REGOLAZIONE DEL CICLO TCA

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1 REGOLAZIONE DEL CICLO TCA

2 Respirazione cellulare Fase 1 1) Catabolismo di acidi grassi 2) Glucosio 3) Amminoacidi Acetil-CoA Fase2 Ciclo dell acido citrico: ossidazione dell acetil CoA con produzione di NADH,FADH 2, GTP Fase 3 Trasferimento di elettroni dal NADH efadh2 ai trasportatori di elettroni con riduzione dell O 2 Fosforilazione ossidativa che consente di produrre ATP

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4 -terza fase : FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA -i cofattori ridotti (NADH e FADH2) sono ossidati e gli elettroni vengono trasferiti attraverso trasportatori che compongono la catena respiratoria, sino all ossigeno che si riduce formando acqua. -L energia libera derivante dal flusso esoergonico di elettroni viene accoppiata al trasferimento endoergonico dei protoni attraverso la membrana mitocondriale generando potenziale elettrochimico o forza motrice protonica (FMP) - La FMP permette il flusso di protoni trasmembrana in senso inverso attraverso l ATPsintasi che genera ATP mediante catalisi rotazionale

5 Struttura di un mitocondrio e localizzazione di enzimi e complessi coinvolti nella respirazione cellulare La produzione dell ATP non è la sola funzione dei mitocondri. Questi organelli partecipano alla termogenesi, alla sintesi degli steroidi, all apoptosi

6 Catena di trasporto degli elettroni Spazio intermembrana Spazio intermembrana Il cit c è una proteina solubile: FADH 2 O H e- 2 H 2 O matrice I trasportatori di elettroni funzionano in complessi multiproteici transmembrana

7 Gli elettroni possono essere trasferiti: - Riduzione da Fe 3+ a Fe +2 - Trasferimento di un atomo di idrogeno (H + + e - ) - Trasferimento di ione idruro (:H - ) IL TERMINE EQUIVALENTE RIDUCENTE INDICA CHE UN SINGOLO ELETTRONE È TRASFERITO IN UNA REAZIONE DI OSSIDORIDUZIONE

8 Il Potenziale di riduzione (E) è una misura quantitativa della tendenza relativa di una data specie chimica ad accettare elettroni in una reazione di ossidoriduzione. Quindi E è una misura dell affinità degli elettroni di una specie chimica Il potenziale di riduzione standard E, è una misura relativa del trasferimento di elettroni in base all affinità di un donatore verso un accettore di elettroni della coppia redox riferita alla semireazione H + + e - ½ H 2 E Perde elettroni più facilmente Guadagna elettroni più facilmente

9 Gli elettroni si muovono spontaneamente da una specie con un valore di potenziale redox standard (E ) più basso ad una specie con valore di E più alto. E è positivo per una reazione spontanea. I potenziali di riduzione standard E consentono di calcolare la variazione di energia libera DG di una reazione DG = - nfde DG = energia libera standard n = numero di elettroni trasferiti F = costante di Faraday DE = differenza tra E dell accettore di elettroni e l E del donatore di elettroni

10 Il flusso di elettroni avviene nella direzione del potenziale di riduzione crescente

11 Catena di trasporto degli elettroni Spazio intermembrana Spazio intermembrana Il cit c è una proteina solubile: FADH 2 O H e- 2 H 2 O matrice I trasportatori di elettroni funzionano in complessi multiproteici transmembrana

12 L ossidazione del glucosio ad anidride carbonica nelle cellule richiede trasportatori di elettroni specializzati Trasportatori di elettroni nella catena respiratoria: NAD: trasportatori sia di protoni che di elettroni FLAVOPROTEINE: trasportatori sia di protoni che di elettroni CHINONI: trasportatori di natura lipidica sia di elettroni che di protoni PROTEINE FERRO-ZOLFO: trasportatori di elettroni CITOCROMI: trasportatori di elettroni

13 NAD Le deidrogenasi NAD dipendente rimuovono due atomi di idrogeno dal substrato: uno viene trasferito sotto forma di ione idruro (:H - ), l altro atomo di idrogeno viene rilasciato come H +

14 SPETTRO D'ASSORBIMENTO UNO SPETTRO D'SSORBIMENTO RAPPRESENTA L' ASSORBIMENTO DI UNA SOSTANZA IN FUNZIONE DELLA LUNGHEZZA D'ONDA Spettro di assorbimento della forma ossidata e ridotta del NAD

15 FMN e FAD FMN e FAD possono accettare uno o due elettroni. Le flavoproteine possono servire da intermedi tra le reazioni in cui sono donati due elettroni e quelle in cui viene accettato un elettrone per volta. Il potenziale di riduzione standard di un coenzima flavinico dipende dalle proteine con cui è associato, a differenza di quello di NAD o NADP.

16 Le flavoproteine ridotte hanno un massimo di assorbimento della luce intorno a 360nm Le flavoproteine parzialmente ridotte hanno il massimo di assorbimento intorno a 450nm Le flavoproteine ossidate hanno il massimo di assorbimento a 370nm e 440nm FMN e FAD hanno potenziali di riduzione variabili che dipendono dalle flavoproteine a cui sono legati

17 UBICHINONE (COENZIMA Q) (Unico L Ubiquinone componente o della coenzima catena Q di è un trasporto altro trasportatore degli elettroni di non elettroni proteico) L ubichinone può accettare un solo elettrone o due elettroni Grazie alla catena idrofobica isoprenoide può muoversi all interno della membrana e agire da ponte tra diversi trasportatori meno mobili nella membrana. Catena isoprenoide Come le flavoproteine può mettere in relazione processi a due elettroni con altri ad un solo elettrone

18 CITOCROMI Trasportatori di elettroni, che contengono un gruppo ferro-porfirinico gruppo ferro-protoporfirinico (eme) simile a quello dell emoglobina e mioglobina Legame saldo ma non covalente: cit a e cit b Legame covalente: cit c A differenza degli altri citocromi, cit c è solubile

19 I citocromi nello stato ridotto ( Fe 2+ ) hanno tre picchi di assorbimento nel visibile I Citocromi, tranne il Citocromo c che è solubile, sono proteine integrali della membrana interna mitocondriale

20 PROTEINE FERRO-ZOLFO Trasportatori di elettroni: proteine ferro-zolfo Il Ferro è associato ad atomi di zolfo inorganico e/o ad atomi di zolfo dei residui di cisteina della proteina. Le proteine ferro zolfo partecipano alle reazioni redox trasferendo un elettrone alla volta mediante modificazioni dello stato di ossidazione del ferro (Fe +2 - Fe +3 )

21 Metodi per la determinazione della sequenza dei trasportatori di elettroni agenti in grado di inibire il trasporto di elettroni X in blu specie ridotte prima dell inibitore del flusso di elettroni In rosa specie ossidate dopo l inibitore In presenza di un donatore di elettroni e di O 2 ogni inibitore modifica in modo caratteristico lo stato di ossidoriduzione dei trasportatori di elettroni

22 I trasportatori di elettroni funzionano in complessi multiproteici transmembrana Spazio intermembrana Spazio intermembrana Il cit c è una proteina solubile: FADH 2 O H e- 2 H 2 O matrice

23 Purificazione dei complessi della catena respiratoria Trattamento con digitonina per eliminare membrana esterna Rottura osmotica del mitocondrio Trattamento dei frammenti di membrana interna con secondo detergente Cromatografia a scambio ionico

24 Il trasferimento di elettroni, mediato da trasportatori proteici legati alla membrana, è un processo esoergonico FADH 2

25 Complesso I 1) Trasferimento esoergonico di uno ione Idruro dal NADH e di un protone all FMN, ai centri Fe-S alla proteina Fe-S N2, all Ubichinone NADH + H + +Q NAD + + QH 2 2) Trasferimento endoergonico di 4 H + dalla matrice allo spazio intermembrana guidato dall energia derivante dal trasferimento di elettroni NADH + 5H + +Q NAD + + QH 2 + 4H +

26 Struttura del Complesso II ( Succinato deidrogenasi) Trasferimento di elettroni dal complesso II all ubichinone Succinato deidrogenasi: 4 subunità (A-D) e 5 gruppi prostetici:

27 Trasporto degli elettroni attraverso NADHdeidrogenasi Succinato deidrogenasi Diidrossiacetone fosfato b-ossidazione degli acidi grassi

28 Gli elettroni sono trasfertiti dall Ubichinolo al Citocromo c mediante il Complesso III (citocromo bc 1 ) COMPLESSO III: omodimero, ogni monomero formato da 11 subunità. Il centro funzionale è formato dal citocromo b,la proteina Fe-S di Rieskie e dal citocromo c1

29 Ciclo Q dell ubichinone trasferimento degli elettroni e protoni dall Ubichinolo (trasportatore a 2 elettroni) al citocromo c (trasportatore ad 1 elettrone) attraverso il complesso III

30 Durante il trasferimento degli equivalenti riducenti dall Ubichinone Citocromo c mediante il Complesso III vengono traslocati 4 protoni COMPLESSSO III (Ubichinone:citocromo c ossidoreduttasi) al Il Citocromo c, proteina solubile dello spazio intermembrana, accettato un elettrone, si sposta verso il complesso IV

31 Complesso IV: dal Citocromo c all O 2 Centro binucleare Cu A II Cu B III I IV 4 subunità fondamentali per l attività enzimatica Citocromo c Cu A eme a eme a 3 Cu B O 2 Complesso mitocondriale dimerico ogni monomero composto13 subunità (Mr ).Complesso batterico 2/3 subunità

32 Percorso degli elettroni attraverso il Complesso IV Subunità II: Centro Cu A due ioni Cu formano complessi con gruppi SH di due residui di Cys Subunità I: Centro eme a emea 3 Cu B (centro binucleare Fe-Cu) Subunità III: permette il rapido trasferimento dei protoni attraverso le subunità Subunità IV:ruolo non noto 4 Cit c (ridotto) + 8H + N+ O 2 4 Cit (Ox) + 4H + P + 2H 2 O

33 IL TRASPORTO DEGLI ELETTRONI ATTRAVERSO LA CATENA RESPIRATORIA GENERA UN GRADIENTE ELETTROCHIMICO

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35 Il trasporto degli elettroni può essere pericoloso per la cellula si possono formare ROS

36 COME SI FORMANO I ROS NEI MITOCONDRI? Dall ossidazione delle Flavoproteine Reazione di Haber -Weiss O 2 ˉ + H 2 O 2 OH ˉ + OH +O 2

37 .dal ciclo Q dell ubichinolo Lato N Lato P

38 DANNI CAUSATI DA O 2. INATTIVAZIONE OSSIDATIVA DA PARTE DELL O 2. DEI CLUSTER FERRO-ZOLFO DELLE PROTEINE (Aconitasi) L atomo di Fe catalitico presenta una carica positiva che attrae elettrostaticamente il radicale Tale interazione determina l ossidazione del cluster e il rilascio di Fe 2+ Reazione di FENTON 4) Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH + OH ˉ

39 CHEMICAL MODIFICATION TO CYSTEINE RESIDUES

40 DANNI CAUSATI DA O 2.,H 2 O 2 e da OH. La guanina è un bersaglio del radicale ossidrilico. Il suo basso potenziale redox facilita il movimento dell elettrone dal radicale convertendo la guanina in 8-idrossiguanina che determina una transversione G-T con conseguente mutagenesi.

41 Formazione di ROS nei mitocondri e difese mitocondriali SOD superossido dismutasi GPX glutatione perossidasi + GSH glutatione ridotto

42 TRASPORTO DEGLI ELETTRONI ATTRAVERSO LA CATENA RESPIRATORIA NADH + H + +1/2 O 2 NAD + + H 2 O NAD + /NADH E = -0,320 O 2 /H 2 O E = 0,816 DE =1,14V DG = -nf DE = -2(96,5kJ/V. mole) (1,14V) = -220kJ/mole di NADH

43 NADH + H + +1/2 O 2 NAD + + H 2 O NAD + /NADH E = -0,320 O 2 /H 2 O E = 0,816 DE =1,14V DG = -nf DE = -2(96,5kJ/V. mole) (1,14V) = -220kJ/mole di NADH Gran parte di questa energia viene usata per pompare protoni fuori la matrice mitocondriale e generare un gradiente elettrochimico o forza motrice protonica Pe rogni coppia di elettroni vengono pompati fuori la matrice 4 H+ dal complesso I 4H+ dal complesso 3 2H+ dal complesso IV L equazione vettoriale del processo è: NADH+ 11H N + +O 2 NAD+ + 10H p + +H 2 O

44 L energia elettrochimica derivante dal trasporto degli elettroni viene utilizzata per pompare all esterno protoni e dare origine ad un gradiente elettrochimico DG (Forza motrice protonica), in cui viene conservata l energia Durante la respirazione mitocondriale il D = 0,15-0,2 V DpH = 0.75 Sostituendo in DG= 2,3RT DpH + F D sono prodotti circa 19kJ/mole di protoni DG= 2,3RT DpH + FD Forza motrice protonica: -Differenza di concentrazione H+ (energia potenziale chimica DpH ) -Differenza di carica (energia del potenziale elettrico D ) Poiché il trasferimento di due elettroni dal NADH all O 2 comporta il pompaggio di 10 protoni. Circa 200 KJ dei 220 prodotti dall ossidazione di una mole di NADH sono conservati nel gradiente elettrochimico di protoni

45 Ipotesi chemiosmotica di Mitchell l ATP sintasi (complesso V), un motore cellulare, che trasporta protoni all interno della matrice e trasforma l energia contenuta nel gradiente elettrochimico nell energia chimica di legame dell ATP

46 Accoppiamento del trasporto di elettroni alla sintesi di ATP P N ADP + P i + nh + P ATP + H 2 O+ nh + N

47 Accoppiamento del trasferimento elettronico con la sintesi di ATP Mix di mitocondri in mezzo tamponato e aggiunta diadp +Pi + succinato Inibizione del flusso di elettroni dal complesso della citocromo ossidasi all ossigeno Si legano all ATPsintasi e ininbiscono anche trasferimento degli elettroni Dinitrofenolo (DNP)

48 La dissipazione del gradiente protonico può essere causato o dalla rottura dei mitocondri o da agenti disaccoppianti della fosforilazione ossidativa. Il DNP o l FCCP attraversano la membrana mitocondriale, grazie alla loro idrofobicità, rilasciano un protone, dissipando il gradiente protonico

49 Un gradiente elettrochimico artificiale che induce la sintesi di ATP in assenza di un donatore di elettroni....è la dimostrazione del ruolo del gradiente protonico nella sintesi di ATP

50 L ATP SINTASI COMPLESSO DELL ATP SINTASI DEI MITOCONDRI F 1 F O F 1 -Unità F1 = ATPasi attiva*, sporge verso la matrice mitocondriale 5 diverse subunità (a-e) nel rapporto a 3 :b 3 :g:d:e *L unità F1 isolata catalizza l idrolisi dell ATP piuttosto che la sintesi Unità F O = 3 tipi di subunità (a,b,c) nel rapporto: a:b 2 :c 12 E un canale transmembrana per i protoni

51 Complesso F1 di lato dall alto

52 Come funziona l ATP-sintasi? ATPsintasi = motore cellulare Il complesso ge-anello c 12 è la parte rotante Il complesso ab 2 -a 3 b 3 d è la parte statica - Il passaggio di protoni causa una rotazione del complesso ge-anello c10 -cambiamento conformazionale di F1 (trasmesso attraverso la subunità g) -Formazione di ATP da ADP + Pi e Rilascio di ATP nella matrice mitocondriale (catalisi rotazionale)

53 Struttura F 1 F o vista di lato e dal lato P lato N Il flusso protonico attraverso Fo fa ruotare il cilindro e lo stelo g inducendo un cambiamento conformazionale delle singole subunità b ogni volta che g entra in contatto con ognuna di esse

54 Un meccanismo di catalisi rotazionale è alla base della sintesi di ATP dal complesso dell ATP sintasi Le tre subunità a b hanno tre siti non equivalenti per il legame ai nucleotidi adenilici. In ogni momento un sito si trova nella conformazione batp, un altro badp, il terzo è bvuota. Il flusso protonico determina la rotazione di g che viene a contatto con ciascuna subunità determinando un cambiamento conformazionale per cui il sito b- ATP assume la conformazione bvuota, il sito badp-pi promuove la condensazione dell ATP e il sito vuoto assume la conformazione che lega ADP-Pi bassa affinità per ATP alta affinità per ATP Bassissima affinità per ATP

55 2,5 molecole di ATP si formano per ogni molecola di NADH ossidata e 1,5 molecole di ATP si formano per ogni molecola di FADH 2 ossidata 10H + fuoriescono per coppia di elettroni trasportati dal NADH mentre 6H + fuoriescono se il donatore di elettroni è il succinato Per la sintesi di una molecola ATP sono richiesti 4 protoni di cui un H + è richiesto per trasportare Pi, ADP, ATP attraverso la membrana Quindi

56 = 976 kj/mole il valore 3 o 5 dipende dal meccanismo usato per trasportare gli elettroni del NADH dal citosol alla matrice mitocondriale Energia contenuta nel glucosio = 2840 kj/mole Recupero = 32 x 30,5 kj/mole = 976 kj/mole (34% in condizioni standard) All interno della cellula l efficienza del processo è di circa 65%

57 La forza motrice protonica fornisce l energia non solo per la sintesi di ATP da parte della ATPsintasi ma anche per il trasporto attivo Trasporto di ADP e Pi nella matrice mitocondriale trasporto dell ATP nel citosol

58 Come arrivano gli equivalenti riducenti dal NADH generato nella glicolisi alla membrana interna mitocondriale e alla catena respiratoria? Sistema shuttle malato-aspartato (fegato rene cuore) Spazio intermembrana Malato Deidrogenasi citosolica Trasportatore malato- a chetoglutarato MATRICE Malato deidrogenasi aspartato amminotransferasi aspartato Ammino transferasi Trasportatore glutammato-aspartato

59 Nel muscolo e nel cervello opera un altro sistema shuttle NADH alla catena respiratoria SHUTTLE DEL GLICEROLO 3-FOSFATO

60 REGOLAZIONE DELLA FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA Disponibilià di ADP Dall ossigeno Cosa accade in mancanza di O 2? -una proteina inibitrice, inibisce l idrolisi dell ATP.

61 IF1 è attiva solo in forma dimerica che si determina solo a ph inferiori a 6.5. Tale ph si raggiunge solo in condizioni del metabolismo anaerobico (fermentazione lattica). Il ripristino del metabolismo aerobio fa rilalire il ph che destabilizza il dimero rimuovendo l inibizione della attività della ATPsintasi. L ATPsintasi in condizioni di ipossia è inibita dalla proteina IF1 In condizioni di ipossia la catena respiratoria è bloccata e l ATPsintasi, che ha anche attività ATPasica potrebbe idrolizzare l ATP. Ciò viene impedito da una piccola proteina IF1 che lega due molecole di ATPsintasi inibendo la sua attività.

62 L IPOSSIA tende a far aumentare le ROS perché si genera uno squilibrio tra flusso di elettroni provenienti da molecole di combustibile ossidate nella matrice mitocondriale e trasferimento di elettroni all ossigeno Sistema di difesa contro le ROS in condizioni di ipossia: - glutatione perossidasi - Regolazione negativa della PDH (fosforilata) - Sostituzione di una delle subunità del Complesso IV, COX4-1, con Cox4-2 che funziona meglio in condizioni di ipossia

63 pdh e cox4-2 ed il gene codificante la proteasi che degrada COX4-1 sono sotto il controllo trascrizionale del fattore inducibile dell ipossia (HIF-1) I l fattore inducibile dell ipossia (HIF-1 induce la sintesi di Cox4-2 che sostituisce una delle subunità del complesso IV per farlo funzionare meglio in condizioni ipossiche. HIF-1 induce la sintesi di una proteasi che degrada COX4-1 HIF-1induce la sintesi degli enzimi glicolitici e dei trasportatori del glucosio HIF-1 induce la sintesi dellla PDH chinasi che inibisce la PDH deidrogenasi

64 Regolazione delle vie che producono ATP L ATP e ADP non regolano solo la velocità di trasferimento di elettroni nella catena respiratoria ma anche il ciclo di Krebs, l ossidazione del piruvato e la glicolisi La velocità del consumo di ossigeno è limitata dalla disponibilità di ADP quale substrato per la fosforilazione (controllo da accettore della respirazione). La concentrazione intracellulare di ADP è una misura dello stato energetico della cellula.

65 ALTRE FUNZIONI DEI MITOCONDRI 1) I MITOCONDRI NEL TESSUTO ADIPOSO BRUNO PRODUCONO CALORE PER PROTEGGERE GLI ORGANI VITALI DALLE BASSE TEMPERATURE 2) i MITOCONDRI NELLE GHIANDOLE SURRENALI E NELLE GONADI SONO IL SITO DELLA PRODUZIONE DEGLI STEROIDI 3) I MITOCONDRI NELLA MAGGIOR PARTE DEI TESSUTI SONO COIVOLTI NEL PROCESSO DI APOPTOSI (MORTE CELLULARE PROGRAMMATA)

66 1) I MITOCONDRI NEL TESSUTO ADIPOSO BRUNO PRODUCONO CALORE PER PROTEGGERE GLI ORGANI VITALI DALLE BASSE TEMPERATURE Nel grasso bruno (alta concentrazione di mitocondri) l ossidazione delle sostanze nutrienti non viene utilizzata per produrre ATP ma calore che serve a mantenere la temperatura del corpo costante La termogenina, o proteina disaccoppiante 1 (UCP1) fornisce una via alternativa per il rientro dei protoni nella matrice mitocondriale. Per effetto di questo by pass l energia motrice protonica viene utilizzata per produrre calore contribuendo ad esempio al mantenimento costante della temperatura nel corpo dei neonati Il disaccoppiamento del trasporto degli elettroni e sintesi di ATP permette la produzione di calore

67 I MITOCONDRI NELLE GHIANDOLE SURRENALI E NELLE GONADI SONO IL SITO DELLA PRODUZIONE DEGLI STEROIDI P450 CATALIZZA L OSSIDRILAZIONE DEGLI STEROIDI

68 I MITOCONDRI HANNO UN RUOLO PRIMARIO NELL APOPTOSI Nel citosol il citocromo c interagisce con Apaf1(fattore di attivazione della proteasi dell apoptosi) formando l apoptosoma sul quale la proteasi procaspasi 9 viene attivata a caspasi 9 dando il via ad ad una cascata di attivazione proteolitica Le caspasi sono una famiglia di proteasi coinvolte nell apoptosi e sono caratterizzate da un residuo Cys nel sito attivo. Esse idrolizzano il legame peptidico dal lato carbossilico del residuo Asp dellle proteine L apoptosi è la morte programmata nel quale le singole cellule muoiono per il bene dell organismo L apoptosi può avere inizio in seguito ad un segnale esterno o da un evento intracellulare La condizione di stress che innesca il processo apoptotico determina un aumento della permeabilità della membrana mitocondriale, dovuto all apertura del complesso del poro di transizione della permeabilità (PTPC), localizzato nella membrana mitocondriale esterna, che determina la fuoriscita del citocromo c nel citosol