Colletotrichum coccodes: un parassita potenzialmente dannoso su pomodoro innestato. Andrea Minuto, Giovanna Gilardi, Angelo Garibaldi

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1 Colletotrichum coccodes: un parassita potenzialmente dannoso su pomodoro innestato. Andrea Minuto, Giovanna Gilardi, Angelo Garibaldi Centro di competenza per l innovazione in campo agroalimentare (AGROINNOVA) Università degli Studi di Torino - Via Leonardo da Vinci 44, Grugliasco (TO). andrea.minuto@unito.it Riassunto Sulla base di un esteso programma di monitoraggio effettuato a partire dal 2002 all interno di coltivazioni intensive di pomodoro effettuate in ambiente protetto nell Italia settentrionale e meridionale, sono stati rinvenuti, anche su apparato radicale di piante innestate su portainnesti resistenti, attacchi talora anche gravi di Colletotrichum coccodes (C. atramentariaum). Vengono fornite indicazioni circa la biologia, l epidemiologia e la sensibilità di portainnesti diversi di pomodoro. Il rischio legato alla presenza di tale parassita, anche alla luce dei significativi cambiamenti nel settore della disinfezione del terreno, viene discusso. Parole chiave: pomodoro, alterazione radicale, innesto, resistenza Abstract Colletotrichum coccodes: a soilborne pathogen potentially dangerous on grafted tomatoes. Since 2002, an extensive monitoring has been carried out in order to identify the emerging soilborne diseases affecting tomato in commercial fields where methyl bromide was progressively replaced by other measures as requested by national and international regulations. Particularly in 2003, in Piedmont, Campania and Sicily, root rots were observed on grafted tomatoes. The symptoms were sometime very similar to the root rots caused by corky root (Pyrenochaeta lycopersici) On not grafted tomato plants the root systems appeared extremely damaged, with large necrosis completely deteriorating old and young roots; the root tissues became blackish, showing generally cracks as in the case of corky root infections. Moreover, the necrotic roots appeared with a cortex easy to be removed and the remaining internal root tissues assumed a blackish colour. On the root system of rootstocks the symptoms were particularly evident on older roots where tissues were grey to blackish. On the basis of several isolations a fungus producing blackish round sclerotia of a diameter less than 1 mm was constantly observed. Tests carried out to confirm Koch s postulates confirmed the pathogenicity of the isolated fungus recognized as Colletotrichum coccodes (C. atramentarium), the causal agent of the brown root rot of tomato. Tests carried out in pot with artificial soil infestation demonstrated the susceptibility to this pathogens of standard tomato plants and interspecific and intraspecific tomato rootstocks. These observations show that grafting tomato on resistant rootstocks cannot be considered the only strategy to control soilborne pathogens in C. coccodes infested soil. At our knowledge this is the first report of C. coccodes on Lycopersicon lycopersicum x L. hirsutum hybrids employed as resistant rootstocks for tomato and eggplant. Key words : tomato, root rot, grafting, disease resistance

2 Introduzione L eliminazione del bromuro di metile come mezzo di disinfestazione del terreno ha stimolato la messa in atto di ricerche volte alla individuazione di strategie tecniche alternative altrettanto efficaci nella lotta ai parassiti del terreno. Tra queste la pratica dell innesto è senza dubbio la strategia che più di altre ha attirato l attenzione sia per la sua adattabilità a condizioni di basso o medio ricorso alla disinfezione del terreno sia per le potenzialità di tipo agronomico legate ai numerosi effetti positivi capaci di incrementare la durata del ciclo colturale, la resistenza al freddo e di modificare anche le caratteristiche del prodotto finale ottenuto. Nel caso del pomodoro i portainnesti fino ad oggi disponibili sono stati proposti e diffusi sul mercato grazie alla possibilità di limitare le infezioni di Pyrenochaeta lycopersici, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici Verticillium dahliae e di nematodi galligeni (Morra e Bilotto, 2005). In questa nota si riassumono alcune osservazioni effettuate a partire dal 2002 su pomodoro innestato su portainnesti diversi ed allevato in aziende del nord (Piemonte, Liguria), del sud (Campania) e delle isole (Sicilia) ove a carico del portainnesto sono state rinvenute alterazioni a livello dell apparato radicale. Descrizione dei sintomi Nel 2002, a partire da aree del nord e del sud Italia, su piante di pomodoro allevate in serra con copertura in vetro o plastica si notava la presenza di aree per lo più di limitata estensione ove i tessuti radicali apparivano alterati nel colore e molto raramente presentavano fessurazioni sulla corteccia (Tabella 1). Nel 2003 ulteriori osservazioni condotte su campioni vegetali provenienti da appezzamenti ove l anno precedente erano state osservate piante sintomatiche, permettevano di rinvenire i sintomi già descritti e, in particolare su piante da aree già monitorate nel 2002, venivano osservati sintomi più evidenti ed estesi. In particolare in questo secondo caso le alterazioni si dimostravano sempre prevalentemente a carico dell apparato radicale più vecchio, ma spesso estendentesi alle radici secondarie. Nel corso del 2003 osservazioni in tal senso sono state fatte su materiale proveniente dalla Liguria, dal Piemonte, dalla Campania e dalla Sicilia (Tabella 1). Nel 2004 in un azienda commerciale ligure localizzata nel comune di Toirano (SV), gli attacchi sono stati così evidenti da causare alterazioni di non meno del 70% dell apparato radicale di piante di pomodoro innestato. Si trattava, in questo caso, di una azienda (Azienda Agricola Leone Toirano - SV) che a partire dal 1999 aveva cessato l impiego del bromuro di metile a causa della impossibilità di limitare efficacemente le epidemie di F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici. A partire dal 2000, pertanto, detta azienda aveva adottato strategie alternative per contenere tale alterazione, cessando definitivamente nel 2001 l uso di mezzi chimici, iniziando ad impiegare solo piante innestate su piede resistente. Anche sulla base di tali osservazioni nel 2004 è stata intensificata l attività di indagine che ha portato ad individuare l alterazione non solo in Liguria, ma anche in Piemonte, nel Lazio e in Sicilia (Tabella 1). I sintomi osservati consistevano in alterazioni dei tessuti radicali talora così gravi da generare la decomposizione degli stessi (Figura 1). Le porzioni corticali dei tessuti radicali diventavano molli, presentando la presenza di abbondanti piccole aree di colore nero con un diametro inferiore al millimetro e talora tra loro coalescenti in aree brune di maggiore dimensione. Su piante non innestate il sistema radicale appariva estremamente danneggiato con estese aree necrotiche talora in grado di deteriorare completamente le porzioni di apparato radicale vecchio e giovane. In particolare su piante non innestate i sintomi potevano talora apparire simili a quelli causati da infezioni di Pyrenochaeta lycopersici, mentre su piante innestate, allevate nelle stesse condizioni, i sintomi apparivano del tutto differenti. In questo ultimo caso, infatti, su radici di alcuni millimetri di diametro le porzioni corticali potevano essere facilmente rimosse e, su radici più vecchie di oltre 5 mm di diametro, i tessuti diventavano grigi e talora nerastri (Figura 2). Su questi tessuti, con una osservazione microscopica (ingrandimento 200 x) era molto semplice osservare la presenza di aree rotondeggianti di dimensione inferiore al millimetro di diametro (Figura 3), potendo facilmente

3 distinguere il sintomo da quello causato da Pyrenochaeta lycopersici che, generalmente, causa estese fessurazioni della corteccia radicale. Materiali e metodi Piante di pomodoro che presentavano la descritta alterazione radicale sono state campionate in nord (Piemonte, Liguria) e sud (Lazio, Campania, Sicilia) Italia e quindi portate in laboratorio (Tabella 1). Qui sono state accuratamente e delicatamente lavate al fine di eliminare residui di terreno. Frammenti radicali sintomatici di dimensione di 1-2 cm sono stati quindi attentamente staccati e alternativamente lavati con una soluzione di alcool etilico (70%) e con acqua sterile. Il lavaggio è stato sempre ripetuto 5 volte. Infine i frammenti asciugati con carta sterile sono stati ulteriormente ridotti di dimensione a frammenti di 1-2 mm e posizionati in capsule Petri su substrato a base di PDA (potato dextrose agar) aggiunto di streptomicina solfato (100 ppm) e incubato a 22 C per 5-7 giorni. Prove preliminari per il saggio della patogenicità degli isolati fungini ottenuti e della suscettibilità di alcuni portainnesti di pomodoro sono stati effettuati in camera climatica. Piante di pomodoro di 40, 60 e 75 giorni di età sono state inoculate mediante immersione radicale in una sospensione conidica (10 6 conidi/ml) preparata a partire da isolati ottenuti da pomodoro cv Cuore di Bue innestato su Beaufort F 1 e He Man F 1. Quindici piante per ogni cv e età sono state quindi inoculate e trapiantate in vasi di plastica di 18 cm di diametro. Le piante così inoculate sono state suddivise in tre blocchi, quindi completamente randomizzate e disposte su bancali sopraelevati ad una temperatura media di 28 C di giorno e 18 C di notte (valori estremi 15 C - 32 C). Le piante sono state periodicamente sottoposte a verifica visiva valutando la presenza di appassimenti e giallumi ed infine, dopo 75 giorni dal trapianto, sono state sradicate ed è stata determinata la presenza di aree alterate nerastre. I dati sono stati statisticamente analizzati e sottoposti ad analisti statistica della varianza secondo il test di Tukey (P= 0,05). Risultati A seguito delle analisi di laboratorio è stato costantemente osservata la presenza di un fungo in grado di produrre sclerozi rotondeggianti di colore nerastro di diametro inferiore a 1 mm. La presenza di conidi unicellulari aventi forma allungata elissoidale e dimensioni medie variabili tra x 3-4 µm ha permesso di identificare il fungo come appartenente al genere Colletotrichum (Bailey e Jeger, 1992) [C. atramentarium (Berk. e Broome) Taubenh]. In seguito gli isolati sono stati definitivamente identificati come C. coccodes (Wallr.) Hughes (Magnano di San Lio, comunicazione personale). In tabella 2 si riportano i dati rilevati valutando la gravità delle infezioni di C. coccodes su piante artificialmente inoculate. I risultati hanno confermato la patogenicità degli isolati ottenuti e, soprattutto, hanno fornito la possibilità di verificare la sensibilità di diversi portainnesti resistenti confrontata con quella di una selezione di pomodoro non innestata (cv Cuore di Bue). Tutte le selezioni sottoposte a saggio hanno dimostrato una significativa sensibilità alle infezioni del patogeno artificialmente inoculato. In particolare le cv Cuore di Bue, Marmande Raf e Beaufort sono apparse maggiormente sensibili quando infettate allo stadio giovanile (Tabella 3), confermando un effetto significativo dell età della piante sulla sensibilità all alterazione radicale. Tra tutti i portainnesti saggiati la cv Beaufort è apparsa maggiormente sensibile a C. coccodes rispetto alla cv Energy e He Man (Tabella 2).

4 Tabella 1 Campioni di pomodoro risultati infetti da Colletotrichum coccodes. Table 1 Samples of tomato infected by Colletotrichum coccodes. Cultivar Portainnesto Località Anno della prima osservazione Cuore Di Bue - Boves - CN 2002 Cuore Di Bue Beaufort Albenga - SV 2002 Oscar - Villafalletto - CN 2003 Cuore Di Bue Beaufort Sanremo - IM 2003 Cuore Di Bue Beaufort Boves - CN 2003 Faino - Caserta 2003 Faino Beaufort Caserta 2003 Rogo - Albenga - SV 2004 Oscar Beaufort Villafalletto - CN 2004 Cuore di Bue Beaufort Villafalletto - CN 2004 Cuore di Bue He Man Vittoria - RG 2004 Rita He Man Fondi - LT 2004 Jama - Fondi - LT 2004 Jama Beaufort Fondi - LT 2004 Jama He Man Vittoria - RG 2004 Tabella 2 Effetto della inoculazione artificiale sulla percentuale di apparato radicale infetto di piante di pomodoro di 40 giorni di età (Grugliasco, 2004) Table 2 Effect of artificial inoculation on the percentage of infected root systems on tomato plants 40 days old (Grugliasco, 2004) Cultivar Inoculazione artificiale % apparato radicale infetto Cuore Di Bue* si 75,0 d^ Marmande Raf* si 77,3 d He Man si 26,2 b Beaufort si 52,4 c Energy si 22,7 b Cuore Di Bue* no 0,0 a Marmande Raf* no 0,0 a He Man no 0,0 a Beaufort no 0,0 a Energy no 0,0 a * cultivar di pomodoro Ibrido interspecifico KNVF (Lycopersicon lycopersicum x L. hirsutum). Ibrido intraspecifico of L. lycopersicum. ^ Le medie della stessa colonna seguite dalla medesima lettera non differiscono statisticamente tra loro secondo il test di Tukey HSD (P<0,05).

5 Tabella 3 Effetto dell età delle piante al momento dell inoculazione sulla percentuale di apparato radicale infetto (Grugliasco, 2004) Table 3 - Effect of plant age at the time of inoculation on the percentage of infected root systems (Grugliasco, 2004) Età delle piante al % apparato radicale infetto momento dell inoculazione Cuore di Bue * Marmande Raf * He Man Beaufort Energy 40 75,0 b^ 77,3 c 26,2 a 52,4 b 22,7 a 60 55,0 ab 58,7 b 50,0 a 43,5 b 48,0 b 75 40,0 a 20,8 a 20,0 a 12,9 a 19,5 a *,,, ^ vedi tabella 2 Conclusioni In Italia meridionale osservazioni condotte negli anni precedenti al 2002 avevano evidenziato che l uso della cv Energy come portainnesto potrebbe essere una adeguata soluzione per la coltivazione di piante di pomodoro in terreni sabbiosi pesantemente infestati da nematodi galligeni (Meloidogyne spp.) (Colombo et al., 2003). Al contrario, sempre in Sicilia le cv Beaufort e He Man sono state indicate più suscettibili alle infestazioni di nematodi della cv Energy, ma più tolleranti alle infezioni di Pyrenochaeta lycopersici (Colombo et al., 2003; Garibaldi e Minuto, 2003). Inoltre in Italia settentrionale l impiego della cv Beaufort e He-Man per contenere le infezioni di Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici ha permesso la coltivazione del pomodoro anche in terreni pesantemente infetti da tale patogeno (Garibaldi e Minuto, 2003). Occorre comunque rammentare che, contrariamente a quanto osservato impiegando la cv Energy e He man, la cv Beaufort sembra essere quella maggiormente tollerante i fenomeni di collasso repentino spesso osservati innestando marze delle cv Cuore di Bue, Marmande Raf, Iride e Naomi (Minuto e Garibaldi, 2001 e 2003). Sulla base delle informazioni riportate in questa nota la presenza di C. coccodes deve essere considerata e valutata similmente a quanto comunemente accade per la presenza di nematodi, di radice suberosa e di F. radicis lycopersici al fine di effettuare la migliore scelta possibile del portainnesto, considerando, inoltre, anche la compatibilità con la marza prescelta. Numerose sono, inoltre, le informazioni già disponibili relativamente alle caratteristiche biologiche ed ecologiche di C. coccodes. Quando il pomodoro è trapiantato in terreni infetti, il patogeno è in grado di generare lesioni radicali già una settimana dopo il trapianto (Ebben e Williams, 1956). Esso, inoltre si è dimostrato capace di infettare anche con esito letale semi in germinazione messi a dimora in terreni infetti (Dillard, 1992), anche se gravi sintomi possono essere osservati, in genere, su piante di pomodoro solo successivamente alla fioritura (Hornby, 1968). Nelle nostre osservazioni, non sono mai stati osservati particolari sintomi a livello della porzione epigea della coltura durante la fase colturale; la presenza delle alterazioni, infatti, è sempre stata osservata solo successivamente alla estirpazione della coltura. Nonostante ciò, sulla base di prime osservazioni sembra plausibile ritenere un effetto negativo sulla produzione a seguito della coltivazione ripetuta su terreni infetti dal parassita (Garibaldi et al., in preparazione). Infezioni di C. coccodes sono riportate praticamente in tutto il mondo (Dillard, 1992) ed in Europa la sua presenza è stata osservata su pomodoro, inizialmente in Olanda, almeno a partire dal 1931 (Van Poeteren, 1932). Le infezioni di C. coccodes sono inoltre state descritte non solo su pomodoro allevato in suolo, ma anche su pomodoro allevato fuori suolo (Dillard, 1992, Blancard, 1991, Schneider et al., 1978). Il patogeno è in grado di sopravvivere facilmente sui residui colturali di pomodoro e, in assenza di residui di colture ospiti, può sopravvivere nel terreno asciutto o umido. La principale forma con la quale si conserva l inoculo del patogeno è rappresentata da sclerozi che possono permanere nel terreno liberi o, ancora, sui residui della coltura precedente (Dillard, 1992). Sino alla prima metà degli anni novanta si riteneva che l inoculo di C. coccodes potesse mantenersi

6 vitale nel terreno per periodi variabili dagli 11 ai 24 mesi successivamente al termine della coltura ospite (Dillard, 1992). Più recentemente, però, è stato sperimentalmente dimostrata la capacità di tale fungo di resistere nel terreno per periodi non inferiori a 8 anni (Dillard e Cobb, 1998). Tali autori hanno dimostrato una maggiore sopravvivenza dell inoculo, sotto forma di sclerozi, quando questo è libero nel terreno e non associato a residui colturali e quando la profondità dello stesso nel terreno oscilla tra i 10 e 20 cm (Dillard e Cobb, 1998). La gamma di ospiti di C. coccodes include diverse specie tra cui il pomodoro, il peperone, la patata, la melanzana, la lattuga, il crisantemo ed alcune Cucurbitaceae e Brassicaceae, (Dillard, 1992). In Italia ci sono indicazioni assai lontane di attacchi di C. coccodes su patata (Gigante, 1955). In aggiunta lo stesso fungo è stato isolato dall apparato radicale di diverse piante infestanti appartenenti alla famiglia delle Amarantaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Convulvolaceae, Cruciferae, Graminaceae, Malvaceae, Oxalidaceae, Polygonaceae e Solanaceae su cui i sintomi delle infezioni sono spesso lievi potendo generare solo in alcuni casi fenomeni aspecifici di clorosi fogliare (Raid e Pennypacker, 1987). Tutte queste informazioni confermano il potenziale rischio legato alla presenza di C. coccodes su pomodoro allevato in serra e confermano pure le difficoltà pratiche di organizzare efficaci ed efficienti rotazioni colturali proprio in ambiente protetto. A tale riguardo l adozione di cultivar resistenti e, particolarmente per la coltivazione del pomodoro in serra, il ricorso alla disinfestazione con mezzi chimici e fisici sono stati in passato considerati quali strategie di lotta maggiormente efficaci (Dillard, 1992; Blancard, 1991; MacNeill, 1955). In Italia la produzione totale di piante innestate nel 2005 ha superato i 24,8 milioni di piante, quasi raddoppiata rispetto alle circa 14 milioni di unità prodotte nel 2000 (Morra e Bilotto, 2005). Per quanto concerne il pomodoro è stata rilevata una crescita della produzione di piante di circa l 80% rispetto al 2000 che ha portato alla commercializzazione di oltre 5,5 milioni di piante (Morra e Bilotto, 2005) e tale mercato è considerato ancora in fase di espansione. Il ricorso a portainnesti resistenti, però, non permette un sufficiente contenimento delle infezioni di C. coccodes. Ulteriori ricerche sono quindi necessarie, particolarmente in quelle aree ove l innesto su piede resistente è considerato una pratica efficace per ridurre il ricorso alla fumigazione del terreno resa talora necessaria per permettere la coltivazione di selezioni sprovviste di resistenze ai principali parassiti tellurici, ma comunque particolarmente apprezzate dal mercato per le loro caratteristiche organolettiche. In particolare, al momento attuale si deve sconsigliare l uso della sola pratica dell innesto su piede resistente nelle serre destinate a monocoltura di pomodoro o di solanacee ove sia presente il marciume radicale causato da C. coccodes. In conclusione, nonostante C. coccodes sia già stato indicato in grado di infettare Lycopersicon hirsutum (Last e Ebben, 1965) utilizzato sia come portainnesto, sia nei programmi di miglioramento genetico, questa sembra la prima segnalazione al mondo di infezioni di C. coccodes su ibridi di Lycopersicon lycopersicum x L. hirsutum utilizzati come portainnesti per pomodoro e melanzana.

7 Lavori citati Bailey J.A., Jeger M.J. (1992) - Colletotrichum. Biology, Pathology and control. CAB International, UK. 388 pages. Blancard D. (1991) - Maladies de la tomate. INRA Revue Horticole Cedex, 212 pages. Colombo A., Serges T., Assenza M., Donzella G., Minuto A., Garibaldi A. (2003) - Uso dell innesto erbaceo per ridurre gli attacchi di patogeni e parassiti terricoli di pomodoro e melanzana: situazione attuale e prospettive. Informatore Fitopatologico - La Difesa delle Piante, 53 (2), Dillard H.R. (1992) - Colletotrichum coccodes: the pathogen and its hosts. In: Bailey J.A., Jeger M.J. (1992) Colletotrichum. Biology, Pathology and control. CAB International, UK pages. Dillard H. R., Cobb A. C. (1998) - Survival of Colletotrichum coccodes in infected tomato tissue and in soil. Plant Disease, 82, Ebben M.H., Williams P.H. (1956) - Brown root rot of tomatoes. I. The associated fungal flora. Annals of Applied Biology, 44, Garibaldi A., Minuto A. (2003) - The application of grafting against soilborne pests and diseases of tomato in Italy: present situation and perspectives. Proceedings of International Congress Greenhouse tomato - Integrated crop production - Organic production, Avignone France Sept. 2003, Gigante R. (1955) Osservazioni sulla filosità dei tuberi di Patata. Bollettino Stazione Patologia Vegetale Roma, 3 (13), Hornby D. (1968). Studies on Colletotrichum coccodes. III Some properties of the fungus in soil and tomato roots. Transaction of the British Mycological Society 51, Last F.T., Ebben M.H. (1965) - The epidemiology of tomato brown root rot. Annual Applied Biology, 57, MacNeill B. (1955) - Colletotrichum root rot of greenhouse tomatoes. Plant Disease Reporter, 39, Minuto A., Garibaldi A. (2001) - Segnalazione di un avvizzimento non parassitario su colture di pomodoro cv Cuore di bue innestate su piede resistente. Informatore Fitopatologico La Difesa delle Piante, 51 (3), Morra L., Bilotto M. (2005) - Innesto erbaceo in orticoltura, espansione a due velocità. L Informatore Agrario 25 (45), Raid R.N., Pennypacker S.P. (1987) - Weeds as host for Colletrotrichum coccodes. Plant Disease, Schneider R.W., Grogan R.G., Kimble K.A. (1978) - Colletotrichum root rot of greenhouse tomatoes in California. Plant Disease Reporter, 62, Van Poeteren (1932) Report of the activities of the Phytopathological Service in the year Versl. en Meded. Plantenziektenkundingen Dienst te Wageningen, 66, 135 pag (R.A.M., XI, )

8 Ringraziamenti Lavoro svolto con un contributo della Regione Piemonte e nell ambito dell accordo quadro tra Ministero dell Ambiente e della Tutela del Territorio Direzione per la Protezione Internazionale dell Ambiente e il Centro di Competenza per l Innovazione in Campo Agroambientale su "Protezione delle piante nel rispetto dell ambiente". Gli Autori ringraziano il Prof. G. Magnano di San Lio per l identificazione degli isolati fungini rinvenuti durante le attività descritte.

9 Figura 1: Tessuti radicali di pomodoro cv Cuore di Bue infetti da C. coccodes. Figura 2: Effetto della presenza di infezioni di C. coccodes su tessuti radicali di ibridi di Lycopersicon lycopersicum x L. hirsutum. Figura 3: Microsclerozi (aree rotondeggianti nere) di C. coccodes prodotti su tessuti radicali di ibridi di Lycopersicon lycopersicum x L. hirsutum infetti.