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3 ACIL CoA DEIDROGENASI

4 La membrana mitocondriale non è permeabile al NADH citosolico. Speciali sistemi navetta (shuttle) trasportano gli equivalenti riducenti dal NADH citosolico all interno dei mitocondri

5 I principali sistemi navetta sono: Shuttle glicerolo fosfato (muscoli, tessuto nervoso) Shuttle malato-aspartato (fegato, reni cuore)

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8 RESA IN ATP PER MOLECOLA DI Glc OSSIDATA Glicolisi Glc Glc-6P -1 ATP Frut-6P Frut1,6P -1 ATP 2 NADH (shuttle) ATP Fosforilazione a livello del substrato + 2 ATP Dec ossidativa piruvato 2 NADH + 5 ATP Ciclo di Krebs 6NADH + 15 ATP 2FAH2 + 3 ATP 2GTP + 2 ATP 30 o 32 ATP

9 Il flusso degli e - è accompagnato da una traslocazione di H + che produce un gradiente chimico ( ph) e un gradiente elettrico ( ψ ψ). Si crea così un gradiente elettrochimico che genera la forza motrice protonica che fornisce l'energia per la sintesi di ATP quando gli H + ritornano nella o matrice attraverso una canale protonico, F, 1 associato con il complesso F dell ATP sintasi

10 Mitocondrio di Neurospora in un campione congelato in assenza di fissativi o coloranti che possano alterare le caratteristiche delle strutture interne. Wadsworth Center. Creste tubulari si connettono alla membrana interna attraverso passaggi stretti che possono limitare la velocità di equilibrio di H+ fra il lume delle creste e lo spazio intermembrana. Ci sono evidenze che i protoni estratti dalla matrice si disperdono lungo la superficie anionica delle membrane e solo lentamente si equilibrano con il grosso della fase circostante, massimizzando il reale gradiente di H+.

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13 Il dinitrofenolo (DNF) è un disaccoppiante della FO Il DNF possiede un protone dissociabile ed è molto idrofobico: agisce trasportando H + attraverso la membr. mitoc. int. e dissipando il gradiente protonico

14 I mitocondri manipolati in modo da generare una differenza di ph e di carica tra le due superfici della membrana interna sintetizzano ATP in assenza di un substrato ossidabile: la forza motrice protonica è sufficiente a favorire la sintesi di ATP scaricato da

15 L ATP sintasi, detta anche complesso V, è formata da due componenti distinte: 1 F, una proteina periferica della membrana (il primo fattore identificato) o F, una proteina integrale della membrana (o sta ad indicare che questa è la porzione che conferisce al complesso la sensibilità all oligomicina) scaricato da

16 In laboratorio, piccole vescicole della membr. mitoc. 1 int. mancanti di F sono in grado di catalizzare il trasferimento degli e - ma non possono produrre ATP Quando F 1 purificato viene aggiunto alle vescicole esso si riassocia ad F o e può catalizzare la sintesi di ATP 1 La porzione F isolata catalizza l idrolisi (non la sintesi) 1

17 L ATP sintasi, detta anche complesso V, è formata da due componenti distinte: 1 F, una proteina periferica della membrana o F, una proteina integrale della membrana scaricato da

18 1 F ha una forma a pomello ed è costituita da un alternanza di subunità α e β disposte come gli spicchi di un arancia. La subunità γ attraversa il centro della struttura sferoidale costituendo l asta del pomello.

19 Più precisamente, γ contiene un dominio che attraversa F 1 ed un altro dominio che è associato ad una delle tre subunità β È proprio l associazione di γ con le subunità β che costringe ciascuna di esse ad assumere conformazioni differenti e con diverse affinità per i nucleotidi

20 1 F consiste in 9 subunità di 5 tipi diversi, con la 3 3 composizione α β γ δε γ ed ε costituiscono una sorta di gamba e piede

21 o Il canale protonico F composto da 3 tipi di è 2 10 subunità: ab c 2

22 o F Vista laterale Vista frontale Ciascuna delle dieci subunità c (organizzate in 2 cerchi concentrici) sono formate da due eliche transmembrana Le eliche N-terminali sono situate all interno; quelle C-terminali all esterno scaricato da

23 Subunità γ La subunità a si lega all anello esterno La colonna esteriore ha 1 subunità a 2 subunità b, e la subunità δ Subunità α ATP sintasi Il rotore è l anello is c & γε Il rimanente è stazionario (statore) Subunità dell anello c 0 F contiene l anello del canale protonico 1 di subunità c La subunità F ha 5 tipi di catena polipetidica 3 Subunità (α3, β, γ, β δ, subunit ε), e presenta attività ATPasica α& β sono membri della famiglia P-loop

24 Meccanismo di sintesi dell ATP i Un atomo di ossigeno dell ADP attacca il fosforo del P per formare un intermedio pentavalente che poi forma ATP e rilascio una molecola di H 2 O

25 Osservazione della rotazione dell ATP sintasi scaricato da marcato con fluoresceina e legato alla subunità γ La rotazione osservata mediante un microscopio a fluorescenza dopo idrolisi di ATP 3 L esamero α3β fissato su una superficie

26 Componenti dell unita di conduzione dei protoni scaricato da 2 α helices span the membrane Structure not yet directly observed

27 Subunit c Asp 61 in the middle of the second helix

28 Subunit a Proton enters Proton exits

29 Proton motion across the membrane drives rotation scaricato da Proton enters cytosolic half-channel, neutralizes Asp Proton enters matrix, resetting system Asp enters matrix half-channel

30 Proton path through the membrane Cytosolic half-channel Matrix half-channel

31 o La reazione sulla superficie di F F ha un G vicino allo 0, con una K eq di circa 1: si tratta, cioè, di una reazione reversibile F isolata catalizza invece l idrolisi, non la sintesi, 1 di ATP (tanto da venir chiamata F ATPasi) con un 0

32 L ATP sintasi rende l'atp stabile quanto i suoi prodotti di idrolisi ADP e Pi, legando molto saldamente l'atp e fornendo in questo modo l'energia necessaria per controbilanciare quella richiesta per la sintesi dell ATP stesso

33 F o F 1 lega l'atp con un affinità 7 10 più elevata di quella con cui lega l ADP Questa differenza di energia di legame è sufficiente a spostare l'equilibrio verso la formazione del prodotto ATP

34 Nella reazione catalizzata dall'atp sintasi la principale barriera energetica non è la sintesi di ATP ma il suo rilascio dall'enzima L'energia libera richiesta per il rilascio dell ATP è fornita dalla forza motrice protonica

35 Per la continua sintesi di ATP, l'enzima deve effettuare un ciclo tra una forma che lega saldamente ATP e una forma che lo rilascia Studi chimici e cristallografici sull ATP sintasi hanno rivelato le basi strutturali di questa alternanza di funzionalità

36 F 1 possiede tre siti di legame per nucleotidi adenilici, uno per ogni coppia αβ, con conformazioni non equivalenti I tre siti attivi di F 1 catalizzano a turno la sintesi di ATP (catalisi rotazionale)

37 Le tre conformazioni sono: - β-atp che lega saldamente l ATP - β-adp che lega debolmente l ATP - β -vuota che lega l ATP ancora più debolmente La forza motrice protonica provoca la rotazione del cilindro c e di γ (freccia verde) ed il contatto di questa con ciascuna coppia αβ

38 Ciò produce una modificazione conformazionale cooperativa: - il sito β-atp è convertito nella conformazione β-vuota e rilascia l'atp β -ADP è convertito in β -ATP, che provoca la condensazione di ADP e Pi per formare ATP - β -vuoto diventa β -ADP che lega debolmente ADP e Pi provenienti dal solvente L'ATP non può essere rilasciato da un sito finché ADP e Pi non sono legati all'altro scaricato da

39 Il passaggio di H + attraverso la porzione F o provoca la rotazione del cilindro costituito dalle subunità c e dalla subunità y ad esso attaccata. Ogni rotazione di 120 pone in contatto y con una diversa subunità β e la costringe ad assumere la conformazione β-vuota.

40 Le tre subunità β interagiscono tra di loro in modo tale che quando una assume la conformazione β-vuota, la subunità presente su di un lato deve assumere la forma β-adp mentre quella sull'altro lato acquista la conformazione β-atp

41 Per ogni rotazione completa di γ, ogni subunità β compie un ciclo attraverso le tre possibili conformazioni e vengono sintetizzate e rilasciate dalla superficie dell enzima tre molecole di ATP

42 Per molti anni i libri di testo hanno riportato un rapporto P/O = 3 quando il donatore di e - era il NADH un rapporto P/O = 2 quando il donatore di e - era il succinato L'introduzione della teoria chemiosmotica consentì di ipotizzare che il rapporto P/O non fosse necessariamente un numero intero.

43 + Si è stabilito che il numero di H - pompati fuori per coppia di e trasportati è di 10 per il NADH e di 6 per il succinato. + Si è concordato che il numero di H richiesti per la sintesi di una molecola di ATP è di 4, di cui uno è usato per trasportare Pi, ATP e ADP attraverso la membr. mitoc.

44 Il rapporto P/O è 2.5 (10:4) quando il donatore di e - è il NADH Il rapporto P/O è 1.5 (6:4) quando il donatore di e - è il succinato

45 La funzione dell'atp sintasi è strettamente integrata con quella di due traslocasi: - t. dei nucleotidi adenilici (antiporto) - t. del fosfato (simporto) Nel loro insieme le tre proteine costituiscono un complesso, l ATP sintasoma

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47 La traslocasi dei nucleotidi adenilici lega una molecola 3- di ADP nello spazio intermembrana e la trasporta nella matrice, in antiporto con 4- una molecola di ATP Questo trasporto di 4 cariche negative all'esterno e 3 all'interno è favorito dal fatto che la matrice è

48 La fosfato traslocasi catalizza il simporto nella matrice di uno ione H 2 PO 4 - e di uno ione H +. Anche questo processo è favorito dal gradiente + protonico: un H passa dal lato p al lato n della membrana interna, consumando parte dell'energia prodotta dal trasferimento degli e -.

49 - 2 Per ogni coppia di e vengono prodotte che arriva all O 1.5 molecole di ATP nello shuttle del glicerolo 3P 2.5 molecole di ATP nello shuttle Mal-Asp

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51 L'ossidazione completa di una molecola di Glc produce 30/32 molecole di ATP, mentre la glicolisi anaerobia ne produce solo 2 La via ossidativa aerobia accoppiata alla FO è dunque la fonte primaria dell ATP prodotto dal catabolismo

52 La velocità di ossidazione delle sostanze nutrienti è finemente regolata in modo tale da produrre una quantità di ATP adeguata alle necessità energetiche della cellula

53 La velocità della respirazione (consumo di O 2 ) nei mitocondri è altamente controllata e strettamente dipendente dalla concentrazione dell ADP (controllo dell'accettore della respirazione) Avendo a disposizione più ADP per la FO ossidativa, la velocità della respirazione aumenta, determinando la rigenerazione dell'atp

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55 Nei neonati e negli animali in letargo vi è un particolare tipo di tessuto adiposo, chiamato grasso bruno (per la per la presenza di numerosi mitocondri) Questi mitocondri possiedono nella loro membrana interna una proteina speciale, la termogenina, chiamata anche proteina disaccoppiante scaricato da

56 Questa proteina costituisce una via di ritorno o 1 per gli H + che non attraversano F F per effetto di questo cortocircuito, l'energia delle ossidazioni non viene utilizzata per produrre ATP ma viene dissipata come calore necessario a mantenere il corpo a temperatura costante

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58 Quando una cellula è ischemica (privata di O 2 ), come avviene durante un attacco di cuore, il - + trasferimento di e all O 2 e il pompaggio di H si interrompono, e la forza motrice protonica collassa immediatamente In queste condizioni, l ATP sintasi potrebbe agire in modo opposto, idrolizzando l'atp per pompare gli H + nella direzione inversa e causando una disastrosa riduzione dei livelli di ATP scaricato da

59 Ciò viene impedito da una piccola (84 aa) proteina inibitrice, IF 1, che lega simultaneamente due molecole di ATP sintasi, inibendo la loro attività ATPasica L'inibitore è attivo solo nella sua forma dimerica, che si produce a valori di ph inferiori a 6,5. In una cellula privata di O 2, la glicolisi anaerobia fa abbassare il ph, favorendo la dimerizzazione di IF 1 Quando viene ripristinato il metabolismo aerobio, il ph sale, il dimero IF 1 si destabilizza e l'inibizione dell'atp sintasi viene rimossa. scaricato da

60 SVANTAGGI DELLA F.O. Specie reattive dell ossigeno (ROS). 2 2 O + e- O Superossidodismutasi.