XXIV Corso Nazionale di Aggiornamento. Giuseppe Palladino Scientific Affairs Manager Bellco
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2 XXIV Corso Nazionale di Aggiornamento La terza dimensione nella depurazione extracorporea Giuseppe Palladino Scientific Affairs Manager Bellco XXIV Corso Nazionale di Aggiornamento, Riccione 12 Aprile 2015
3 Quali tossine uremiche dovrebbero essere rimosse? Tossine Uremiche
4 Tossine Uremiche Piccole Molecole Peptidi e proteine a basso PM Tossine legate alle proteine Indoxyl-solfato Acido Ippurico (179) Spermina(203) Spermidina (145) Putrescine (88) p-cresolo (108) Peptidi - AGE Creatinina (113) Fosfati (96) Urea (60) Omocisteina (135) ß-endorfina (3,5 k) calcitonina (3,8 k) endotelina (4,3 k) PTH (9,4 k) ß2-microglobulina (11,8 k) leptina (16 k) angiogenina (14 k) Interleuchina-1 (17,5 k) interleuchine (21-26 k) Fattore D (24 k) fattore Ba (33 k) albumina (66 k) TNFα (45 k) 1 1,4 3,5 3,8 4,3 9,4 11, , Peso Molecolare (kda) Adattato da: Vanholder R et al, Kidney International (2003), 63;
5 Normal and Pathologic Concentrations of Uremic Toxins water soluble Protein bound Middle molecules 28% 46% 25% Duranton F et al. J Am Soc Nephrol 23: , 2012
6 Tipologia di passaggio dei soluti: diffusione Fattore limitante: permeabilità diffusiva (Ko) Soluti a piccolo peso Soluti a medio-alto peso Selettività di rimozione in base al peso molecolare Piccole molecole Medie molecole Tossine legate alle proteine Parte libera delle tossine legate alle proteine
7 Tipologia di passaggio dei soluti: convezione Fattore limitante: permeabilità idraulica (Kuf) Soluti a piccolo peso Soluti a medio-alto peso Nessuna selettività in base al peso molecolare fino al cut-off della membrana Piccole molecole Medie molecole Tossine legate alle proteine Parte libera delle tossine legate alle proteine
8 La terza dimensione : adsorbimento Fattore limitante: emo-compatibilità dei sistemi Rimozione più o meno selettiva, si evita la perdita di nutrienti Rimozione di tossine non dializzabili Possibilità di aumento della permeabilità della membrana dialitica
9 Perché i sorbenti? Capacità di rimuovere specifiche tossine o classi di tossine es. β2 Microglobulina, citochine (sepsi) Incrementare la rimozione di soluti oltre il trasporto convettivo/diffusivo es. tossine legate alle proteine Possibilità di uso orale per pazienti in CKD non ancora in dialisi (AST-120) Capacità di purificare il dializzato (riduzione acqua necessaria) es. Sistema REDY e successive modifiche
10 Vantaggi Permettono di rimuovere un particolare soluto e nello stesso tempo evitano la perdita di altri Sorbenti altamente specifici permettono di rimuovere soluti specifici Rimozione non selettiva Sorbenti a bassa selettività possono rimuovere differenti soluti contemporaneamente Possono essere usati per il trattamento di avvelenamenti o per la rimozioni di tossine del fegato Rimozione di tossine non dializzabili (o difficilmente dializzabili) L adsorbimento di soluti permette la diffusione di altri e la liberazione di tossine legate alle proteine
11 L uso dei sorbenti in sistemi di purificazione del sangue è arte nota Muirhead EE, Reid AF Resin artificial kidney J Lab Clin Med1948; 33: Amberlite IR-100 H (Cation / anion exchange resin) Scopo Animals / in vitro Depurazione dell urea Effetti collaterali Emolisi Severi effetti collaterali Schreiner GE The role of hemodialysis (artificial kidney) in acute poisoning AMA Arch Intern Med1958; 102 (6): Lactate anion exchange resin Avvelenamenti (Pentobarbital) Problemi con gli elettroliti Emolisi Reazioni febbrili Shaldon S et al. Sorbent regeneration of ultrafiltrate as a long-term treatment of end-stage renal failure Artif Organs 1978; 4: Urease cartridge, zirconium phosphate (Redy ) Rigenerazione del dialisato (HD) o uf (HF) Problemi con gli elettroliti Rilascio di alluminio
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13 Che cos è la cromatografia? Insieme di tecniche atte a separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo Basate sulla distribuzione differenziale dei vari componenti il sorbente e l eluente che fluisce in continuo attraverso la fase fissa
14 Alcune definizioni Sorbente: Materiale poroso con elevata area Eluente superficiale in grado di adsorbire differenti soluti mediante forze intermolecolari Fase stazionaria Eluente (fase mobile): il vettore che provoca il trasporto dei soluti all interno della colonna Eluato: fase mobile contenente i soluti che Eluato fuoriescono dalla colonna
15 Come lavorano i sorbenti? Adsorbimento: adesione di una molecola alla superfice Generalmente è reversibile => equilibrio chimico Elevata concentrazione in soluzione => maggiore soluto legato Diversi meccanismi di legame: Forze di Van der Waals Legami a idrogeno Forze elettrostatiche Legami covalenti (molto rari)
16 Caratteristiche strutturali Elevate aree superficiali, diverse dimensioni dei granuli Aree superficiali tipiche vanno dai m 2 /g Più piccole sono le particelle maggiore è la resistenza al flusso (aumento pressioni) pore diameter BEAD diameter Stephan Harm et al Blood Purif 2016;41:55 63
17 Fase mobile e fase stazionaria Sono scelte in modo che i componenti della miscela da separare si distribuiscano tra le due fasi Quelli più affini alla fase stazionaria passeranno più tempo in questa fase, quindi si sposteranno più lentamente attraverso il sistema Quelli più affini alla fase mobile si sposteranno invece più velocemente
18 Equilibrio e Ripartizione La migrazione dei soluti è legata alla diversa affinità dei componenti per il sorbente e la loro solubilità nel solvente La natura chimica delle sostanze da separare Tipo e la natura del solvente Tipo e la natura del sorbente A m A s k D (A) < k D (B) A B A B Flusso fase mobile Tanto più k D è alta, tanto più il soluto trascorre tempo nella fase stazionaria e migra lentamente.
19 Teoria Cinetica: fattori influenzanti gli equilibri Velocità di flusso Percorsi multipli o alla diffusione vorticosa (A) Resistenza al trasferimento di massa (C) Equazione di van Deemter Valore minimo di H (max efficienza) per valori bassi di μ. J.J. van Deemter et al. Chem Eng Sci; 1956, 5 (6):
20 I meccanismi della separazione E possibile suddividerli in base ai tipi di interazione tra le due fasi Adsorbimento Ripartizione Scambio ionico Esclusione Affinità La fase stazionaria interagisce con i componenti da separare in maniera diversa con l effetto di diversificare la loro velocità e quindi il tempo di transito
21 Adsorbimento Fase stazionaria: granuli (o polvere stesa su un supporto) Possibilità di siti attivi sulla superficie che possono stabilire legami deboli con le molecole della miscela da separare. Fase mobile: Può essere un gas o un liquido Soluti disciolti nella fase mobile Uso: utilizzata per separare sostanze neutre polari o non polari, di natura organica o inorganica Soluti adsorbiti sulla superfice della fase fissa
22 Ripartizione Fase stazionaria: un liquido che impregna la superficie di un solido inerte. Le molecole da separare sono solubili nel liquido Immiscibilità tra fase stazionaria e fase mobile Fase mobile: Può essere un gas o un liquido Durante l eluizione le molecole si ripartiscono tra le due fasi secondo la diversa solubilità di ognuna Soluti disciolti nella fase mobile Uso: separazione di sostanze organiche Si distingue in: fase normale: fase stazionaria più polare della fase mobile fase inversa: fase stazionaria meno polare della fase mobile. Fase fissa Soluti adsorbiti sulla superfice della fase fissa
23 Scambio ionico Fase stazionaria: polimero inerte contenente siti attivi ionizzati o ionizzabili Meccanismo di separazione: competizione per i siti di scambio tra gli ioni presenti nella fase mobile e quelli presenti nel campione. Uso: impiegata per la separazione di sostanze ioniche o ionizzabili
24 Esclusione dimensionale Fase stazionaria: solido poroso o un gel. Meccanismo di separazione: i soluti si separano se hanno dimensioni compatibili con i pori del sorbente. Le molecole più grandi sono escluse ed escono per prima Si parla di cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) Gel permeazione per la separazione di sostanze insolubili in acqua Gel filtrazione per la separazione di sostanze solubili in acqua Uso: separazione di molecole di grandi dimensioni
25 Affinità Fase stazionaria: matrice solida con siti di legame specifici Meccanismo di separazione: reazioni di tipo biochimico, reversibili e molto specifiche Molecola A Uso: separazione di molecole di interesse prevalentemente biochimico Ligando specifico per A Altre molecole non affini al ligando
26 Idrofobicità - Idrofilicità Sito polare Sito non polare Siti polari sull esterno in grado di formare legami H con l acqua Regione interna idrofobica siti di catena non polari
27 Come funziona le resine? micro 1. Interfase 2. Intrafase 3. Sottile film superficiale 4. Molecole grandi si legano alla superficie 5. Quelle piccole diffondono all interno nano 6. Adsorbimento o Eluizione L idrofobicità o l idrofilicità delle proteine gioca un ruolo importante nelle separazioni
28 Terapie adsorbitive: applicazioni biologiche Reinfusione Albumina IgG Ritenzione Tossine Tossine tempo
29 Effetto della velocità lineare r Flusso, ml/min Velocità lineare, cm/h r= 2 r=4 r=
30 Differenze nelle velocità lineari (r= 2 cm) 100 Situazione Ideale Adsorbimento (%) Situazione reale Velocità lineare, cm/h Velocità lineare, cm/h Emo-perfusione Flusso, ml/min Velocità lineare, cm/h 1500 Uf - Plasma perfusione Flusso, ml/min
31 Emo-perfusione vs Plasma/ultrafiltrato perfusione Qb=180 ml/min Flow rate Qb= ml/min Flow rate Quf ~ ml/min Volume di sangue trattato maggiore Fouling Superfice Velocità lineare elevata Attivazione cellulare Adsorbimento Limitato Tempo di contatto maggiore tra resina e plasma Maggiore diffusione e adsorbimento Migliore adsorbimento
32 Conclusioni L uso di terapie extracorporee adsorbitive è in costante aumento L adsorbimento è governato dalle leggi delle cromatografia La velocità lineare è un fattore differenziante La plasma/uf perfusione è preferibile all emo perfusione
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