La ricerca degli oncogeni RET/PTC, trk e BRAF V 600E negli agoaspirati inconclusivi migliora la diagnosi citologica e modifica la scelta terapeutica

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1 La ricerca degli oncogeni RET/PTC, trk e BRAF V 600E negli agoaspirati inconclusivi migliora la diagnosi citologica e modifica la scelta terapeutica Maria Ilaria Moretti 1, Anna Guerra 1, Diega Marranca 2, Marco Migliardi 2, Laura Germano 2, Maria Rosaria Sapio 1, Maurilio Deandrea 3, Federico Ragazzoni 3, Manuela Motta 4, Paolo Piero Limone 3, Mario Vitale 1 1Dipartimento di Endocrinologia ed Oncologia Molecolare e Clinica, Università Federico II, Napoli 2Laboratorio di Ormonologia, SC Laboratorio Analisi Chimico-Cliniche e Microbiologiche, Presidio Ospedaliero Umberto I, AO Ordine Mauriziano, Torino 3SC di Endocrinologia, Presidio Ospedaliero Umberto I, AO Ordine Mauriziano, Torino 4SC di Anatomia Patologica, Presidio Ospedaliero Umberto I, AO Ordine Mauriziano, Torino Il presente contributo è risultato vincitore al Premio ELAS FORUM 2008 assegnato al miglior poster presentato nel corso del 14 Simposio annuale ELAS Italia - Bologna ottobre 2008 RIASSUNTO La biopsia mediante aspirazione con ago sottile (FNAB) rappresenta la procedura più efficace per distinguere un nodulo benigno da uno maligno. Nel 20-40% dei casi il FNAB risulta inconclusivo. Metodiche aggiuntive renderebbero la diagnosi più accurata, rendendo la terapia più appropriata. Scopo del nostro studio è valutare se la ricerca degli oncogeni BRAF V600E, RET/PTC e trk migliora la diagnosi di noduli tiroidei con FNAB inconclusivo, migliorando la scelta terapeutica. La presenza degli oncogeni è stata ricercata mediante RT-PCR e Mutant Allele-Specific Amplification (MASA) in 131 FNAB di pazienti con patologia nodulare tiroidea. Nessuno degli oncogeni ricercati è stato trovato in noduli benigni, inadeguati ed indeterminati. La natura benigna dei noduli veniva confermata in tutti i casi dal successivo esame istologico. Nessun oncogene veniva ritrovato in un caso di carcinoma follicolare (FTC) con citologia indeterminata. Cinque dei 6 carcinomi papilliferi (PTC) venivano correttamente diagnosticati per la presenza di un oncogene nel FNAB (1 RET/PTC, 4 BRAF V600E ). Complessivamente, la ricerca degli oncogeni analizzati in FNAB inconclusivi non ha prodotto nessun falso positivo ed ha identificato l 83% dei PTC presenti modificando la scelta terapeutica ed evitando il re-intervento in 5 pazienti con sospetto di malignità. In conclusione, noi proponiamo la ricerca di RET/PTC, trk e BRAF V600E come strumento aggiuntivo in campioni di FNAB di noduli tiroidei con citologia inconclusiva. Parole chiave: Tiroide, Oncogene, FNAB, Carcinoma ABSTRACT Detection of RET/PTC, trk and BRAF mutations in preoperative diagnosis of thyroid nodules with indeterminate cytological findings. Fine-needle aspiration biopsy (FNAB) is the primary tool to distinguish benign from malignant nodules and select patients for the appropriate therapy. However, 20 40% of FNAB result uncertain. Adjunctive diagnostic tools might improve the pre-operative diagnosis and would be helpful to guide the choice to the more appropriate therapy. We investigated whether a search for the oncogenes RET/PTC, trk and BRAF V600E in thyroid aspirates could refine uncertain diagnosis. The presence of oncogenes was searched by Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and Mutant Allele-Specific Amplification (MASA) techniques in a total of 131 thyroid aspirates, including colloid nodules, inadequate samplings, indeterminate and suspicious for malignancy. No oncogenes were detected in 48 colloid nodules, 46 inadequate and 19 indeterminate FNABs, then confirmed to be benign at histology. No oncogenes were detected in one follicular thyroid cancer with indeterminate cytology. Five out of six papillary thyroid cancers (PTC) with FNAB suspicious for malignancy were correctly diagnosed by the presence of oncogenes (1 RET/PTC, 4 BRAF V600E ). Overall, no falsepositive results were reported and the 83% of PTC were correctly diagnosed. The finding of oncogenes in FNAB specimens suspicious for malignancy guided the extent of surgical resection, changing the surgery from diagnostic to therapeutic in five cases. In conclusion, we propose the detection of RET/PTC, trk and BRAF V600E as a diagnostic adjunctive tool in FNAB specimens of thyroid nodules with suspicious cytological findings. Keywords: Thyroid, Oncogene, FNAB, Carcinoma INTRODUZIONE Il riscontro di noduli della tiroide è un evenienza frequente soprattutto nelle aree geografiche con carenza iodica. Benché solo il 4-5% di questi noduli siano maligni 1, il riscontro di un nodulo tiroideo rende necessaria un accurata diagnosi sulla natura della lesione al fine di evitare interventi chirurgici non necessari, non appropriati o tardivi. Il FNAB è considerato il metodo più efficace ed affidabile per la diagnosi di malignità dei noduli tiroidei. La spe- 322 LigandAssay 13 (4) 2008

2 cificità e la sensibilità del FNAB sono molto variabili e dipendono dall esperienza dell anatomopatologo. Tuttavia, nel 20-40% dei casi il FNAB fornisce risultati non conclusivi perché il materiale prelevato è insufficiente per l analisi citologica o perché non vi sono sufficienti elementi di chiara malignità 1-3. Metodiche aggiuntive al FNAB, in grado di risolvere le diagnosi incerte renderebbero pertanto più appropriata la terapia. Mutazioni dei geni coinvolti nella cascata enzimatica del recettore tirosin-chinasico (TK)/RAS/RAF/MEK/ERK, che regola la crescita e la proliferazione cellulare, sono state individuate anche in cellule di carcinoma tiroideo. In particolare, gli oncogeni RET/PTC, trk e BRAF V600E, per via della loro espressione selettiva ed alta prevalenza, costituiscono eccellenti marcatori del PTC. Il gene RET codifica per un recettore di membrana con attività tirosin-chinasica; uno dei suoi ligandi è il fattore neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale (GDNF), responsabile della differenziazione, la crescita e la sopravvivenza delle cellule della cresta neurale. La fusione della sequenza che codifica per il dominio tirosin-chinasico di RET al 5 di sequenze di geni che sono costitutivamente espressi in cellule follicolari tiroidee, determina la generazione di un vasto numero di oncogeni chimerici conosciuti come RET/PTC 4-5. Le forme con più alta prevalenza nei PTC risultano essere RET/PTC1, RET/PTC2, RET/PTC3. Il gene NTRK-1 codifica per una proteina recettoriale transmembrana con dominio tirosin-chinasico che lega il fattore di crescita neuronale (NGF) la cui espressione è ristretta ai gangli dei nervi periferici; così come RET/PTC l attivazione dell oncogene trk avviene attraverso la creazione di una proteina di fusione chimerica 6-7. Entrambi questi oncogeni sono esclusivamente presenti nei PTC. Il gene BRAF codifica per una serin/treonin chinasi appartenente alla famiglia delle proteine RAF insieme ad A-RAF e C-RAF (RAF-1). La mutazione dovuta alla trasversione T A al nucleotide 1799 nell esone 15 del gene, è responsabile dell attività costitutiva dell oncogene BRAF V600E e della trasformazione neoplastica dell epitelio tiroideo tipica dei PTC Questi oncogeni risultano avere un espressione selettiva e alta prevalenza offrendo una eccellente specificità e una sensibilità significativa come marcatori del PTC. Lo scopo del nostro lavoro pertanto è stato quello di determinare la presenza dei suddetti oncogeni in FNAB inconclusivi migliorando la scelta terapeutica. MATERIALI E METODI Sono stati indagati 131 FNAB di pazienti provenienti dall Azienda Ospedaliera Universitaria Federico II di Napoli e dell Ospedale Mauriziano di Torino. I campioni citologici sono stati ottenuti utilizzando una siringa con un ago di 22 G passati 3-4 volte attraverso il nodulo. La classificazione cito/istologica dei campioni è stata effettuata in accordo con Baloch e LiVolsi 12. Estrazione di DNA e analisi della mutazione BRAF T1799A L estrazione del DNA dai FNAB è stata condotta mediante l utilizzo del TRI REAGENT (Sigma, St. Louis, MO) seguendo il protocollo della casa produttrice. Il pellet finale è stato risospeso in 10 μl di acqua DEPC. Infine, la concentrazione del DNA estratto da tutti i campioni è stata quantizzata con un Biofotometro (Eppendorf, Amburgo, Germania) leggendone l assorbanza a 260nm. La ricerca di mutazione nel gene BRAF è stata eseguita attraverso una PCR-MASA 13. Sono stati disegnati due diversi primers forward (PRIMM, Milano,Italia) con la sostituzione di una singola base all estremità 3 del primer in modo da poter amplificare rispettivamente l allele wild-type o la mutazione T1799A di BRAF (Tab.1). La reazione di PCR è stata condotta in 25 μl finali con 1,5 mm MgCl2, 200 μm dntps, 0,5 μm primers forward e reverse, 50 ng DNA e 0,2 U Taq Polimerasi (GE Healthcare, Amersham, Italia). Gli esperimenti sono stati condotti in triplicato utilizzando linee cellulari NPA (omozigoti per la mutazione T1799A) e WRO (omozigoti wild-type) come controllo positivo e negativo rispettivamente. Estrazione dell RNA e RT-PCR L RNA totale è stato estratto usando il TRI REAGENT e seguendo il protocollo suggerito. Il pellet finale è stato risospeso in 10 μl di acqua DEPC e retro-trascritto utilizzando la SuperScript III (Invitrogen, Milano, Italia) in 20 μl di volume di reazione con i random primers. La presenza di cellule follicolari epiteliali, l integrità dell RNA e l efficienza della reazione di retro-trascrizione in ogni campione è stata confermato mediante una RT-PCR utilizzando primers specifici per la tireoglobulina (Tab.1). I primers sono stati scelti in 2 differenti esoni in modo da poter discriminare la presenza di DNA genomico contaminante. La reazione di PCR utilizzata è la stessa descritta in precedenza per BRAF. Analisi dei riarrangiamenti di trk e di RET Per stabilire l eventuale presenza di un riarrangiamento genico abbiamo usato un metodo standard di RT-PCR. Dopo una prima amplificazione ne abbiamo eseguita da un altra detta nested usando primers più interni e, come templato, il prodotto ottenuto nella prima PCR diluito 1:10. Il 2% del cdna è stato usato utilizzando le coppie di primers mostrate in Tabella 1. Per trk il primer forward è stato disegnato nella regione al 5 del gene TPM3 mentre il reverse nella regione del dominio tirosin-chinasico di NTRK1. Le reazioni di RT- PCR sono state condotte seguendo il protocollo classico. Tutti i campioni sono stati analizzati per l espressione dei domini TK ed extracellulare (EC) di RET. I campioni risultati positivi per il dominio EC di RET sono stati analizzati per la presenza dell espressione della calcitonina mediante RT-PCR per escludere la presenza di cellule C che normalmente esprimono RET. Invece, i campioni positivi per il dominio TK e non per quello EC sono stati considerati positivi per un riarrangiamento e analizzati con primers specifici per RET/PTC1, RET/PTC2, RET/PTC3. Abbiamo usato primers forward nella regione 5 di H4, Riα e Ele1 per RET/PTC1, RET/PTC2, RET/PTC3 rispettivamente e lo stesso primers reverse nel dominio TK di RET. LigandAssay 13 (4)

3 Tabella 1 Sequenza dei primers e Tm usate per le reazioni di RT-PCR gene Tm primers BRAF 58 Fwt 5 -gtgattttggtctagctacagt-3 Fmut 5 -gtgattttggtctagctacaga-3 R 5'-ggccaaaatttaatcagtgga-3' TG 60 R 5 -aggtgcaggaagttgactcc-3 R 5 -agagccagcagaacattgga-3 RET-EC 60 F 5 -ggcggcccaagtgtgccgaactt-3 R 5 -cccaggccgccacactcctcaca-3 RET-TK 58 F 5 -tggttcttggaaaaactctag-3 F 5 -ctgcaggccccatacaattt-3 RET/PTC1 68 F 5 -agcgccagcgagagcgacacg-3 R 5 -taccctgctctgcctttcagatgg-3' RET/PTC1 nested e sequenza 60 F 5 -gtcggggggcattgtcatct-3 R 5 -agttcttccgagggaattcc-3 RET/PTC2 60 F 5 -agggagctttggagaacttg-3 R 5 -taccctgctctgcctttcagatgg-3 RET/PTC2 nested e sequenza 60 F 5 -gaaattgtggggcatcgacc-3 R 5 -agttcttccgagggaattcc-3 RET/PTC3 60 F 5 -agaccttggagaacagtcag-3 R 5 -taccctgctctgcctttcagatgg-3' RET/PTC3 nested e sequenza 60 F 5 -agaccttggagaacagtcag-3 R 5 -agttcttccgagggaattcc-3 NTRK1-TK 60 F 5 -gggactggtggtcaagattg-3 R 5 -gcttgccgtaggtgaagatc-3 NTRK1-EC 60 F 5 -ctctccttacaggaactggtcc-3 R 5 -agatttcatcaccgtggctg-3 trk 58 F 5 -tgagcagattagactgatgg-3 R 5 -ggaagaggcaggcaaagac-3 trk nested e sequenza 60 F 5 -gctgccgaagaaaagtactc-3 F 5 -tttcgtccttcttctccacc-3 RISULTATI Abbiamo analizzato 131 FNAB comprendenti 48 noduli colloidali da noi utilizzati come controllo positivo, 46 campioni inadeguati, 21 campioni indeterminati e 16 sospetti per PTC. I risultati degli esami citologico, molecolare e istologico (ove disponibile) effettuati sui noduli sottoposti a FNAB sono riportati in Figura 1 e 2. In un campione, non è stato possibile ottenere l espressione della tireoglobulina e pertanto non è stato possibile effettuare la ricerca degli oncogeni. Considerando i FNAB con citologia non maligna (n=115), tutti i noduli benigni, tutti i prelievi inadeguati e 19 (su 21) noduli indeterminati sono risultati negativi alle indagini molecolari. Due noduli indeterminati hanno mostrato un elevata espressione del dominio TK di RET. Uno di questi, dopo l operazione ed il successivo esame istologico, è poi risultato essere un tumore midollare confermato anche dall elevata concentrazione sierica di calcitonina nel paziente. Sessantaquattro soggetti sono stati successivamente sottoposti a tiroidectomia e, in tutti i casi, l esame istologico ha confermato la natura benigna dei noduli ad eccezione di un caso di tumore follicolare e del sopracitato caso di tumore midollare. I 16 pazienti con esame citologico sospetto per malignità sono stati sottoposti ad intervento chirurgico: 6 sono risultati essere carcinomi tiroidei (37%). In seguito alla ricerca di oncogeni 4 presentavano la mutazione T A 1799 nel gene BRAF (67%) e 1 il riarrangiamento RET/PTC3 (17%). Non è stato riscontrato nessun riarrangiamento dell oncogene NTRK1. In conclusione, la ricerca degli oncogeni RET/PTC, trk ebraf V600E condotta su 130 aghi aspirati non ha prodotto nessun falso positivo e ha correttamente identificato 5 dei 6 PTC presenti (83%). La ricerca di questi oncogeni nel materiale bioptico di FNAB con sospetto di malignità rappresenta pertanto un utile strumento per perfezionare la diagnosi pre-operatoria dei noduli tiroidei. 324 LigandAssay 13 (4) 2008

4 Figura 1 Corsa elettroforetica di campioni amplificati mediante RT-PCR. a) Analisi dell espressione della tireoglobulina in 4 campioni. Nel campione 4 non si evince nessuna amplificazione; nel campione 1 è presente una banda di MW più alto determinata dalla contaminazione di DNA genomico all interno del campione. b) Analisi mediante MASA della trasversione T A 1799 BRAF. I campioni 5 e 11 sono eterozigoti per la mutazione. c) RT-PCR per il dominio EC e TK del gene RET. Il campione 12 presenta l espressione del dominio TK, il campione 13 l espressione sia del dominio EC che del TK, mentre il campione 14 nessuno. d) Rappresentazione di una prima reazione di amplificazione ed una successiva (nested) per il riarrangiamento di RET/PTC3 nel campione 12. I campioni sono identificati secondo i numeri MW = peso molecolare DISCUSSIONE E CONCLUSIONI Abbiamo analizzato 131 aghi aspirati per la ricerca dei riarrangiamenti di RET e di NTRK1 e per la mutazione al nucleotide 1799 di BRAF. La qualità dell RNA estratto dai campioni è stata sufficiente da permettere di utilizzare la metodica della RT-PCR, infatti, solo in un campione non è stato possibile determinare la presenza del trascritto della tireoglobulina. In 46 FNAB inadeguati nessun oncogene è stato riscontrato; in seguito ad intervento chirurgico effettuato per ragioni estetiche o per altre ragioni, 26 FNAB sono risultati essere noduli benigni. Questo risultato è in accordo con la prevalenza del cancro della tiroide in assenza di segni di sospetta malignità La ricerca di questi tre oncogeni, considerando il rapporto costo/beneficio, non è quindi raccomandata in campioni inadeguati in assenza di sospetto clinico. A seguito dell analisi cito/istologica sono emersi campioni di FTC e PTC che risultavano essere negativi all analisi molecolare e questo, se da un lato può essere spiegato dal fatto che negli FTC non c è l espressione di RET/PTC, trk e della mutazione di BRAF, dall altro bisogna indagare sul perchè la ricerca degli oncogeni è risultata negativa nel tessuto ottenuto dall asportazione del carcinoma papillare. Questo dato si spiega con la percentuale di prevalenza degli oncogeni da noi analizzati che non copre il 100% degli oncogeni associati ai PTC. Ulteriori analisi genetiche dei PTC sono necessarie all identificazione di alterazioni geniche ancora sconosciute, associate o responsabili dell insorgenza del tumore. Nell ambito dei campioni citologici indeterminati sono stati correttamente diagnosticati 5 su 6 PTC (83%) e 5 di 7 carcinomi (71%) e non è stato rilevato nessun falso positivo. In due FNAB la presenza dell mrna sia per il dominio EC sia per quello TK dell oncogene RET indica la presenza di un elevato numero di cellule C della tiroide. Tuttavia, questa analisi da sola non consente di stabilire se si sia in presenza di iperplasia delle cellule C o di carcinoma midollare della tiroide: un successivo sequenziamento del gene RET si rende pertanto necessario. In uno dei due casi da noi analizzati l aumento considerevole della concentrazione sierica della calcitonina suggeriva la presenza di un MTC, confermato in seguito dall esame istologico. Nell altro paziente, in assenza di sospetto clinico di MTC, l intervento chirurgico è stato posticipato in attesa del completamento dell analisi di mutazione del gene RET. Quando il FNAB risulta indeterminato, la decisione di sottoporre i pazienti ad intervento chirurgico è basata unicamente su criteri clinici. I pazienti che non presentano un sospetto chiaro di neoplasia vengono rimandati a controlli periodici, mentre gli altri verranno sottoposti a intervento chirurgico di tiroidectomia parziale o totale. La tiroidectomia totale è indicata in presenza di carcinoma ma è potenzialmente associata con alti rischi di complicanze operatorie come paratiroidectomia o resezione del nervo laringeo. L emitiroidectomia associata alla resezione dell istmo è una alternativa alla tiroidectomia totale ma se l esame istologico dà esito positivo per carcinoma, sarà necessario effettuare una seconda operazione per completare l asportazione del tessuto tiroideo residuo. Inoltre, l esame estemporaneo delle sezioni istologiche non è sempre efficace a causa della bassa sensibilità nel diagnosticare FTC o la variante follicolare del PTC. Nel nostro studio, la diagnosi di carcinoma tiroideo è stata effettuata correttamente in 5 FNAB indeterminati: questo ha modificato la decisione riguardante la radicalità dell intervento da eseguire. La ricerca di marcatori genetici di malignità può ottimizzare la capacità di selezionare noduli tiroidei da sottoporre ad intervento chirurgico. La diagnosi citologica convenzionali è suddivisa in 4 categorie: benigno, insufficiente, indeterminato e maligno. La ricerca di oncogeni su campioni di FNAB fornisce solo due risultati, maligno o incerto: infatti, se la presenza di un oncogene indica con certezza la presenza di un carcinoma, la sua assenza non ha nessun impatto sulla diagnosi e sulla decisione clinica finale. LigandAssay 13 (4)

5 Figura 2 Schema riassuntivo delle mutazioni di BRAF e dei riarrangiamneti di RET e di NTRK1. PTC: carcinomi papilliferi della tiroide FTC: carcinomi follicolari della tiroide n.d.: non determinati (a causa del mancato intervento chirurgico). La sensibilità del metodo è limitata dalla prevalenza globale di RET/PTC, trk e BRAF V600E nel PTC e dalla loro assenza nel FTC e nelle lesioni metastatiche. L identificazione di marcatori genetici specifici del carcinoma follicolare incrementerebbe la sensibilità del metodo soprattutto perché la causa maggiore di citologia indeterminata è rappresentata proprio dall impossibilità di discernere tra carcinoma e adenoma follicolare. Un altro limite importante è rappresentato dall eterogeneità del tumore e dalla quantità di campione analizzato. In alcuni studi i riarrangiamenti di RET/PTC sono stati riscontrati solo in una piccola porzione di cellule all interno della massa tumorale di un PTC, supportando l ipotesi della eterogeneità tumorale Così come per RET/PTC, in teoria anche trk e BRAF potrebbero essere presenti solo in una piccola frazione cellulare 19. La sensibilità del metodo potrebbe essere ridotta a causa della esigua quantità di materiale cellulare ottenuto mediante ago aspirato. Il passaggio dell ago tre o quattro volte all interno della massa nodulare garantisce sia la quantità adeguata di materiale prelevato sia l eterogeneità cellulare che caratterizza il tessuto tiroideo. A tal proposito, il nostro metodo di esame molecolare si basa sull utilizzo dell intero materiale ottenuto da una biopsia e la validità di questo approccio è dimostrata dalla non discordanza tra l analisi genetiche effettuata su FNAB e quella istologica su campioni chirurgici. Sulla base dei risultati ottenuti, la ricerca degli oncogeni in campioni di FNAB indeterminati può essere considerata una risorsa addizionale di informazioni utili nel selezionare i pazienti da destinare ad intervento chirurgico. Per migliorare l accuratezza nella diagnosi proponiamo di utilizzare tale metodica al fine di identificare casi di carcinoma papillare della tiroide in biopsie con citologia indeterminata. BIBLIOGRAFIA 1 Mazzaferri EL. Management of a solitary thyroid nodule. New England Journal of Medicine 1993; 328: Gharib H, Goellner JR. Fine-needle aspiration biopsy of the thyroid: an appraisal. Annals of Internal Medicine 1993; 118: Gharib H, Goellner JR, Zinsmeister AR, et al. Fine- 326 LigandAssay 13 (4) 2008

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