4. cromosomi. Le dimensioni dell acido nucleico è molto maggiore delle dimensioni del compartimento in cui è contenuto

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1 4. cromosomi contiene materiale protetto da copyright, ad esclusivo uso personale; non è consentita diffusione ed utilizzo di tipo commerciale Le dimensioni dell acido nucleico è molto maggiore delle dimensioni del compartimento in cui è contenuto 1

2 Ogni cellula con,ene circa 2 metri di DNA Diametro nucleo = 5 8 μm Come organizzare il DNA? Il DNA nucleare si distribuisce nei CROMOSOMI 3,2 x 10 9 coppie di nucleo2di distribuite in 24 cromosomi Nell uomo 23 coppie di cromosomi = 22 coppie di cromosomi somatici non sessuali (autosomi) + 1 coppia di cromosomi diversi, i cromosomi sessuali (eterosomi) 2

3 quoziente di compa=amento (rapporto di impacche(amento) rapporto tra la lunghezza del DNA e la lunghezza dell unità che lo con,ene. per es. il più piccolo cromosoma umano: cromosoma mito,co = 2 µm DNA 4,6x 10 7 bp = 1,4 cm quoziente di compa=amento =

4 genoma cellulare compa3amento differenze tra genoma cellulare e virale ha dimensioni indefinite: numero sequenze varia a seconda della duplicazione, delezione o riarrangiamento Richiede metodo generalizzato per compattare il DNA che non contenuto totale genoma virale La quantità di ac nucleico da compattare è predeterminata Deve adattarsi all interno di un rivestimento assemblato Tabella 4.1 Cara3eris;che del materiale gene;co di diversi organismi. 4

5 Impacche3amento del genoma virale 5

6 CAPSIDE struttura chiusa composta da subunità identiche che interagiscono attraverso interazioni specifiche possono avere 3 tipi di simmetria: tetraedrica cubica icosaedrica 4 facce triangolari 6 facce quadrate 20 facce triangolari (12 subunità) (24 subunità) (60 subunità) Due possibilità: Il rivestimento proteico si assembla intorno all acido nucleico: VIRUS a RNA L acido nucleico viene inserito dopo che il capside si è formato: VIRUS a DNA 6

7 VIRUS a RNA Capside formato da un disco a + strati che forma un elica quando interagisce con l RNA Figura 4.2C Virus del mosaico del tabacco. VIRUS a DNA Figura 4.3A Stru3ura e assemblaggio del fago lambda. 7

8 VIRUS a DNA molti virus si replicano con un meccanismo a cerchio rotante che genera lunghe code NB cos perchè taglio genera estremità coesive 8

9 Impacche3amento del genoma ba3erico 9

10 Figura 4.4B Stru3ura del nucleoide di E. coli. 2 tipi di superavvolgimento: - PLECTONEMICO: DNA superavvolto libero: percorso NON RISTRETTO - TOROIDALE: DNA legato a proteine: percorso RISTRETTO 10

11 Struttura del cromosoma batterico Domini separati Superavvolgimenti diversi Le principali proteine istone-simili del nucleoide batterico Caratteristiche Struttura pm (kda) Geni Funzioni HU basica molto abbondante copie/cellula nessun consenso eterodimero HU α HU β hup A (90.4 min) hup B (9.9 min) compatta il DNA in strutture nucleosoma-simili induce curvatura nel DNA riconosce DNA curvo interviene nella ricombinazione generale H-NS histone-like nucleoid structuring protein neutra aumenta in fase stazionaria copie/cellula nesun consenso omodimero 2 x 15.5 hns (27.8 min) induce curvatura nel DNA riconosce DNA curvo è un repressore trascrizionale influenza la ricombinazione IHF integration Host Factor basica aumenta in funzione del ciclo cellulare 5-10 volte meno abbondante di HU debole specificità di sequenza (YA 2 N 4 T 2 GATW) eterodimero IHF α IHF β him A (38.6 min) him D (25 min) induce forte curvatura (fino a 140 ) nel DNA interviene nella ricombinazone sito-specifica e nella trasposizione FIS Factor for inversion stimulation basica abbondante in fase esponenziale copie/cellula scarsa specificità di sequenza (KN 2 YRN 2 WN 2 YRN 2 M) omodimero 2 x 11.5 fis (73.4 min) induce curvatura (fino a 90 ) nel DNA è un regolatore trascrizionale interviene nella ricombinazone sito-specifica e nella trasposizione 11

12 Impacche3amento (ed organizzazione) del genoma eucario;co Figura 4.5 Matrice nucleare di una cellula umana visualizzata al microscopio ele3ronico. 12

13 Analisi delle MAR Matrix Attachment Regions (MAR) [o Scaffold Attachment Regions (SAR)] isolamento matrice nucleare per il 70 % coppie A-T - hanno sito riconoscimento per topoisom II è riesce anche a cambiare il DNA? Coppia di cromatidi fratelli in metafase I cromosomi sono una forma condensata di cromatina: complesso di DNA e proteine 13

14 La cromatina si può dividere in 2 tipi di materiale: EUCROMATINA fibre meno densamente compattate rispetto al cromosoma mitotico (dispersa nel nucleo) ETEROCROMATINA fibre molto compattate (per lo più in corrispondenza dei centromeri) Tramite un microscopio ottico le fibre di cromatina sono distinguibili Le stesse fibre passano senza interruzione da eu- ad etero- : sono stadi diversi di condensazione del materiale genetico Eterocromatina costitutiva: L Eterocromatina esiste sotto due forme struttura ripetitiva, priva di valore genico, che quindi non codifica Eterocromatina facoltativa: in grado di trasformarsi in eucromatina, ossia in cromatina attiva I geni sono repressi 14

15 NB Ø la completa inattivazione di un segmento di cromosoma NON porta alterazione struttura genica Ø Le sequenze di geni repressi sono diverse da un tipo cellulare all altro e, a seconda del tipo cellulare, i geni che si esprimono NON sono sempre gli stessi: QUESTO MECCANISMO È ALLA BASE DELLA DIFFERENZIAZIONE CELLULARE!!! Figura 4.6 Bandeggio G (Giemsa) di un corredo cromosomico umano. 15

16 Bandeggio dei cromosomi Bandeggio Giemsa bande chiare, dette G-negative, bande scure, dette G-positive (Giemsa ha affinità per regioni ricche in AT, le cui proteine associate sono facili da denaturare e digerire per via enzimatica). pattern di bande ha significato funzionale?? 16

17 Bandeggio R (Reverse) Denaturazione al calore (regioni ricche in AT) seguita dalla colorazione Giemsa Le bande scure sono regioni ricche in GC, le bande chiare sono ricche in AT (inverso del bandeggio G) Bandeggio C 17

18 Stru3ura citogene;ca del cromosoma X umano. La posizione del centromero permette di classificare i cromosomi in 4 tipi: A) acrocentrici : centromero in posizione terminale B) telocentrici: centromero in posizione subterminale C) submetacentrici: centromero in posizione submediana D) metacentrici: centromero in posizione mediana 18

19 Posizione centromero Geni che codificano per rrna Il CARIOTIPO è l immagine del completo corredo dei 46 cromosomi Come si ottiene? 1. Stimolazione alla divisione cellulare FITOEMOAGGLUTININA (PHA): 19

20 2. la colchicina blocca la divisione cellulare nella metafase: 3. in soluzione ipotonica le cellule vengono fatte scoppiare per liberare i cromosomi 4. i cromosomi vengono colorati, osservati al microscopio e fotografati 20

21 5. si cercano nelle foto le coppie di cromosomi omologhi e si dispongono in ordine dal più piccolo al più grande. NB Cariotipo umano di un uomo (presenza cromosoma Y) Se un tra=o di cromosoma va perso o si è trasferito su un altro cromosoma, viene rivelato dal cambiamento del bandeggio EX. Coppia di cromosomi 12 di individuo affe>o da atassia ereditaria Uno dei 2 cromosomi è più lungo per aggiunta di un pezzo di cromosoma 4 21

22 Organizzazioni atipiche di cromosomi e genomi cromosoma a spazzola Cromatidi tenuti insieme in corrispondenza dei chiasmi 22

23 Le anse sono circondate da ribonucleoproteine contenenti catene nascenti di RNA Cromosomi politenici Ex. Cromosomi giganti di Drosophila melanogaster Bande scure: cromatina inattiva Bande chiare: > attività trascrizionale FUNZIONE: aumentare il volume cellulare ma anche un vantaggio metabolico: L elevato numero di copie di geni permette un alto livello di espressione genica. 23

24 N tot geni > N bande In ogni banda geni multipli Per visualizzare geni 24

25 PUFF (o ANELLI di BALBIANI) Cromosoma ha necessità di rilassare la struttura si espande si creano siti dove viene SINTETIZZATO RNA Figura 4.10 Il centromero. 25

26 Il cromosoma eucariotico è un dispositivo di segregazione Cinetocore: Microtubule Organizing Center (MTOC) del cromosoma 26

27 Frammenti CEN: frammenti di DNA che contengono i centromeri conferiscono stabilità Sono intercambiabili tra i cromosomi I centromeri servono solo per attaccare i cromosomi al fuso, NON servono per distinguere tra loro i cromosomi - Il centromero lega un complesso proteico Responsabili connessione al microtubulo CDE-II Cse4p: interazione fondamentale CDE-I CBF1: CDE-III CBF3: non essenziale per funzione cromosoma essenziale 27

28 NB Molecola di DNA mancante del centromero NON segrega in modo appropriato Telomeri 28

29 Come fanno i cromosomi ad essere copiati completamente durante le divisioni cellulari e come vengono protetti dalla degradazione? 2009 NOBEL per la Medicina a: Elizabeth H. Blackburn Carol W. Greider Jack W. Szostak. Hanno caratterizzato il ruolo dei telomeri e l enzima che ne consente la formazione e il mantenimento: la Telomerasi TELOMERI Formula delle sequenze telomeriche: C n (A / T) m x (T / A) m G n n = 1-8 e m = 1-4 NB le ripetizioni di TTGGGG scoperte sul protozoo Tetrahymena thermophila sequenza poi dimostrata essere presente, con alcune varianti (GGGTTA), anche in altre specie (funghi, vegetali e mammiferi, uomo compreso) 29

30 Con quale meccanismo i telomeri conferiscono stabilità all estremità dei cromosomi? 1. Formazione quartetto di G 30

31 G-quadruplex (o G-tetradi o G4-DNA) 31

32 2. Formazione di anse (T-loop, D-loop) Reazione catalizzata dalla proteina che lega il telomero TRF2 d-loop T- loop protegge le estremità cromosomiche da nucleasi e da attività cellulari che possono essere dannose per la sua integrità, come dall attacco di proteine coinvolte nella riparazione. t-loop d-loop d- loop il filamento ricco in G rimuove un elica viene a formarsi una D, o loop di sfasamento. 32

33 La stabilità del T- LOOP è determinata - Dalla LUNGHEZZA DELLE SEQUENZE TELOMERICHE Da: de Lange T. Protection of mammalian telomeres Oncogene. 2002, 21: Dalle PROTEINE TELOMERICHE - Dalle PROTEINE DELLA RIPARAZIONE presenti al telomero 33

34 Quale caratteristica del telomero controlla la stabilità dell estremità cromosomica? (5-10 kb) L assenza di estremità libere stabilizza il cromosoma la TELOMERASI consente l allungamento del telomero 34

35 Il problema della replicazione Se meccanismo replicazione del DNA agisse da solo sui cromosomi, dopo numerose divisioni la perdita di DNA sarebbe significativa e porterebbe tutte le cellule alla senescenza. 35

36 I TELOMERI sono necessari per la sopravvivenza La Telomerasi mantiene le estremità dei cromosomi dopo ogni divisione cellulare. catalizza la reduplicazione dei telomeri; enzima è costituito da TERT (TElomerase Reverse Trascriptase) TERC (TElomerase RNA Component) un piccolo RNA. Se telomerasi è mutata telomeri si accorciano ad ogni divisione cellulare 36

37 TELOMERI E TUMORE E stato dimostrato che la telomerasi è espressa nella grande maggioranza dei tumori. Telomerasi sembra essere necessaria per lo sviluppo e la proliferazione del tumore. 37

38 APOPTOSI E TELOMERI: l accorciamento telomerico può indurre apoptosi. alterazioni della struttura telomerica => riarrangiamenti cromosomici Attivazione checkpoints aumento dell'apoptosi 38

39 TELOMERI E SENESCENZA lunghezza dei telomeri : l'eta' biologica di un individuo 39

40 Funzioni biologiche dei cromosomi Perpetuare il materiale genetico durante lo sviluppo di un individuo corretta replicazione corretta suddivisione tra le cellule figlie Rimescolare il materiale genetico tra generazioni successive ricombinazione meiotica segregazione degli omologhi 40

41 RIASSUMENDO: Requisiti strutturali minimi per l esistenza di un cromosoma DNA si replica a par2re dall ORIGINE DI REPLICAZIONE in entrambe le direzioni CENTROMERO a>acca i cromosomi al FUSO in modo che si possano separare TELOMERI formano cappuccio che chiude i cromosomi alle estremità I cromosomi eucariotici hanno bisogno dei seguenti elementi non genici, non coinvolti nella regolazione genica, per una corretta replicazione e segregazione: - Origini di replicazione: siti d assemblaggio dei complessi di replicazione eucarioti: una origine ogni kb procarioti: una sola origine per cromosoma - Centromeri: siti di assemblaggio del cinetocoro, complesso proteico responsabile della segregazione dei cromosomi replicati (uno per cromosoma) - Telomeri: complessi proteici localizzati alle estremità dei cromosomi, proteggono da ricombinazione e degradazione. La telomerasi completa la replicazione dei terminali. 41

42 Centromero Consente la corretta segregazione dei cromosomi durante la mitosi e la meiosi appare come una costrizione in un unico punto lungo il cromosoma. Per ogni cromosoma il centromero é sempre nella stessa posizione Nella maggior parte degli eucarioti ad ogni centromero si attaccano molte fibre del fuso Se il centromero é assente il cromosoma NON può attaccarsi al fuso e può solo migrare casualmente durante la divisione cellulare 42

43 Telomeri Strutture specializzate che si trovano all'estremità dei cromosomi lineari Permettono la replicazione completa del cromosoma Impediscono l'accorciamento progressivo dei cromosomi Il cromosoma senza telomeri é: - instabile: degradato dalle esonucleasi - altamente reattivo: interagisce rapidamente con altre strutture cellulari tra cui i cromosomi: si formano strutture aberranti che non possono essere correttamente distribuite dal fuso mitotico Origini di replicazione Sequenze specifiche associate al punto di inizio della sintesi del DNA riconosciute da proteine che legano e destabilizzano il DNA La destabilizzazione apre il DNA in corrispondenza dell'origine di replicazione 43

44 YAC (Yeast Artificial Chromosome) CEN: per corretta segregazione Origine della replicazione CEN: per stabilizzare YAC 44