolai di AIE presenti in Italia e per verificarne la reale possibilità d impiego per una raccolta dei dati più uniforme e completa. 7 di 27

8 Organizzazione di un sistema di sorveglianza epidemiologico-molecolareper il Introduzione Introduzione La malattia L AIE è una malattia virale diffusa in tutto il mondo causata da un lentivirus, della famiglia Retroviridae, che colpisce gli equidi (cavallo, asino, mulo, bardotto). La prima segnalazione nel cavallo dell AIE risale al ed il virus dell AIE è stato tra i primi agenti filtrabili, come allora erano definiti i virus, ad essere associato ad infezione 2. La principale fonte di virus è rappresentata dai soggetti infetti; secreti ed escreti (latte, colostro, scolo nasale) possono rappresentare una fonte di virus e giocare un ruolo significativo nella trasmissione diretta della patologia durante le fasi viremiche. La trasmissione indiretta del virus mediata dagli insetti vettori, in particolare i Tabanidi, costituisce la via di contagio più comune ed importante dal punto di vista epidemiologico dell infezione 3-4. Altra via di trasmissione dell infezione da virus dell AIE da considerare è rappresentata dalla via iatrogena, attraverso strumenti contaminati ed emoderivati. Alla base di alcuni casi clinici di AIE, seguiti a volte da decessi, verificatisi nel 2006 in Toscana vi è stato proprio l utilizzo di emoderivati non controllati. L AIE, dopo un periodo di incubazione variabile che può durare da 5-7 giorni fino a 3 mesi, insorge con un infezione di tipo acuto che si risolve generalmente in pochi giorni, e poi evolve in una forma asintomatica attraverso un infezione cronica attiva caratterizzata da cicli viremici associati a febbre 3. La forma acuta dell infezione è caratterizzata da febbre con una consistente riduzione del numero di piastrine 4. I soggetti che sopravvivono agli episodi clinici iniziali dopo la viremia primaria sviluppano la fase cronica dell infezione, caratterizzata da episodi ricorrenti di febbre, associati ad attiva replicazione del virus; gli accessi febbrili sono accompagnati da trombocitopenia, anemia, edema, ittero e perdita di peso, che possono essere anche associati a miocardite, meningite, problemi a livello di fegato, rene ed apparato gastroenterico 3. La fase cronica evolve infine nella maggior parte dei soggetti in una forma inapparente o asintomatica della malattia. Il bersaglio principale del virus è costituito da cellule della linea monocito-macrofagica le quali, essendo per lo più circolanti, distribuiscono il virus a tutti i distretti 8 di 27

9 Organizzazione di un sistema di sorveglianza epidemiologico-molecolareper il Introduzione dell organismo. Il virus lo si ritrova infatti principalmente in milza, fegato, polmone, linfonodi e midollo osseo. I monociti sono permissivi all ingresso del virus, ma è la differenziazione in macrofagi che ne consente la replicazione. In queste cellule il virus dell AIE integra il proprio genoma garantendo la persistenza dell infezione virale 4. Le lesioni macroscopiche riscontrabili, variabili e condizionate dal tipo di infezione, sono rappresentate essenzialmente da: epatomegalia, splenomegalia, miocardite, fenomeni emorragici a livello di membrane sierose e mucose. Le lesioni istopatologiche consistono in proliferazione di cellule linfoidi con infiltrazione in differenti organi e presenza di sideroleucociti (macrofagi contenenti emosiderina, catabolita dell emoglobina) 3. I sintomi scompaiono in genere entro un anno ed il soggetto infetto rimane portatore asintomatico dell infezione per tutta la vita; la fase asintomatica dell infezione è caratterizzata da una limitata replicazione virale con assenza di manifestazioni cliniche proprio grazie all efficace attività immunitaria dell ospite. Farmaci ad azione immunosoppressiva come il desametasone sono in grado di indurre una recrudescenza della malattia 4. Come per altre infezioni lentivirali vi è una risposta cellulo-mediata iniziale che interviene nel controllo della fase acuta dell infezione ed una umorale che persiste per tutta la vita e che è diretta soprattutto verso proteine strutturali virali quali la p26 (proteina capsidica) e le glicoproteine dell envelope gp45 e gp90. E' da sottolineare che data la immunogenicità ed i livelli di produzione della proteina p26 e della gp90, gli anticorpi contro queste due proteine compaiono più precocemente rispetto a quelli contro gp45 e proteine non strutturali quali la trascrittasi inversa (reverse transcriptase, RT). La diagnosi La diagnosi di AIE in Italia si basa attualmente su metodi sierologici. I metodi di screening previsti per la diagnosi sierologica di AIE sono l immunodiffusione in gel di agar (AGID) e l enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) come indicato dall OIE (Manuale OIE th Edizione) 9. Fra i diversi test ELISA messi a punto e disponibili in commercio, è raccomandabile l uso di metodi che prevedano l impiego 9 di 27

10 Organizzazione di un sistema di sorveglianza epidemiologico-molecolareper il Introduzione della proteina capsidica p26 dato l elevato grado di conservazione antigenica della stessa nei virus circolanti. Il limite del test ELISA è il possibile riscontro di falsi positivi, per cui la positività deve essere confermata mediante un test di immunodiffusione in gel di agar in grado di rilevare la presenza di anticorpi diretti contro la proteina del capside p26. Questo test, noto anche come Test di Coggins 5-6-7, parzialmente modificato dall OIE (Manuale OIE th Edizione) 9, è il test per la conferma ufficiale di positivi (D.M. 4 dicembre 1976 e O.M. 14 novembre 2006) La tecnica è caratterizzata da un elevato limite di rivelabilità 11 e specialmente per alcuni sieri la soggettività e l esperienza dell operatore assumono un importanza determinante per l interpretazione dello stesso. Indipendentemente dal metodo, un importante limite inerente ai test sierologici è l esistenza di un periodo finestra di almeno due settimane dal contagio. In questo caso il soggetto, pur avendo infezione ed attiva replicazione virale in atto, non ha ancora anticorpi in circolo e con i test sierologici risulterà pertanto negativo. In ragione di ciò è sempre più frequente il ricorso e lo sviluppo di sistemi di diagnosi diretta. In questo ambito, l avvento di tecniche molecolari altamente sensibili e specifiche ha dato grande impulso al settore consentendo di ridurre notevolmente il periodo finestra e di rilevare la presenza di infezioni virali altrimenti sfuggite con test convenzionali. Il nostro progetto si propone quindi di approfondire l indagine sierologica per AIE e di superarne i limiti descritti mediante lo sviluppo di test molecolari rapidi, di facile esecuzione e interpretazione dei risultati per ricerca/quantificazione del genoma del virus AIE in campioni di plasma e tessuti diversi di equini. 10 di 27

11 Materiali e metodi Materiali e metodi Messa a punto di test molecolari per la diagnosi di AIE Un attenta ed approfondita ricerca bibliografica degli articoli scientifici disponibili on-line su PubMed ha consentito di evidenziare che la maggior parte dei saggi molecolari sono stati sviluppati sul gene gag, regione del genoma virale altamente conservata Da questa osservazione e sulla base dell allineamento delle sequenze del virus AIE presenti nelle banche dati mondiali sono state definite le porzioni dell open reading frame gag altamente conservate. Dalla banca dati di sequenze nucleotidiche GenBank sono state acquisite le sequenze di alcuni isolati virali del virus dell AIE (EIAV - accession number NC_001450; EIAV AF033820; EIAV - AF247394; EIAV - AF327878; EIAV Liaoning - AF327877; EIAV UK - AF016316; EIAV pspeiav19 - U01866; EIAV wenv16 - AF028231; EIAV wenv17 AF028232). Mediante il programma Primer express, sono state quindi disegnate due coppie di primer per diagnosi molecolare qualitativa dell infezione con nested PCR ed un set di primer e sonda per l allestimento di saggi quantitativi mediante TaqMan Real- Time PCR: Primer per nested PCR su gag del virus AIE (I step): Primer esterni: - Senso: 5' CTA CTT GGG TGA ATA CCA TAC AGA CAA A - 3' (posizione a partire dall ATG di gag del ceppo Wyoming) - Antisenso: 5' TGT CTC TGC AAG CAT ACA TTT TCT C - 3' (posizione ) Primer per nested PCR su gag del virus AIE (II step): Primer interni: - Senso: 5' ATG AAT GCA TTT TTG GAT GTG GT - 3' (posizione ) - Antisenso: 5' CCT CAT TTG CGT TCT GAA TAG TCA - 3' (posizione ) 11 di 27

12 Materiali e metodi Primer per TaqMan Real-Time PCR su gag del virus AIE: - Senso: 5' ATT ACC GAA TGC TCC ACT GGT G - 3' (posizione ) - Antisenso: 5' GTC TAT ATG TCT GCC TAA ACT GAT CAA AAG- 3' (posizione ) - Sonda: 5' FAM - CAC CAC CAC AAG GGC CTA TTC CCA T- TAMRA - 3' (posizione ) Con il suddetto programma è stata disegnata anche una coppia di primer da utilizzare per l amplificazione del gene cellulare codificante il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α), scelto per valutare l amplificabilità del DNA genomico estratto dal tessuto e quindi utilizzabile come controllo di estrazione: PCR per TNF-α equino: - Senso: 5' ACC CCA AGT GAC AAG CCT GTA - 3' (posizione ) - Antisenso: 5' TTG ACC TTG GAC GGG TAG GA - 3' (posizione ) Estrazione degli acidi nucleici dai campioni in esame - Estrazione di DNA da tessuti e pellet di colture cellulari Per valutare la positività dei campioni di tessuto, è stato estratto, mediante protocollo di estrazione in fase organica con fenolo-cloroformio, il DNA da tessuti linfoidi (milza e linfonodo meseraico) di equini già positivi per anticorpi anti-virus AIE rivelati con AGID - effettuato sia con Test di Coggins (D.M. 4 dicembre 1976) 8 che con metodo OIE (Manuale OIE th Edizione) 9 - e al test ELISA I tessuti, ancora congelati, sono stati pesati e successivamente, mantenendoli in ghiaccio, frammentati il più possibile con bisturi o forbici. 12 di 27

13 Materiali e metodi I frammenti ottenuti da ogni tessuto sono stati poi trasferiti in un omogeneizzatore a mano (Potter), anch esso sterile, e ad essi è stato aggiunto TNE, tampone di estrazione per il DNA (NaCl 100mM; Tris-HCl 10 mm a ph=7.5; EDTA 1 mm), nella quantità di 1 ml per un frammento di tessuto del peso di circa 0,12 g, ottenendo una soluzione densa. Alla sospensione è stata aggiunta la proteinasi K, l enzima in grado di degradare le proteine, alla concentrazione finale di 200 µg/ml. Dopo omogeneizzazione, il tutto è stato trasferito in una provetta di polipropilene e, per emulsionare i lipidi, è stato aggiunto un detergente, il sodio dodecilsolfato (SDS) alla concentrazione finale dell 1%. Al pellet di colture cellulari fresco o congelato, è stato aggiunto TNE (500 µl-1ml) e proteinasi K 200 µg/ml e, una volta risospesi completamente con il vortex, è stato aggiunto SDS alla concentrazione finale dell 1%. I campioni sono stati quindi incubati a 55 C per 2-3 ore, oppure a 37 C per una notte, per permettere la completa digestione delle membrane cellulari e la distruzione delle proteine. Successivamente il DNA è stato purificato mediante la seguente procedura: dopo aggiunta di un ugual volume di soluzione acquosa di fenolo a ph=8, saturata con Tris- HCl, la sospensione risultante è stata centrifugata a 400 g per 10, ottenendo la formazione di due fasi, una acquosa, contenente il DNA, ed una organica contenente impurità, membrane cellulari e proteine; la fase acquosa surnatante, addizionata di una soluzione di fenolo-cloroformio (1:1), è stata sottoposta ad ulteriore centrifugazione, usando i precedenti parametri. La soluzione acquosa ottenuta da questa seconda centrifugazione è stata, a sua volta, sottoposta ad una terza centrifugazione, dopo addizione di una soluzione di alcool isoamilico:cloroformio (1:24). Normalmente la procedura descritta fornisce soluzione acquose di DNA sufficientemente pure; in caso contrario, è necessario ripetere alcuni dei precedenti passaggi. La fase acquosa è stata poi trasferita in altra provetta, dove il DNA è stato precipitato per aggiunta di una soluzione acquosa di acetato di sodio 3 M a ph=5.5 e di etanolo assoluto, raffreddato a 20 C, nelle proporzioni, rispettivamente di 0,1 e di 2 volumi per volume della soluzione di DNA. Il DNA estratto, dopo incubazione a 20 C per una notte oppure a 80 C per 30, si presenta sotto forma di una matassa bianca, filamentosa e viscosa. 13 di 27

14 Materiali e metodi Il DNA estratto, prelevato con una pipetta Pasteur ripiegata ad uncino ed opportunamente sterilizzata alla fiamma, è stato quindi trasferito in un altra provetta, sottoposta a centrifugazione (28000 g per 15 a 4 C) dopo aggiunta di etanolo acquoso al 70%. Il pellet ottenuto è stato asciugato sotto vuoto e ridisciolto in µl di acqua distillata. La qualità dell acido nucleico estratto è stata controllata mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio all 1% e la concentrazione calcolata in seguito a lettura spettrofotometrica dell assorbanza a 260 nm. - Estrazione di DNA da sangue (buffy coat) Per questo materiale è stato sviluppato un sistema di estrazione che prevede una prima centrifugazione del sangue in EDTA a 2500 g per 10 e separazione della frazione di sangue contenente i leucociti (buffy coat). Dal buffy coat, fresco o scongelato dopo conservazione a -20 C, è stato estratto il DNA genomico utilizzando il QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN) e, in parallelo, il protocollo classico di estrazione in fase organica con fenolo-cloroformio. Entrambi i sistemi si sono rivelati in grado di estrarre il DNA con buona efficienza ma il protocollo con fenolo-cloroformio, anche se ben più laborioso, permette di ottenere una maggiore quantità di DNA rispetto all estrazione con il kit. In ogni caso, poichè il kit commerciale utilizzato fornisce del DNA in tempi rapidi con buon grado di purezza e in quantità comunque sufficiente ai nostri fini, è stato scelto come metodo di routine per le estrazioni da sangue seguendo correttamente le indicazioni fornite dalla ditta produttrice. - Estrazione di RNA da plasma Per la diagnosi di AIE mediante PCR in equidi con infezione in fase acuta è stato utilizzato il plasma ottenuto da sangue di equini già positivi agli esami sierologici. Per questo materiale è stato sviluppato un sistema di estrazione che prevede una prima centrifugazione del sangue in EDTA a 2500 g per 10 e separazione del plasma dalla frazione di sangue contenente i leucociti (buffy coat). 14 di 27

15 Materiali e metodi Dopo aver consultato attentamente una serie di fonti bibliografiche e protocolli in uso per la diagnosi di infezione da virus dell immunodeficienza umana (HIV) 15, per concentrare la quantità di virus eventualmente presente nel campione e migliorarne la qualità riducendo la presenza di precipitati proteici, è stato messo a punto un sistema che prevede, a partire da 2 ml di plasma, una prima centrifugazione a 5000 g per 15' a 4 C per chiarificare il plasma ed una seconda centrifugazione del surnatante ottenuto a g per 2 h a 4 C. Il pellet ottenuto, risospeso in 140 µl di acqua sterile, è stato utilizzato per l estrazione dell RNA genomico virale. Dal plasma, fresco o scongelato dopo un periodo di conservazione a -80 C, è stato estratto l RNA virale utilizzando il kit commerciale QIAamp RNA Viral Mini kit (QIAGEN) seguendo le indicazioni fornite nel kit. Saggi molecolari per la ricerca del genoma virale - Controllo positivo pgem3zf(+): 1,6kb-BamHI-XbaI è stato linearizzato con Hind III (sito di restrizione immediatamente a valle dell inserto), poi purificato mediante estrazione con solventi organici e precipitazione in etanolo, secondo metodiche standard µg del linearizzato sono stati sottoposti a reazione di trascrizione in vitro mediante kit commerciale (Promega), secondo le indicazioni fornite dalla ditta produttrice. Il prodotto della trascrizione (RNA), controllata dal promotore T7 e di circa 1600 nt è stato controllato su gel di agarosio all 1% e la sua concentrazione è stata calcolata in seguito a lettura spettrofotometrica dell assorbanza a 280 nm. - Protocolli di amplificazione Nested PCR Come previsto dal progetto è stato allestito un protocollo di nested PCR per la diagnosi diretta qualitativa di AIE in equidi con infezione in fase cronica mediante ricerca del DNA provirale in campioni di tessuti e sangue (buffy coat). 15 di 27

16 Materiali e metodi Nested PCR su gag del virus AIE I step: Fase Temperatura Tempo Denaturazione 94 C 2 94 C 30 Amplificazione 60 C 30 (35 cicli) 72 C 40 Estensione finale 72 C 10 Nested PCR su gag del virus AIE II step: Fase Temperatura Tempo Denaturazione 94 C 2 94 C 30 Amplificazione 60 C 30 (25 cicli) 72 C 30 Estensione finale 72 C 10 I DNA estratti sono stati analizzati per grado di amplificabilità ed assenza di inibitori della reazione mediante PCR per TNF; è stata quindi effettuata la nested PCR per AIE. Le condizioni di amplificazione del protocollo sono state messe a punto sul costrutto pgem3zf(+): 1,6kb-BamHI-XbaI. Il DNA plasmidico è stato sottoposto allo stesso trattamento dei campioni ed utilizzato per definire sensibilità e specificità della nested- PCR. In particolare, 5 µl di diluizioni crescenti a concentrazione nota di pgem3zf(+): 1,6kb-BamHI-XbaI sono stati aggiunti a 45 µl della seguente miscela di nested PCR I step: 5 µl di 10x reaction buffer (Polymed); MgCl 2 1,5 mm (Polymed); dntps 0,2 mm (Finnzymes); 0,4 µm ciascuno dei primer Senso ed Antisenso; 0,2 µl (1U) dell enzima Taq polimerasi (Polymed). 3 µl del prodotto di nested PCR I step sono stati trasferiti in 47 µl della miscela di nested PCR II step del tutto identica a quella del I step. 16 di 27

17 Materiali e metodi Al termine dell amplificazione 10 µl della miscela di nested PCR II step sono stati controllati su gel di agarosio all 1%, secondo metodiche standard 16. Le reazioni di amplificazione sono state effettuate utilizzando il termociclizzatore Abi 9700 (Applera). RT-nested PCR Per la diagnosi diretta di AIE mediante PCR è stato utilizzato il plasma ottenuto da sangue di equini già positivi agli esami sierologici. L RNA virale, estratto dal plasma, è stato successivamente esaminato mediante un protocollo che prevede la conversione dell RNA in cdna ad opera della RT combinata alla nested PCR (RT-nested PCR) come descritta nel precedente paragrafo, al fine di rilevare la presenza di particelle virali di AIE libere circolanti nel plasma di soggetti con infezione in fase acuta nei quali il virus è in fase di replicazione attiva. Le condizioni di amplificazione del protocollo di RT-nested PCR sono state messe a punto sull RNA virale. In particolare, 10 µl di diluizioni crescenti a concentrazione nota di acido nucleico sono stati aggiunti a 10 µl della seguente miscela di RT-nested PCR I step: 2 µl di 10x reaction buffer (Finnzymes) e 1 µl di dntps 20 mm (Finnzymes) per ciascun campione in esame; 0,4 µm del primer Antisenso del protocollo di nested PCR I step e 0,4 µl (8 U) di AMV reverse transcriptase (Finnzymes) per ogni campione in esame. Reazione di retrotrascrizione Fase Temperatura Tempo Denaturazione RNA 65 C 5 Retrotrascrizione 42 C 60 Denaturazione cdna 94 C 5 5 µl del prodotto di retrotrascrizione (cdna) sono stati poi trasferiti in 45 µl della miscela di nested PCR I step ed i passaggi successivi sono stati effettuati come indicato in precedenza nel protocollo di nested PCR. 17 di 27

18 Materiali e metodi Real-Time TaqMan PCR Per la quantificazione del virus eventualmente rilevato con nested PCR o RT-nested PCR è stato messo a punto un Real-Time TaqMan PCR da impiegare sia in campioni di tessuti e sangue, che nel plasma. Per tessuti e sangue le condizioni di amplificazione del protocollo sono state messe a punto sul costrutto pgem3zf(+): 1,6kb-BamHI-XbaI. Il DNA plasmidico è stato sottoposto allo stesso trattamento dei campioni come indicato per la nested PCR. In particolare, 5 µl di diluizioni crescenti a concentrazione nota di pgem3zf(+): 1,6kb- BamHI-XbaI sono stati aggiunti a 20 µl della seguente miscela: 12,5 µl di 2x Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystem); 300 nm del primer Senso, 900 nm del primer Antisenso e 0,1 µm di Probe. Le reazioni sono state eseguite con lo strumento Abi Prism 7700 (Applera). Lo stesso metodo è stato applicato su diluizioni scalari di DNA estratto da cellule infette con il virus dell AIE. Tutti i campioni sono stati esaminati in triplicato. Per il plasma le condizioni di amplificazione del protocollo sono state messe a punto sull RNA. In particolare, 10 µl di diluizioni crescenti a concentrazione nota dell RNA sono stati aggiunti a 10 µl della seguente miscela della reazione di retrotrascrizione (RT): 2 µl di 10x reaction buffer (Finnzymes) e 1 µl di dntps 20 mm (Finnzymes) per ciascun campione in esame; 0,4 µm del primer Antisenso del protocollo di nested PCR I step e 0,4 µl (8 U) di AMV reverse transcriptase (Finnzymes) per ogni campione in esame. A questo punto 5 µl di diluizioni crescenti a concentrazione nota del prodotto di retrotrascrizione (cdna) sono stati aggiunti a 20 µl della miscela di reazione per la Real-Time TaqMan PCR in maniera analoga a quanto indicato in precedenza per il controllo positivo pgem3zf(+): 1,6kb-BamHI-XbaI in riferimento a tessuti e sangue. 18 di 27

19 Materiali e metodi Sviluppo di algoritmi diagnostici per definire la provenienza geografica del ceppo EIAV Allo stato attuale questo terzo obiettivo della ricerca non è stato avviato poichè necessita, come condizione indispensabile, l isolamento (amplificazione) di ceppi virali su campioni analitici. In sè la ricerca non presenta particolari difficoltà tenendo conto anche della collaborazione tra CRAIE e Centro Retrovirus. A questa struttura tribunali, magistrature ed altri organi legislativi si affidano per lo studio di parentele genetiche e provenienza geografica di ceppi HIV-1. In particolare, il Centro Retrovirus è stato più volte incaricato da varie Procure per lo studio delle relazioni genetiche tra ceppi HIV-1 trasmessi con atti criminali quali stupri, rapporti sessuali non protetti da parte di soggetti che hanno volutamente o consapevolmente nascosto il loro stato di sieropositività al partner, possibili moventi per omicidi, ecc. La metodologia impiegata, recentemente pubblicata assieme alla descrizione di alcuni di questi casi 15, verranno trasferiti nella ricerca in oggetto. Allo scopo, lo studio verterà sull analisi delle mutazioni e relazioni filogenetiche nella regione ipervariabile env che, per la continua pressione selettiva indotta dall ospite, è soggetta a variazioni continue intra- ed inter-ospite. Ciò si traduce in una distanza genetica che è inversamente proporzionale al grado di parentela tra isolati virali: un ceppo trasmesso a un nuovo individuo inizierà una storia evolutiva propria ed indipendente dal ceppo parentale (cioè l isolato circolante nell individuo che ha trasmesso l infezione), tuttavia, se allineato e calcolata la distanza genetica con altri ceppi, risulterà sempre più simile al ceppo parentale. Lo stesso concetto si applica su ceppi provenienti dalla stessa area geografica (e quindi circolanti nella stessa comunità) che saranno più apparentati tra loro rispetto a ceppi da aree geografiche distanti. Lo studio prevede quindi la raccolta di campioni positivi per il virus AIE per le tecniche molecolari descritte sopra e l amplificazione di regioni env ipervariabili. Gli amplificati verranno sequenziati e le sequenze ottenute allienate con quelle di isolati presenti in banche dati ed altri a provenienza geografica nota. Gli allineamenti verrano poi utilizzati per lo studio delle relazioni filogenetiche e del profilo evolutivo utilizzando programmi di bioinformatica quali PHYLIP v. 3.6, BIOEDIT v.7.0.9, DAMBE v ed altri sviluppati 19 di 27

20 Materiali e metodi ad hoc. Come accennato, si tratta di procedure consolidate ed in uso presso il Centro Retrovirus. Non si prevedono quindi particolari difficoltà nell avvio di questo terzo obiettivo una volta identificati ceppi del virus AIE in campioni analitici. 20 di 27

21 Risultati e discussione Risultati e discussione Come descritto in precedenza la regione del genoma virale scelta come bersaglio dei protocolli di amplificazione è localizzata nell open reading frame gag, altamente conservata tra i diversi isolati del virus dell AIE presenti in GenBank. La specificità dei primer utilizzati è stata verificata confrontando la loro sequenza con le singole sequenze dei virus riportate nella banca dati esaminate. La lunghezza dei frammenti amplificati è rispettivamente di 600 bp per la nested PCR I step, di 433 bp per nested PCR II step e di 133 bp per la TaqMan Real-Time PCR. Nested PCR Per valutare sensibilità e specificità della nested-pcr è stato utilizzato il plasmide pgem3zf(+): 1,6kb-BamHI-XbaI scelto come controllo positivo e contenente la regione bersaglio di DNA genomico del virus dell AIE. Mediante amplificazione di diluizioni scalari del plasmide è stato dimostrato che il saggio riesce ad individuare fino a 10 copie di DNA plasmidico. Lo stesso metodo è stato applicato su diluizioni scalari di DNA estratto da cellule infette con il virus dell AIE. Il DNA estratto è risultato amplificabile ed anche in questo caso la sensibilità del protocollo della nested PCR messo a punto ha consentito di svelare fino a 10 copie di DNA virale. Sono stati inoltre eseguiti test di amplificazione con concentrazioni note di plasmide diluito in DNA genomico di animali non infetti di controllo o in acqua, dimostrando che il DNA genomico non interferisce nella reazione con il DNA virale. Per quanto riguarda i tessuti allo stato attuale i campioni positivi all AGID risultano per la maggior parte dei casi negativi all indagine molecolare e questo è da ricollegare probabilmente alla fase cronica dell infezione. Il DNA estratto dal sangue (buffy coat) è risultato quasi sempre amplificabile mediante PCR per TNF, tuttavia, come per i tessuti, la nested PCR non ha rivelato la presenza di virus nei campioni analizzati. 21 di 27

22 Risultati e discussione RT-nested PCR Per valutare l efficienza del protocollo impiegato è stato introdotto nella reazione un controllo positivo costituito da supernatante di cellule appartenenti ad una linea cellulare continua di derivazione equina ED (American Type Culture Collection cod. CCL 57) infettate con virus AIE, ceppo Wyoming (American Type Culture Collection cod. VR 778). Il supernatante di cellule ED infettate con virus dell AIE è stato sottoposto allo stesso trattamento dei campioni ed è stato dimostrato che il saggio riesce ad individuare correttamente la presenza di RNA virale presente nel campione scelto come controllo positivo. Per la messa a punto e la validazione dei protocolli di trascrizione inversa e di amplificazione è stato utilizzato come controllo positivo un RNA sintetizzato da un cdna del ceppo Wyoming (GenBank accession number: M16575; K03334; M11337; M14855), corrispondente alla regione del genoma virale compresa tra le posizioni 386 e Tale cdna, clonato nel vettore di trascrizione pgem3zf(+): 1,6kb-BamHI- XbaI) (Promega) contiene la sequenza bersaglio dei primer diagnostici impiegati nella metodica di RT-nested PCR ed è stato gentilmente messo a disposizione dell Ufficio di Staff Biotecnologie dell Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle regioni Lazio e Toscana Sede di Roma (Unità Operativa 3). Il DNA plasmidico, dopo trasformazione in cellule competenti di E.coli, è stato estratto con kit Plasmid midi kit (QIAGEN). La qualità dell acido nucleico estratto è stata controllata mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio all 1% e la concentrazione calcolata in seguito a lettura spettrofotometrica dell assorbanza a 260 nm. Dopo la digestione, il DNA plasmidico linearizzato è stato quindi retrotrascritto utilizzando il kit commerciale RiboMAX TM Large Scale RNA Production Systems-SP6 and T7 (Promega) e poi utilizzato per valutare l efficienza del protocollo usato attraverso test di amplificazione con campioni a concentrazioni note di RNA virale. Il metodo ad oggi sviluppato è in grado di rilevare fino a 100 copie di RNA virale presenti nel campione da amplificare. I campioni di plasma testati con RT-nested PCR ed ottenuti da equini già positivi all indagine sierologica hanno consentito di svelare la presenza del virus soltanto in un numero molto limitato di campioni; questo probabilmente a causa di un numero di 22 di 27

23 Risultati e discussione copie molto basso di genoma provirale nel campione, dovuto presumibilmente allo stato di infezione dell animale in fase cronica e legato alla tipologia dei campioni esaminati. Gli accertamenti diagnostici su animali con infezione acuta sono stati estremamente rari e per lo più i campioni provenivano da soggetti controllati in seguito a sporadici piani territoriali o ad estensione di controlli in azienda sede di focolai. Real-Time TaqMan PCR Per valutare sensibilità e specificità del protocollo di Real-Time TaqMan PCR da applicare nella diagnosi quantitativa di AIE in campioni di tessuti e sangue (buffy coat) di equini già positivi alla nested PCR sono state utilizzate diluizioni scalari del plasmide pgem3zf(+): 1,6kb-BamHI-XbaI scelto come controllo positivo e contenente la regione bersaglio di DNA genomico del virus dell AIE; lo stesso metodo è stato applicato su diluizioni scalari di DNA estratto da cellule appartenenti ad una linea cellulare continua di derivazione equina ED (American Type Culture Collection cod. CCL 57) infettate con virus AIE, ceppo Wyoming (American Type Culture Collection cod. VR 778). Per verificare la validità di applicazione dello stesso protocollo a campioni di plasma equino già positivo alla RT-nested PCR messa a punto per diagnosi diretta di AIE in soggetti con infezione in fase acuta di infezione, è stato introdotto nella reazione un controllo positivo costituito da supernatante delle stesse cellule ED (American Type Culture Collection cod. CCL 57) citate in precedenza. Il supernatante di cellule ED infettate con virus dell AIE è stato sottoposto allo stesso trattamento dei campioni ed è stato dimostrato che il saggio riesce ad individuare correttamente la presenza di RNA virale presente nel campione scelto come controllo positivo. Per verificare sensibilità e specificità dei protocolli di trascrizione inversa e di amplificazione mediante Real-Time TaqMan PCR è stato introdotto nella reazione come controllo positivo un RNA già citato per la RT-nested PCR sintetizzato da un cdna del ceppo Wyoming (GenBank accession number: M16575; K03334; M11337; M14855), corrispondente alla regione del genoma virale compresa tra le posizioni 386 e di 27

24 Risultati e discussione Mediante diluizioni scalari di DNA estratto da cellule infette con virus AIE e standard a concentrazioni note di DNA (plasmide) e RNA (trascritti da DNA plasmidico) è stato possibile determinare il limite minimo di copie rivelabili con questa metodica che si è dimostrato pari a 50 copie di DNA virale e 100 copie per l RNA. 24 di 27

25 Conclusioni Conclusioni I protocolli di lavoro ad oggi sviluppati nella ricerca in oggetto consentono di rilevare e quantizzare numeri molto ridotti di genoma di virus AIE in plasma e tessuti infetti. Questi nuovi strumenti e l adozione di un piano di controllo regolare per l AIE su tutto il territorio nazionale, ai sensi dell Ordinanza 14 Novembre 2006 (in GU n. 285) 17, ci consentiranno di reperire una maggiore quantità di materiale biologico da testare e, quindi, di validare i metodi oggetto della ricerca affinandone ulteriormente sensibilità, robustezza e rapidità di esecuzione. Grazie all estensiva applicazione di controlli sierologici per l intera popolazione equina, che ha come finalità il monitoraggio dell incidenza di infezione a livello nazionale e la definizione di un quadro epidemiologico generale, sarà possibile ottenere campioni da soggetti con infezione in fase acuta nei quali, presumibilmente, il virus replicherà attivamente ed ad alti livelli e sarà quindi facilmente rilevabile. Questi campioni consentiranno di validare il sistema sul campo e di definire un algoritmo diagnostico per infezione da AIE che preveda l impiego dei metodi molecolari in oggetto affiancati ai tradizionali test sierologici. L ingresso e l adozione a pieno titolo dei sistemi molecolari consentirà di ovviare ai limiti di sensibilità dei test sierologici e, soprattutto, di identificare soggetti in fase acuta di infezione che non hanno ancora anticorpi in circolo e che risulteranno quindi negativi ai test sierologici. E' da sottolineare che in questa fase gli individui infetti hanno livelli di viremia elevati e, pertanto, massima contagiosità. La pronta identificazione di questi animali ed il loro conseguente isolamento contribuirà sensibilmente a ridurre l insorgenza di focolai di infezione. 25 di 27

26 Conclusioni Bibliografia 1 Ligné M Mémoire et observations sur une maladié de sang, connue sous le nom d anhémie hydrohémie, cachexie acquise du cheval. Rec Med Vet Ec Alfort 1843; Vallée H and Carré H. Sur la nature infectieuse de l anémie du cheval. C R Acad Sci 1904; 139: Toma B, Eloit M and Savey M. Animal diseases caused by retroviruses: enzootic bovine leukosis, equine infectious anaemia and caprine arthritis-encephalitis. Rev sci tech Off int Epiz. 1990; 9 (4): Leroux C, Cadoré J-L and Montelaro RC. Equine Infectious Anemia Virus (EIAV): what has HIV s country cousin got to tell us? Vet Res 2004; 35 (4): Coggins L and Norcross NL. Immunodiffusion reaction in equine infectious anemia. Cornell Vet 1970; 60: Coggins L, Norcross NL, Nusbaum SR. Diagnosis of equine infectious anemia by immunodiffusion test. Am J Vet Res 1972; 33 (1): Forletta R. Nota tecnica sulla prova di immunodiffusione in gel di agar (test di Coggins) per la diagnosi di Anemia Infettiva Equina. Atti della Società delle Scienze Veterinarie 1975; Vol. XXIX: DECRETO MINISTERIALE 4 dicembre Profilassi dell anemia infettiva degli equini (G.U. 31 dicembre 1976, n. 348). 9 Office International des Epizooties. Equine Infectious Anaemia. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. OIE, 5 th Edition 2004; Part 2, Section 2.5, Chapter Available from: 10 COMUNICATO MINISTERO DELLA SALUTE Comunicato relativo alle metodologie diagnostiche per le malattie degli equidi riproduttori maschi ai fini della disciplina della riproduzione animale (G.U. n 66 del ). 11 Issel CJ, Rwambo PM, Montelaro RC. Evolution of equine infectious anemia diagnostic tests: recognition of a need for detection of anti-eiav glycoprotein antibodies. Proceedings of the fifth international conference on equine infectious diseases V, Lexington, Kentucky: 1988 pp di 27

27 Conclusioni 12 Cook RF, Cook SJ, Li F, Montelaro R C and Issel C J. Development of a multiplex real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction for equine infectious anemia virus (EIAV). J Virol Methods 2002; 105: Nagarajan MM and Simard C. Detection of horses infected naturally with equine infectious anemia virus by nested polymerase chain reaction. J Virol Methods 2001; 94: Langemeier JL, Cook SJ, Cook RF, Rushlow KE, Montelaro RC and Issel CJ. Detection of Equine Infectious Anemia Viral RNA in Plasma Samples from Recently Infected and Long- Term Inapparent Carrier Animals by PCR. J. Clin. Microbiol. 1996; 34 (6): Pistello M, Del Santo B, Butto S, Bargagna M, Domenici R and Bendinelli M. Genetic and phylogenetic analyses of HIV-1 corroborate the transmission link hypothesis. J. Clin. Virol. 2004; 30: Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; ORDINANZA MINISTERO DELLA SALUTE 14 novembre Disposizioni urgenti in materia di sorveglianza dell anemia infettiva degli equidi. (Supplemento ordinario alla G.U. Serie generale n. 285 del ). 27 di 27

28 PG SIP 004/17 rev.2 Pag. 1 di 1 SCHEDA INVIO CAMPIONI POSITIVI DA CONFERMARE PER DIAGNOSI ANEMIA INFETTIVA EQUINA - Istituto Zooprofilattico Sperimentale che ha eseguito le analisi: - Data prelievo (gg/mm/aa): / / - Data accettazione (gg/mm/aa): / / - Motivo prelievo: equide sintomatico controllo estensione controlli in azienda (Compilare Allegato 2 e 3) - Esami effettuati : AGID Test ELISA altro.. Ente Prelevatore ASL... Indirizzo.. Tel..Fax Veterinario Prelevatore.. Libero professionista Indirizzo. Tel...Fax.. Altro. Proprietario Tipo di azienda: scuderia stalla di sosta circolo ippico altro. Ragione sociale.. Proprietario Indirizzo Comune Provincia.. Destinazione degli equidi: commercio diporto fattrici stalloni carne manifestazione sportiva altro Dati equidi infetti: Nome Razza Sesso 1 Mantello Dati segnaletici Data di nascita Sintomi 2 Data introduzione equidi infetti in azienda 3 Nazione estera di provenienza 1 M=maschio F= femmina 2 P = presenti A = assenti 3 Indicare ragione sociale e sede azienda di origine Data (gg/mm/aa) / / Firma del responsabile Parte riservata al CRAIE: Data accettazione ore. Firma..

29 PG SIP 004/18 rev.2 Pag. 1 di 1 SCHEDA ANAMNESTICA FOCOLAIO ANEMIA INFETTIVA EQUINA Data di segnalazione focolaio (gg/mm/aa): / / Provvedimenti successivamente adottati: abbattimento isolamento denuncia Zone di pascolo dall ultimo controllo per Anemia Infettiva Equina Periodo ASL competente Ente Prelevatore: Proprietario: ASL indirizzo. Veterinario responsabile: Tel. Fax . Libero professionista.. Tel. Fax . Altro. Tipo di azienda: scuderia stalla di sosta circolo ippico altro. Ragione sociale... Proprietario. Indirizzo.. Comune Provincia Allevamento: - Tipo di allevamento chiuso semi brado brado altro. - Numero di animali in azienda: Equidi presenti in azienda Cavalli adulti Cavalli di età <6 mesi Asini Muli Numero - Destinazione degli equidi: commercio diporto fattrici stalloni carne manifestazione sportiva altro. - Breve storia clinica dell allevamento focolaio:.. Data (gg/mm/aa): / / Firma del Responsabile Parte riservata al CRAIE: Data accettazione ore. Firma

30 PG SIP 004/19 rev.2 Pag. 1 di 1 SCHEDA SEGNALAMENTO ANIMALI PRESENTI NEL FOCOLAIO Nome Razza Sesso Mantello Anno di nascita Segni particolari Data ultimo Test di Coggins Esito Data introduzione in azienda Azienda di provenienza* Presenza altre malattie * = Indicare denominazione, Comune e Provincia. Data (gg/mm/aa): Firma del Responsabile:./ /. Parte riservata al CRAIE: Data accettazione ore. Firma

31 PG SIP 004/20 rev.2 Pag. 1 di 1 SCHEDA MODALITA' DI PRELIEVO MATERIALE BIOLOGICO DA EQUIDI PRESENTI NEL FOCOLAIO DI ANEMIA INFETTIVA EQUINA Data Prelievo. ASL.. Indirizzo... Tel. Fax.. Veterinario Prelevatore. PROPRIETARIO.. AZIENDA. Indirizzo Comune Provincia... Materiale biologico prelevato 1 : PLASMA 2 ( Anticoagulante utilizzato: ) SIERO POLMONI FEGATO LINFONODI MESENTERICI LINFONODI POLMONARI MILZA.. Nome equide o identificativo MATERIALE PRELEVATO Plasma (ml) Siero (ml) Polmone Milza Fegato Linfonodi mesenterici Linfonodi Polmonari 1 Il materiale biologico deve essere preferibilmente conservato alla temperatura di 80 C ed inviato al Centro di Referenza in ghiaccio secco; in caso contrario specificare nelle note in fondo le diverse condizioni di t di conservazione e trasporto. 2 Per il prelievo si raccomanda l utilizzo di EDTA come anticoagulante altrimenti si prega di specificare nello spazio relativo il tipo di anticoagulante utilizzato. NOTE:. Data... Firma del Responsabile Parte riservata al CRAIE: Data accettazione ore.. Firma