I.T.I.S G. GALILEI ARZIGNANO VICENZA
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1 I.T.I.S G. GALILEI ARZIGNANO VICENZA A.S. 2000/2001 CLASSE 5 B APPROFONDIMENTO SCOLASTICO STUDIO SULL INFLUENZA DI ALCUNI COLORANTI SULLA DETERMINAZIONE DEL Cr 6+ NELLE PELLI ALLIEVE: SILENE ZUCCON E ANNA FANTON RELATORE: PROF. MARZIA GUARDA.
2 SOMMARIO Si è investigata l influenza della presenza di quattro coloranti, comunemente impiegati nella tintura del cuoio, sui risultati della determinazione del cromo esavalente sui pellami con il metodo I.U.C. 18. Come controllo è stato impiegato un metodo alternativo di determinazione del cromo esavalente basato su una pre-filtrazione dell estratto con cartucce di ottadecilsilano e la sua determinazione, dopo separazione per cromatografia ionica, per reazione post-colonna con difenilcarbazide. I nostri risultati indicano come i due metodi analitici siano equivalenti, purché l effetto matrice venga eliminato attraverso l uso delle cartucce filtranti. L eliminazione dell effetto matrice ha consentito di stabilire che i coloranti possono avere un effetto sia positivo sia negativo sulla formazione di cromo esavalente nelle pelli. Rimangono da determinare le reazioni che producono tali effetti. Il metodo innovativo per I.C. presenta numerosi vantaggi sul metodo ufficiale modificato, in particolare la possibilità di essere automatizzato e, quindi, più conveniente per i laboratori d analisi. 2
3 INTRODUZIONE. La scoperta della presenza di tracce di cromo esavalente in alcune pelli conciate al cromo è piuttosto recente. Questa specie ionica del cromo non è presente nei prodotti usati nelle lavorazioni conciarie e, pertanto, deve formarsi o nelle lavorazioni o durante l uso. Questa reazione di ossidazione ha costituito un serio problema per i chimici del cuoio in quanto il cromo esavalente è un forte ossidante in ambiente acido e quindi la sua formazione richiede la presenza di un ossidante ancora più forte. Inoltre la pelle conciata viene considerata un ambiente riducente e dovrebbe quindi impedire la formazione di questa specie ionica. Va tenuto presente che il cromo esavalente è considerato un composto sicuramente cancerogeno per l uomo e diventa fondamentale determinare con assoluta certezza la sua eventuale presenza nei manufatti che vengono a contatto con il corpo umano. Recentemente diversi studi, tra cui uno condotto nel nostro istituto, suggeriscono in modo convincente che gli agenti ossidanti responsabili siano gli idroperossidi derivanti dalla auto-ossidazione degli oli insaturi impiegati nell ingrasso del cuoio. Chiarita la possibilità reale della formazione di cromati all interno della pelle il dibattito scientifico si è esteso alla affidabilità analitica del metodo I.U.C. 18 (sostanzialmente equivalente al metodo DIN 5334, adottato ufficialmente in Germania) in quanto diversi autori hanno dimostrato come esso possa rivelarsi inaffidabile specialmente in presenza di alcuni tipi di coloranti del cuoio. In particolare alcuni ricercatori spagnoli hanno dimostrato come siano possibili risultati falsamente positivi quando l estratto sia contaminato da tracce di sostanze coloranti non esattamente compensate dal bianco; è stata anche dimostrata da studiosi italiani la possibilità di eliminare tali interferenze su filtrazioni con carboni attivi. Il limite principale del metodo I.U.C. 18 consiste nel fatto che i suoi risultati non sono stati confermati da un metodo indipendente di analisi: il metodo infatti, pur essendo unanimemente riconosciuto come valido per la determinazione di cromati nelle acque reflue industriale e delle acque superficiali, non è mai stato validato in presenza di matrici complesse per torbidità o colorazioni intense. La affermazione contenuta nel metodo che per contenuto di cromo esavalente nelle 3
4 pelli debba intendersi quello determinato con il metodo stesso va considerata erronea in quanto l agente cancerogeno è quello realmente presente e non quello risultante da un metodo analitico non sufficientemente testato. Abbiamo quindi deciso in collaborazione con l università di Padova di confrontare il metodo ufficiale con un metodo analitico potenzialmente più sensibile ed esente da effetti matrice; tale metodo prevede l eliminazione della matrice organica per filtrazione su cartucce di ottadecilsilano, seguita da una separazione del cromato per cromatografia ionica e rivelazione spettrofotometrica dopo reazione post-colonna con difenilcarbazide. Questo metodo è una modificazione del metodo ufficiale americano USEPA 1336 del
5 MATERIALE E METODI PREPARAZIONE DELLE PELLI. Le pelli, ottenute allo stato di wet-blue, sono state lavorate secondo il seguente schema: Sgrassaggio: 100% H 2 O 35 C 1% sgrassante 0,5% Acido ossalico 60 min scaricare, lavare. Neutralizzazione: 100% H 2 O 35 C 1% formiato di sodio 20 0,5% bicarbonato di sodio 60 scaricare, lavare Tintura: 50% H 2 O 35 C 1,5% colorante 25 Ingrasso: +100% H 2 O 70 C 4% Olio di fegato di merluzzo 4% Olio solfitato 60 Fissaggio: +0,5% Acido formico 20 ph=4 scaricare, lavare 150% H 2 O 30 C 2% solfato basico di cromo 20 2% solfato basico di cromo 30 scaricare, lavare. La stessa pelle è stata suddivisa in più parti e tinta con quattro coloranti diversi della Ditta Bayer: 1. BRUNO NRB 2. NERO BASE 3. BAYGENAL 5
6 4. NERO ES. Si sono così ottenuti quattro campioni colorati, mentre un pezzo di pelle non ha subito il processo di tintura, ma è stato soltanto sgrassato, neutralizzato ed ingrassato, ottenendo così un bianco privo di agenti colorati. Dopo queste lavorazioni le pelli sono state stese in essiccatoio fino alla completa eliminazione dell acqua in eccesso, mantenendo un grado di umidità pari al 15% in peso. REAGENTI Soluzione tampone per l estrazione: 22.8g dipotassioidrogenofosfato (K 2 HPO 4 ) sciolti in 1 l di H 2 O; il ph va corretto con acido fosforico sino a rientrare nell intervallo Soluzione di difenilcarbazide: 1 g di 1-5 difenilcarbazide disciolto in 100 ml di acetone ed acidificato con una goccia di acido acetico glaciale. Soluzione di acido fosforico: 700 ml di acido orto-fosforico (d = 1,71 g/ml) in 1 l di acqua distillata. Acqua distillata disaerata MATERIALI. Normale attrezzatura da laboratorio. I reagenti impiegati erano di grado RP e sono stati utilizzati senza ulteriore purificazione. Tutte le soluzioni sono state preparate utilizzando acqua disaerata, ottenuta per ultra-sonicazione sotto vuoto. Lampada a raggi UV Philips, per abbronzamento, dotata di quattro lampade da 40 watt per un totale di 160 W. Clima-test mod. Mazzali Spettrofotometro UV-Visibile Perkin-Elmer Sigma 3B, dotato di celle di vetro con cammino ottico 1 cm. Membrane filtranti con porosità 0,45 µ in naylon. Cartucce filtranti Alltech C18. 6
7 METODI IRRADIAZIONE Le pelli sono state macinate e messe ad irradiare sotto la lampada UV per 24 o 48 ore, all interno di una camera climatica (Clima-test) che ha mantenuto costanti la temperatura a 50 C e l umidità pari al 65%. ESTRAZIONE ED ANALISI Si pesano 2g (+- 0,01g) di ogni campione di pelle macinata e irradiata, introducendoli in beute contenenti 100 ml di soluzione tampone; la sospensione di pelli viene mantenuta in dolce agitazione per 3 ore. L estratto viene filtrato sotto aspirazione con pompa da vuoto in una beuta attraverso un filtro in naylon da 0.45 µ, e si misura il ph della soluzione con phmetro, controllando che il valore sia compreso tra 7,5-8. ANALISI Per ogni singola soluzione si preparano: 1. il campione da analizzare introducendo 10ml della soluzione in un matraccio da 50ml, vi si aggiungono 1 ml di 1-5 difenilcarbazide, 1ml di acido fosforico, portando il tutto a volume ed attendendo 15 minuti prima della lettura spettrofotometrica a 540 nm. 2. Nel bianco, si introducono 10 ml di soluzione in un matraccio da 50 ml e vi si aggiunge 1 ml di acido fosforico, portando poi a volume. 3. Per l indice di recupero, si introducono 10 ml della soluzione in un matraccio da 50 ml, dopo aver fatto la lettura spettrofotometrica del campione a contro bianco b, si calcolano i µg/l di cromo esavalente presenti nella soluzione attraverso la seguente formula Ax Si introduce nel matraccio mediante buretta digitale un volume tale da raddoppiare il cromo esavalente presente, analizzando la soluzione risultante come di consueto. 7
8 RISULTATI Il cromo esavalente formato durante l irradiazione è mostrato nei seguenti grafici che mostrano i risultati ottenuti dai due metodi sui medesimi campioni: Fig. 1 Cromo formato dopo irradiazione per 24 ore CONFRONTO TRA METODO I.U.C. 18 e I.C. (24 ore) y = 0,97x + 101,82 R 2 = 1, ug/l (IC) ug/l (I.U.C 18) E evidente come i due metodi diano risultati concordi, con il metodo I.C. che determina un tenore di cromo costantemente superiore di 102 µg/l rispetto all I.U.C
9 Allungando l irradiazione a 48 ore e introducendo anche per il metodo I.U.C. 18 la pre-filtrazione con cartucce C18 si ottiene il seguente grafico: Fig. 2 Cromo formato per irradiazione di 48 ore CONFRONTO TRA METODO I.U.C. 18 e METODO I.C. (48 ORE) y = 0,875x + 18,92 R 2 = 0,9911 ug/l (I.C.) ug/l (I.U.C 18) Anche in questo caso la correlazione è buona ma la pendenza diminuisce e la maggiore quantità trovata dal metodo I.C. scende a 19 µg/l. Ricordiamo che i valori teorici per l esatta corrispondenza tra i due metodi sono una intercetta di 0 e la pendenza pari a 1. Un ulteriore esperimento è stato condotto, sempre in collaborazione con Padova, ponendo particolare attenzione all indice di recupero. Le analisi condotte presso l università di Padova hanno rivelato che il metodo per cromatografia ionica fornisce indici di recupero fra il 98 ed il 100%, mentre il metodo I.U.C. 18 da noi applicato ha indici di recupero compresi tra 95 e il105%, pienamente corrispondenti alle specifiche del metodo stesso. 9
10 DISCUSSIONE Gli scopi della ricerca erano due: 1. Confrontare il metodo I.U.C. 18 con un metodo indipendente, di semplice ed economica eseguibilità; 2. Verificare l effetto di altre sostanze contenute nella pelle (nel nostro caso coloranti) sulla formazione del cromo esavalente nelle pelli. I nostri dati mostrano come i due metodi forniscano risultati concordi, con il metodo I.C. in grado di fornire valori superiori, sia pure di poco, rispetto a quello standard. Dato che il dato essenziale da determinare è la quantità di cromo esavalente determinato nelle pelli e su questo valore le pelli possono o meno essere commercializzate in Germania ( i limiti imposti vanno da n.r. cioè < 3 ppm a <10 ppm) abbiamo riconvertito i nostri dati in ppm di cromo esavalente rispetto alla pelle. Riconvertendo i calcoli nella nuova unità si ottengono i seguenti grafici: Fig. 3 Confronto tra i ppm trovati (24 ore) IC (ppm) y = 0,9741x + 5,0909 R 2 = 0, IUC 18 (ppm) Si vede come la pendenza della curva sia praticamente quella teorica di 1 ma la mancanza di pre-filtrazione conduce ad una sistematica lettura negativa del metodo IUC 18 di 5 ppm. 10
11 L introduzione delle pre-filtrazione anche nel metodo ufficiale conduce ai seguenti risultati: Fig. 4 Effetto della pre-filtrazione (48 ore) Confronto tra i ppm trovati I.C. (ppm) y = 1,1326x - 0,7531 R 2 = 0, IUC 18 (ppm) Si vede una pendenza ancora prossima ad 1 ma, soprattutto una intercetta ridotta a 0. L introduzione della filtrazione su cartucce C18 evidentemente rende i due metodi equivalenti e questo è fondamentale perché consente di analizzare anche quegli estratti torbidi o fortemente colorati finora non analizzabili. Il metodo I.C., però, differisce soprattutto per le minime quantità di campione necessarie (20 µl sono sufficienti) e per la sensibilità che sembra 10 volte maggiore. Questa elevata sensibilità conferisce una migliore possibilità di studiare la formazione del cromo esavalente nelle pelli con una adeguata precisione. Ovviamente la possibilità di impiegare in I.C. i campionatori automatici consente anche l analisi automatica di un gran numero di estratti in tempi molto rapidi; la cromatografia ionica, infatti, richiede pochi minuti e quindi il vantaggio per i laboratori sarebbe significativo, soprattutto per la riduzione del costo della mano d opera richiesta. Per quanto riguarda il secondo obbiettivo si vede come i coloranti siano in grado di influenzare la formazione del cromo esavalente. 11
12 Infatti, in confronto al bianco non tinto, si nota come la presenza del colorante 1 (Bruno Aciderm NRB) che è un tris-azocolorante con gruppi nitro e OH conduce ad un aumento mentre i coloranti 2, 3 e 4 producono una notevole riduzione del cromo esavalente formato. La conferma di tali dati da parte del metodo I.C. dimostra che, contrariamente a quanto affermato da alcuni autori, non si tratta di un effetto matrice ma di reazioni che avvengono nella pelle durante l irradiazione. Si deve anche escludere che sia la reazione dei coloranti con la difenilcarbazide a fornire risultati non validi: questi sono chiaramente attribuibili all effetto matrice, non eliminato nel metodo IUC 18. La natura delle reazioni sopraccitate va sicuramente indagata ma in ogni caso appare chiaro che il cromo esavalente trovato è indipendente dal colorante, purché si provveda alla citata pre-filtrazione con cartucce di ottadecilsilano. Va segnalato come permangano ancora alcuni dubbi sulla affidabilità del metodo IUC 18 legati a due fattori: 1. Il tampone alcalino a ph=8 impiegato nell estrazione potrebbe rendere il cromo trivalente facilmente ossidabile da parte di composti ossigenati ( ad es. idroperossidi) o comunque ossidanti presenti nella pelle: si troverebbe quindi nell estratto del cromato non presente originariamente nella pelle, che è notoriamente acida; 2. La presenza nell estratto di una matrice organica, non filtrata, potrebbe condurre ad una distruzione del cromato realmente presente, per riduzione nell ambiente acido richiesto dalla reazione con difenilcarbazide. I tempi lunghi richiesti dallo sviluppo del colore (10-15 ) nel metodo ufficiale potrebbero spiegare quei 5 ppm in più determinati dalla I.C., che richiede poco meno di un minuto di reazione. In sostanza la presenza della matrice può condurre in modo imprevedibile a risultati sia falso-positivi sia falso-negativi. 12
13 CONCLUSIONI Il presente lavoro ha mostrato la sostanziale equivalenza del nuovo metodo di determinazione del cromo esavalente nelle pelli per IC a quello ufficiale, purché quest ultimo venga modificato con l aggiunta di una eliminazione della matrice organica con cartucce di ottadecilsilano. Con queste modifiche entrambi i metodi diventano capaci di analizzare gli estratti delle pelli, senza interferenza da parte della matrice. Il metodo I.C. è rapido, economico ed automatizzabile, risultando di grande vantaggio per i laboratori di analisi. La presenza dei coloranti influenza in modo apprezzabile la formazione del cromo esavalente, sia in senso positivo sia negativo. Le modifiche apportate al metodo od il nuovo metodo per I.C. sono ora in grado di valutare quali sostanze siano responsabili di queste variazioni rispetto ai cuoi non tinti. Un primo risultato ottenuto è la scoperta che tali variazioni di cromo esavalente non derivano da reazioni non specifiche della difenilcarbazide od a sistematici effetti matrice ma da reazioni interne alla pelle durante l irradiazione. Silene Zuccon e Anna Fanton 13
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