Efficacia del lavaggio nel ridurre il potassio extracellulare nei globuli rossi concentrati sottoposti ad irradiazione

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1 Efficacia del lavaggio nel ridurre il potassio extracellulare nei globuli rossi concentrati sottoposti ad irradiazione Isabella Ferro, Giorgio Gandini, Massimo Franchini, Marzia de Gironcoli, Daniela Olzer, Pierluigi Piccoli, Giuseppe Aprili Servizio di Immunoematologia e Trasfusione, Azienda Ospedaliera di Verona, Verona (Responsabile: Dott. Giuseppe Aprili) Irradiation of blood components prevents Transfusion Associated Graft versus Host Disease (TA- GvHD). However, by modifying the red blood cell (RBC) membrane, there is an increase in extracellular potassium and a shortened erythrocyte life. The aim of this study was to analyze the extracellular potassium levels in γ-irradiated RBC concentrates, to compare them with non γ-irradiated RBC concentrates and to evaluate from a practical point of view the feasibility and efficacy of washing to remove the extracellular potassium in irradiated RBC concentrates. On days 0, +2, +7, +14, +21, +28, +35 and +42 from collection we measured extracellular potassium levels in 5 units of non irradiated RBCs, in 5 units of irradiated RBCs and in subunits (50 ml) washed under sterile conditions taken from 5 units of irradiated RBCs. Extracellular potassium increase during storage was greater in irradiated RBCs than in non irradiated ones. While there was a slight difference just after irradiation, from day +2 onward extracellular potassium levels in irradiated units were approximately twice that of non irradiated units and this ratio remained constant for the whole conservation period of 42 days. Washing irradiated units reduced extracellular potassium levels 25 times (mean of 48.3 mmol/l pre-washing vs. 2.0 mmol/l post-washing). Washing irradiated RBCs is an effective and simple method of reducing excess extracellular potassium and could be a valid procedure in the management of paediatric transfusions. Parole chiave: lavaggio, globuli rossi concentrati irradiati, potassio extracellulare. Key words: washing, irradiated red blood cells, extracellular potassium. Ricevuto: 6 febbraio Accettato: 9 marzo 2001 Corrispondenza: Dott. Massimo Franchini Servizio di Immunoematologia e Trasfusione Ospedale Policlinico Via delle Menegone, Verona Introduzione La Graft-Versus-Host-Disease (GvHD) è una sindrome comunemente osservata dopo trapianto allogenico di midollo osseo; tuttavia essa può insorgere come rara complicanza della trasfusione allogenica di sangue. Questa temibile complicanza insorge principalmente in pazienti con grave compromissione dell'immunità cellulare, quali i riceventi di un trapianto allogenico di midollo osseo, i neonati prematuri, i pazienti con sindromi da immunodeficienza congenita e i pazienti con malattie oncoematologiche. La GvHD associata a trasfusione (TA- GvHD) 1 è il risultato dell'attecchimento dei linfociti T immunocompetenti trasfusi nel ricevente immunodepresso. I linfociti T attecchiti danno luogo ad una reazione immunologica devastante contro i tessuti dell'ospite, quali la pelle, il fegato, il tratto gastrointestinale, il midollo osseo. La TA-GvHD è generalmente più severa di quella associata a trapianto allogenico di midollo osseo; inoltre, è per lo più scarsamente responsiva al trattamento e spesso fatale 1,2. L'irradiazione con raggi gamma degli emocomponenti cellulati, inattivando i linfociti, si è dimostrata efficace nel prevenire la TA-GvHD 3-7 ; la dose di radiazione consigliata è compresa tra e cgy 8. L'irradiazione tuttavia provoca un danno alla membrana cellulare dei globuli rossi con conseguente rilascio nell'ambiente extracellulare di potassio ed emoglobina e riduzione della sopravvivenza eritrocitaria; per tale motivo, l'irradiazione delle emazie, come anche indicato dalla Raccomandazione n R (95) 15 del Comitato dei Ministri del Consiglio d'europa, deve avvenire entro 14 giorni dal prelievo e le unità irradiate devono essere trasfuse entro 28 giorni dal prelievo L'incremento del potassio extracellulare nelle emazie irradiate può avere implicazioni cliniche quando i globuli rossi irradiati vengono trasfusi in pazienti a rischio di sviluppare iperkaliemia, quali 100 LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol num. 2 marzo-aprile 2001 ( )

2 Lavaggio dei globuli rossi concentrati irradiati i neonati prematuri, e, in particolar modo, quando vengono trasfusi grandi volumi di sangue, come nell'exsanguinotrasfusione e nella trasfusione intrauterina 21. Per tale motivo, in queste situazioni è necessario trasfondere globuli rossi entro 48 ore dall'irradiazione 2. Questo può causare problemi organizzativi soprattutto nella gestione di trasfusioni ripetute di neonati prematuri con mini-sacche derivate da una singola unità irradiata. Scopo di questo lavoro è valutare il livello del potassio extracellulare, a diversi intervalli di tempo, nelle emazie concentrate conservate in SAG-M e sottoposte ad irradiazione con raggi gamma (dose di cgy), confrontandolo con quello delle emazie non irradiate, e verificare la fattibilità e l'efficacia del lavaggio delle emazie concentrate irradiate nel ridurre i livelli di potassio extracellulare. L'operazione veniva ripetuta 2 volte per un tempo complessivo dell'intera operazione pari a circa minuti. Venivano inoltre eseguite emocolture dalle mini-sacche per verificare la sterilità della procedura. Il dosaggio dello ione veniva effettuato al tempo 0 (pre e post-irradiazione nelle unità che venivano irradiate) e nei giorni +2, +14, +21, +28, +35, +42. Sulle unità di globuli rossi concentrati del terzo gruppo il potassio veniva dosato prima e dopo la procedura di lavaggio. Il prelievo per il dosaggio dello ione potassio veniva eseguito prelevando sterilmente (TSCD, Terumo Corporation, Japan) aliquote di 4 ml dalle sacche. Il dosaggio veniva eseguito utilizzando un analizzatore chimico (DAX 96 Technicon, Bayer, Germany) e la concentrazione dello ione espressa in mmol/l. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il t test. Materiali e metodi Il nostro protocollo per lo studio dei livelli di potassio extracellulare nelle emazie conservate dopo irradiazione prevedeva l'utilizzo di 15 unità di sangue intero prelevate da donatori periodici, che hanno dato il consenso informato all'uso non trasfusionale delle unità donate. Ogni unità veniva prelevata in sacche da 450 ml contenenti CPD-A1 e centrifugate a x g per 5 minuti (Heraeus Cryofuge 8000, Germany) entro 2 ore dalla raccolta. Il plasma ricco di piastrine ed il buffy-coat venivano rimossi dalle unità e ai globuli rossi concentrati venivano aggiunti 100 ml di SAG-M. Le 15 unità di globuli rossi concentrati così ottenute erano conservate per 42 giorni a 4 C e venivano suddivise in 3 gruppi ciascuno di 5 unità: il gruppo 1 comprendeva unità non irradiate; il gruppo 2 comprendeva unità irradiate (2.500 cgy) entro 2 ore dalla raccolta con un irradiatore a raggi gamma (Cesio 137) (Gammacell-1000, Canada). Nel terzo gruppo, le 5 unità di globuli rossi concentrati erano irradiate entro 2 ore dalla raccolta con le medesime modalità riportate sopra e ai giorni +2, +7, +14, +21, +28, +35 e +42 dalla raccolta aliquote di 50 ml (per simulare la progressiva creazione di mini-sacche pediatriche) venivano prelevate e trasferite in sistema chiuso con saldatore sterile (TSCD, Terumo Corporation, Japan) in sacche transfer da 300 ml; le emazie in esse contenute venivano sottoposte a lavaggio. La procedura di lavaggio delle emazie prevedeva la centrifugazione a x g per 5 minuti a +4 C, l'allontanamento del sovranatante in sacca transfer sterilmente connessa e la risospensione delle emazie in soluzione salina in modo da ripristinare il volume iniziale della frazione (50 ml). Risultati I livelli del potassio extracellulare prima e durante la conservazione delle unità di globuli rossi non irradiati (gruppo 1), irradiati (gruppo 2), irradiati e lavati (gruppo 3) sono riportati nelle tabelle I III. I valori medi di potassio (Tabella IV) al momento del prelievo e dopo 2, 7, 14, 21, 28, 35, 42 giorni erano 1,3; 8,6; 16,9; 20,9; 25,2; 28,2; 32,3; 38,2 mmol/l nelle unità di globuli rossi non irradiati e rispettivamente di 1,5; 19,4; 33,8; 42,7; 51,4; 59,9; 68,4 e 76,0 mmol/l in quelle di globuli rossi irradiati. L'incremento del potassio extracellulare durante la conservazione delle unità era maggiore nelle unità irradiate rispetto a quelle non irradiate. Tale differenza, statisticamente significativa in tutte le misurazioni, era meno marcata subito dopo l'irradiazione (1,3 vs. 1,5 mmol/l, p <0,05), mentre risultava più marcata nelle successive misurazioni (mediamente ai diversi tempi 24,3 mmol/l vs. 50,2 mmol/l, p <0,001). Infatti, a partire dal secondo giorno dopo l'irradiazione, i valori di potassio extracellulare dei concentrati eritrocitari irradiati risultavano circa il doppio di quelli delle unità non irradiate e tale rapporto di 2:1 si manteneva costante durante tutto il periodo di conservazione del sangue (misurazioni settimanali fino al giorno 42). Il lavaggio delle unità di globuli rossi concentrati (Tabella IV) riduceva i livelli di potassio extracellulare di circa 25 volte (livello medio di potassio extracellulare nei globuli rossi concentrati irradiati pre-lavaggio: 48,3 ±18,6 mmol/l, range 14,5-76,9 mmol/l; livello medio del potassio extracellulare dopo lavaggio delle unità irradiate: 2,0 ± 0,9 mmol/l, range 0,5-3,1 mmol/l). Tutte le emocolture eseguite sulle mini-sacche erano negative. 101

3 I Ferro et al. Tabella I: livelli di potassio extracellulare in 5 unità di globuli rossi concentrati non irradiati (gruppo 1) 0 1,3 1,1 1,4 0,7 1,1 2 9,4 9,2 10,1 4,6 9,9 7 18,6 19,9 22,1 9,5 14, ,6 22,4 24,6 15,8 20, ,3 26,6 31,0 20,6 22, ,0 30,4 33,1 24,4 26, ,1 34,4 37,1 26,9 28, ,7 38,4 44,7 30,9 35,2 Tabella II: livelli di potassio extracellulare in 5 unità di globuli rossi concentrati irradiati (gruppo 2) 0 (pre-irradiazione) 1,3 1,4 1,5 1,2 1,4 0 (post-irradiazione) 1,6 1,6 1,8 1,4 1,5 2 21,6 20,8 20,6 19,3 19,1 7 35,1 38,2 39,8 31,3 32, ,2 43,8 50,1 38,8 38, ,6 55,3 56,4 51,9 50, ,4 62,2 64,5 62,6 65, ,1 73,1 74,2 69,9 67, ,1 78,4 80,1 78,0 75,4 Tabella III: livelli di potassio extracellulare prima e dopo lavaggio in 5 unità di globuli rossi concentrati irradiati (gruppo 3) Pre-lavag. Post-lavag. Pre-lavag. Post-lavag. Pre-lavag. Post-lavag. Pre-lavag. Post-lavag. Pre-lavag. Post-lavag. 0 (pre-irr.) 1,0-1,5-1,3-1,4-1,4-0 (post-irr.) 1,3-1,9-1,6-1,4-1,8-2 14,5 0,4 29,9 0,7 16,2 0,4 17,4 0,4 14,7 0,4 7 29,1 1,2 43,6 1,6 32,1 1,7 31,0 1,4 26,1 0, ,6 1,8 47,8 1,9 39,6 1,9 37,7 1,7 39,9 1, ,6 2,2 54,5 2,0 47,1 2,1 52,2 1,9 45,5 1, ,7 2,5 58,8 2,6 56,2 2,7 57,7 2,4 50,4 2, ,7 2,7 68,7 2,9 64,3 3,1 63,8 2,8 64,4 2, ,7 2,9 74,2 3,3 73,3 3,5 71,4 3,0 76,9 3,1 Tabella IV: valori medi di potassio nelle unità di globuli rossi concentrati non irradiate, irradiate ed irradiate e lavate Giorno Unità non irradiate (gruppo 1) Unità irradiate (gruppo 2) p* Unità irradiate e lavate (gruppo 3) Media DS (range) Media DS (range) Media DS (range) 0 1,3 ±0,2 (0,7-1,5) 1,5 ±0,2 (1,1-1,9) <0, ,6 ±2,3 (4,6-10,1) 19,4 ±4,5 (14,5-29,9) <0,0001 0,5 ±0,1 (0,4-0,7) 7 16,9 ±5,0 (9,5-22,1) 33,8 ±4,5 (26,1-43,6) <0,0001 1,3 ±0,4 (0,8-1,7) 14 20,9 ±3,3 (15,8-24,6) 42,7 ±4,5 (37,7-50,1) <0,0001 1,7 ±0,2 (1,3-1,9) 21 25,2 ±4,0 (20,6-31,0) 51,4 ±3,5 (45,5-56,49 <0,0001 2,0 ±0,1 (1,9-2,2) 28 28,2 ±3,5 (24,4-33,1) 59,9 ±4,5 (50,4-65,5) <0,0001 2,5 ±0,2 (2,3-2,7) 35 32,3 ±4,2 (26,9-37,1) 68,4 ±3,6 (64,4-74,2) <0,0001 2,9 ±0,1 (2,8-3,1) 42 38,2 ±5,4 (30,9-44,7) 76,0 ±2,6 (66,9-80,1) <0,0001 3,1 ±0,2 (2,9-3,5) * Unità non irradiate (gruppo 1) vs. unità irradiate (gruppo 2). 102

4 Lavaggio dei globuli rossi concentrati irradiati Discussione L'irradiazione degli emocomponenti ha lo scopo di prevenire la Graft versus Host Disease associata a trasfusione (TA-GvHD), una rara ma spesso fatale malattia derivata dall'attecchimento dei linfociti T del donatore immunocompetente in un ricevente con un sistema immunitario compromesso: i linfociti T del donatore di sangue danno luogo ad una reazione immunologica diretta contro i tessuti del ricevente 1-3. L'irradiazione degli emocomponenti ad un dosaggio compreso tra e cgy si è dimostrata in grado di prevenire la Graft versus Host Disease associata a trasfusione, inattivando i linfociti T e preservando la funzione di eritrociti e piastrine 3-6. Esistono tuttavia studi che evidenziano che l'irradiazione dei globuli rossi determina una modificazione della membrana cellulare e, in particolare, della pompa sodiopotassio con incremento del potassio extracellulare 9,10,17. È stato, infatti, osservato che i globuli rossi irradiati contengono circa il doppio dei livelli di potassio extracellulare rispetto ai globuli rossi non irradiati: questo rapporto di 2:1 diviene evidente circa dopo 2 giorni dall'irradiazione e si mantiene costante durante tutto il periodo della conservazione Per tale motivo, in alcuni pazienti a rischio di sviluppare iperkaliemia, quali i neonati prematuri, e, in particolare, quando vengono trasfuse grandi quantità di sangue come nell'exsanguino-trasfusione e nella trasfusione intrauterina, si raccomanda di trasfondere globuli rossi irradiati entro 48 ore 2. Il nostro studio conferma i risultati evidenziati precedentemente 10,12-15,17 : i livelli di potassio extracellulare nei globuli rossi conservati in SAG-M e irradiati con cgy entro 2 ore dal prelievo risultavano lievemente aumentati subito dopo l'irradiazione rispetto a quelli misurati nei globuli rossi non irradiati (1,5 vs. 1,3 mmol/l, p<0,05). Misurazioni eseguite a partire dal secondo giorno e ripetute ogni 7 giorni fino alla scadenza delle unità (giorno 42), evidenziavano livelli medi di potassio extracellulare circa doppi nei globuli rossi irradiati rispetto a quelli non irradiati (50,2 vs. 24,3 mmol/l, p<0,001). Il lavaggio delle emazie irradiate riduceva di circa 25 volte il livello medio di potassio extracellulare (48,3 vs. 2,0 mmol/l) riportando i valori ad un livello lievemente superiore a quello misurato nei globuli rossi subito dopo l'irradiazione, ma, comunque, nettamente inferiore a quello misurato già a 48 ore dal prelievo anche in globuli rossi concentrati non irradiati. Il nostro studio conferma l'importanza di trasfondere globuli rossi entro 48 ore dall'irradiazione in tutti quei pazienti che necessitano di sangue irradiato e che sono a rischio di sviluppare iperkaliemia: le emazie appena irradiate contengono infatti livelli di potassio plasmatico nettamente inferiore a quelli misurati successivamente durante la conservazione. In alternativa, il lavaggio delle emazie entro poche ore prima della trasfusione, rimuovendo l'eccesso di potassio, consente di trasfondere in tali pazienti globuli rossi anche a distanza di più di 48 ore dall'irradiazione, con impatto organizzativo complessivamente ben accettabile. In particolare, il lavaggio può rendere più semplice la gestione delle trasfusioni ad un unico soggetto di minisacche pediatriche ottenute a partire da un'unica sacca madre di eritrociti concentrati, irradiata entro 48 ore dal prelievo; le mini-sacche possono essere generate al bisogno, sottoposte a lavaggio e quindi trasfuse. In questo modo, è possibile rispettare il criterio di ridurre il numero di esposizioni a diverse unità di sangue allogenico e, contemporaneamente, semplificare la corretta gestione dell'irradiazione del sangue trasfuso e della potassiemia del paziente. Nella nostra esperienza, la procedura di lavaggio è una metodica semplice e rapida con un buona compliance da parte degli operatori, eseguibile nella normale attività routinaria delle strutture trasfusionali. Il lavaggio delle emazie irradiate è, a nostro avviso, una metodica sicura ed efficace nel ridurre il potassio extracellulare nei concentrati eritrocitari irradiati, consentendone la trasfusione in particolari categorie di pazienti a rischio di sviluppare iperkaliemia. Riassunto L'irradiazione degli emocomponenti previene la Graft versus Host Disease associata a trasfusione. Tuttavia essa, alterando la membrana cellulare dei globuli rossi, determina un incremento del potassio extracellulare ed una ridotta sopravvivenza eritrocitaria. Scopo di questo studio è stato analizzare la concentrazione di potassio extracellulare nei globuli rossi concentrati irradiati conservati in SAG-M confrontandola con quella nei globuli rossi concentrati non irradiati e verificare l'efficacia e la fattibilità del lavaggio nel rimuovere il potassio extracellulare negli emocomponenti irradiati. Ai giorni 0, 2, 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dal prelievo sono stati misurati i livelli di potassio extracellulare in 5 unità di globuli rossi non irradiati, in 5 unità di globuli rossi irradiati entro 2 ore dal prelievo ed in 5 unità di globuli rossi irradiati e lavati. 103

5 I Ferro et al. L'incremento del potassio extracellulare durante la conservazione risultava maggiore nelle unità di globuli rossi concentrati irradiati rispetto a quelli non irradiati: mentre tale differenza era lieve subito dopo l'irradiazione, a partire dal giorno 2 i livelli di potassio nelle unità irradiate erano circa il doppio di quelli nelle unità non irradiate e tale rapporto si manteneva costante durante tutto il periodo di conservazione (42 giorni). Il lavaggio delle unità irradiate riduceva di circa 25 volte il livello del potassio extracellulare (50,2 mmol/l pre-lavaggio vs. 2,0 mmol/l post-lavaggio) portandolo a valori simili a quelli rilevati nelle unità appena prelevate. Il lavaggio delle emazie irradiate si è dimostrato una metodica efficace e semplice nel ridurre il potassio extracellulare in eccesso. Bibliografia 1) Commission of the European Communities: EC Guide to Good Manufacturing Practice, Vol. I.V. Annex 12, Use of Ionising Radiation in the Manufacture of Medicinal Products ) Hillyer CD, Tiegerman KO, Berkman EM: Evaluation of the red cell storage lesion after irradiation in filtered packed red cell units. Transfusion, 31, 497, ) Button W, DeWolf WC, Newburger PE et al.: The effect of irradiation on blood components. Transfusion, 21, 419, ) Moore GL, Ledford ME: Effects of 4000 rad irradiation on the in vitro storage properties of packed red cells. Transfusion, 25, 583, ) Ramirez AM, Woodfield DG, Scott R, McLachlan J: High potassium levels in stored irradiated blood (Letter). Transfusion, 27, 444, ) Rivet C, Baxter A, Rock G: Potassium levels in irradiated blood (Letter). Transfusion, 29, 185, ) Ferguson DJ: Potassium levels in irradiated blood (Letter). Transfusion, 29, 749, ) Avoy DR: Potassium levels in irradiated blood (Letter). Transfusion, 30, 764, ) Swann ID, Williamson LM: Potassium loss from leucodepleted red cells following γ-irradiation (Letter). Vox Sang, 70, 117, ) BCSH Blood Transfusion Task Force (Chairman: D. Voak): Guidlines on gamma irradiation of blood components for the prevention of transfusion-associated graft-versus-host disease. Transfus Med, 6, 261, ) Masterson ME, Febo R: Pretransfusion blood irradiation: clinical rationale and dosemetric consideration. Med Phys, 19, 649, ) Win N, Logan RW, Cameron A: Post-irradiation plasma potassium and intra-uterine transfusion (Letter). Vox Sang, 73, 56, ) Brugnara C, Churchill WH: Effect of irradiation on red cell cation content and transport. Transfusion, 32, 246, ) Moroff G, Luban NLC: The irradiation of blood and blood components to prevent graft versus host disease: technical issues and guidelines. Transf Med Rev, 11, 15, ) Anand AJ, Dzik WH, Imam A, Sadrzadeh SMH: Radiationinduced red cell damage: role of reactive oxygen species. Transfusion, 37, 160, ) Moroff G, Leitman SF, Luban NLC: Principles of blood irradiation, dose validation, and quality control. Transfusion, 37, 1084, ) Davey RJ, McCoy NC, Yu M et al.: The effect of prestorage irradiation on posttransfusion red cell survival. Transfusion, 32, 525, ) Linden JV, Pisciotto PT: Transfusion-associated graft versus host disease and blood irradiation. Transf Med Rev, 6, 116, ) Leitman SF, Holland PV: Irradiation of blood products. Indications and guidelines. Transfusion, 25, 293, ) Anderson KC, Goodnough LT, Sayers M et al.: Variation in blood component irradiation practice: implications for prevention of transfusion associated graft versus host disease. Blood, 77, 2096, ) Mintz PD, Anderson G: Effect of gamma irradiation on the in vivo recovery of stored red blood cells. Ann Clin Lab Sci, 23, 216,