riscontrati in alcuni ibridi di mais di prima generazione rispetto ai genitori.

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1 1 INTRODUZIONE 1.1 ETEROSI Il termine eterosi è stato proposto da Shull nel 1911 per indicare l'aumento di produzione, dovuto alle maggiori dimensioni, adattabilità, resistenza a malattie e ad insetti, riscontrati in alcuni ibridi di mais di prima generazione rispetto ai genitori. Sono state fatte molte indagini per spiegare le cause genetiche dell'eterosi ma non si è ancora trovata una spiegazione esauriente. Esistono tuttavia due ipotesi: a) Teoria della dominanza Secondo questa teoria, l'eterosi è dovuta all'azione di fattori favorevoli e dominanti. Questa teoria non è in grado di spiegare perchè non si ottengono linee pure omozigoti per alleli dominanti con lo stesso "vigore" degli ibridi. In accordo con Jones (1917), la spiegazione può essere fornita considerando la difficoltà di concentrare nella stessa linea solamente i fattori favorevoli e dominanti, data la loro inevitabile concatenazione con fattori sfavorevoli e recessivi. b) Teoria della sovradominanza (East, 1936; Hull, 1945; Shull, 1952). Secondo questa teoria, l eterosi risulta dall'interazione di alleli complementari allo stesso locus; tale interazione si traduce in un effetto di dominanza superiore all effetto additivo (superdominanza). Per avere eterosi è pertanto essenziale l eterozigosi e le

2 combinazioni omozigoti non possono eguagliare, nemmeno in teoria, le combinazioni eterozig oti. Altri sostengono che l'eterozigosi determina il "vigore" dell'ibrido in quanto permette una maggiore variabilità biochimica, nel caso in cui il carattere sia controllato dalla codominanza (espressione di entrambi gli alleli allo stesso locus) Eterosi nel frumento Le prime osservazioni sull esistenza di eterosi in frumento risalgono all inizio del secolo. Freeman (1919) mise in evidenza effetti eterotici per il carattere altezza della pianta in incroci di T. aestivum e T. durum. Da allora molti lavori sono stati pubblicati sull argomento e molteplici sono stati i caratteri considerati, quali la produzione e le sue componenti, lo sviluppo dell apparato fogliare a dell apparato radicale, e i caratteri qualitativi. I valori di eterosi per il carattere produzione sono spesso risultati molto elevati e in alcune combinazioni spesso superiori al 50% rispetto al miglior genitore o rispetto alle varietà testimoni. Questi valori hanno però scarso interesse pratico in quanto le osservazioni venivano fatte su poche piante allevate in coltura spaziata: ciò era dovuto al fatto che gli incroci venivano effettuati a mano, previa emasculazione delle linee portaseme e, pertanto, le produzioni di seme ibrido risultavano modeste. Solo dopo la scoperta, avvenuta agli inizi degli anni 50, dell esistenza di geni in grado di indurre maschiosterilità citoplasmatica e dei geni ristoratori della fertilità fu

3 possibile preparare il seme ibrido in quantità maggiore e, quindi, valutare i medesimi in parcelle ripetute e seminate a densità normale. In studi recenti condotti a S.Angelo Lodigiano da Borghi e Perenzin (1996) è stato evidenziato che gli ibridi presentano una capacità produttiva superiore a quella delle varietà tradizionali e che la scelta dei parentali è essenziale per l ottenimento di elevati livelli produttivi. In particolare se si considera la produzione in granella degli ibridi costituiti negli ultimi 10 anni a S.Angelo Lodigiano è possibile osservare un andamento positivo (tab. 1). Infatti mentre nel primo gruppo di 141 ibridi valutati nel 1985 non vi erano combinazioni in grado di superare del 10% la produzione delle varietà testimoni; nell ultimo gruppo valutato negli anni , l 11% degli ibridi ha superato la produzione delle varietà testimoni di oltre il 15%. 1.2 METODI PER LA PRODUZIONE DEGLI IBRIDI DI FRUMENTO La produzione su larga scala degli ibridi di frumento risulta difficile poichè richiede l'adattamento di una pianta tipicamente autogama (per di più cleistogama) all'impollinazione incrociata tipica delle piante allogame. Tre sono le procedure applicabili per prevenire l'autoimpollinazione: - l'emasculazione manuale; - l'uso della maschiosterilità citoplasmatica;

4 - l'uso di agenti chimici capaci di indurre la sterilità maschile. Solo le ultime due tecniche sono potenzialmente utilizzabili in quanto l'emasculazione manuale, consistente nella rimozione delle antere, è una tecnica applicabile solo su un limitato numero di spighe e viene utilizzata per produrre combinazioni di incrocio da valutare nelle generazioni segreganti. Negli anni compresi tra il 1950 e il 1970 si sono intensificate le ricerche sui sistemi genetici in grado di consentire l'impollinazione incrociata e la produzione di seme ibrido: si è cercato, ad esempio, di sfruttare la sterilità citoplasmatica combinata con l'uso di geni ristoratori della fertilità (Johnson et al., 1968). Tra la fine degli anni '70 e l'inizio degli anni '80, le ricerche relative a questo settore sono state fortemente ridimensionate o addirittura sospese (soprattutto nel settore delle compagnie sementiere private). Ci si era infatti resi conto che il meccanismo biologico che veniva sfruttato per produrre gli ibridi era complesso, rischioso e richiedeva tempi lunghi per cui gli ibridi così prodotti non risultavano competitivi con le varietà tradizionali, prodotte con continuità secondo le procedure selettive convenzionali Agenti chimici sterilizzanti

5 I gametocidi sono prodotti che interferiscono con la gametogenesi maschile o impediscono la disseminazione del polline oppure attivano meccanismi di autoincompatibilità. I gametocidi sono chiamati anche agenti chimici ibridizzanti (Chemical Hybridizing Agents, CHA) o soppressori del polline (Chemical Pollen Suppressant, CPS) e vengono impiegati sul frumento allo scopo di "forzare" la pianta a compiere l'impollinazione incrociata per la produzione di ibridi. Il procedimento risulta estremamente semplificato rispetto al metodo di produzione degli ibridi di frumento mediante l'uso della maschiosterilità citoplasmatica. Infatti una volta individuate le combinazioni migliori la produzione su larga scala si esegue seminando in campi isolati la linea maschile e la linea femminile a strisce alternate e irrorando con il prodotto gametocida la linea o varietà portaseme quando è nello stadio ottimale per il trattamento (fig. 1) Vantaggi offerti dai gametocidi Diversi sono i vantaggi che gli agenti chimici sterilizzanti presentano rispetto all'utilizzazione della sterilità citoplasmatica per la produzione di ibridi (Carver et al., 1984):

6 a) le linee da utilizzare come genitori possono essere ottenute con i metodi tradizionali evitando così gli anni necessari per produrre le linee maschiosterili con il metodo genetico; b) non è più necessario allevare le linee mantenitrici per riprodurre le linee maschiosterili; c) viene completamente eliminata la necessità di ricercare le linee ristoratrici della fertilità; d) qualsiasi varietà o linea può essere impiegata come genitore sia maschile che femminile e non è quindi più necessario il lungo lavoro di ricerca e incorporazione dei fattori di sterilità e dei relativi ristoratori; e) diviene possibile produrre simultaneamente centinaia di combinazioni ibride; f) una volta individuata la combinazione migliore è possibile riprodurla immediatamente su scala commerciale; g) la quantità di seme ibrido prodotto può essere più facilmente programmata in base alle richieste di mercato Requisiti che dovrebbe possedere un gametocida Secondo Virmani et al. (1983) le caratteristiche ideali che un buon agente sterilizzante dovrebbe possedere sono:

7 a) alta selettività, che consenta di indurre solamente la sterilità maschile senza effetti collaterali sulla fertilità femminile; b) lunga persistenza, tale da sterilizzare sia la spiga del culmo principale sia quella dei culmi di accestimento; c) ampio periodo di efficacia per garantire l'utilizzazione su vaste superfici o su culture a diverso stadio di sviluppo; d) assenza di effetti fitotossici; e) capacità di rendere non funzionale il polline, cioè, il gametocida non deve semplicemente rendere le antere indeiscenti con polline vitale. 1.3 PRODUZIONE DEL SEME IBRIDO DI FRUMENTO Per produrre il seme ibrido è necessario modificare il sistema riproduttivo normale del frumento, basato sull'autofecondazione. Vi sono una serie di fasi, durante la fioritura e la fecondazione, che sono critiche per la produzione di seme ibrido (Linskens, 1967; Stanley et al., 1974). Bisogna conoscere a fondo la biologia del polline e dello stigma Struttura generale dell infiorescenza del frumento

8 L'infiorescenza del frumento è una spiga composta costituita da un asse principale detto rachide, che porta un numero variabile di spighette. Ogni spighetta ha un asse piuttosto corto detto, rachilla, sul quale le glume sono disposte alternativamente ai lati opposti. Le due glume in basso sono sterili, le altre sono fertili e contengono i fiori, in numero da due a cinque per spighetta. Ogni fiore è costituito da due formazioni membranacee, le glumelle, che racchiudono l androceo e il gineceo. Delle due glumelle quella inferiore o basale o lemma, può essere mutica o provvista di una resta più o meno lunga (3-8 cm), quella superiore è generalmente mutica ed è chiamata palea. Tra la lemma e la palea si trovano gli organi sessuali: tre stami ed un pistillo. Il pistillo è costituito da un ovario supero monocarpellare con due corti stili e stigmi piumosi (fig. 2). Alla base del gineceo sono presenti due piccole squame (lodicole). Uno o più fiori superiori della spighetta sono imperfetti o sterili. Da una a quattro spighette di una spiga sono normalmente sterili Sistema riproduttivo Il T. aestivum (frumento tenero) ha un alto grado di autofecondazione (fino al 99%). Le principali cause d'incrocio sono una forte proteroginia, oppure condizioni climatiche avverse (Percival, 1921). Lo sviluppo, dalle antere indifferenziate ai granuli

9 pollinici maturi, si compie in circa tre settimane (Goss, 1968). Successivamente le lodicole acquistano turgidità idratandosi e spingono la lemma e la palea a parte provocando una lieve "prima apertura" del fiore (3-4 mm circa) che determina l'esposizione dello stigma. Secondo Anslow (1963), contemporaneamente si estendono i filamenti degli stami fino ad oltre 10 mm di lunghezza e si verifica l'estrusione delle antere, la deiscenza e il conseguente rilascio del polline nel fiore e sullo stigma. Dopo l'autoimpollinazione, circa l'80% del polline viene rilasciato fuori dal fiore. La durata della "prima apertura" è variabile ma strettamente limitata nel tempo. Leighty et al. (1924) hanno trovato un intervallo di minuti in una singola popolazione di frumento in cui la media era di circa 25 minuti. Dopo il collassamento delle lodicole alla fine della "prima apertura" il fiore si chiude e il pistillo inizia ad espandersi (Molnàr et al., 1980). I fiori di frumento non fecondati si riaprono circa 3 giorni dopo l'antesi grazie al rigonfiamento dell'ovario e si manifesta un'esposizione ulteriore dello stigma (fig. 3). I fiori esterni di una spighetta maturano prima e producono granuli pollinici più fertili e di maggiori dimensioni (Ovcinnikov, 1951; 1952). Le spighette della zona centrale fioriscono per prime seguite da quelle della zona superiore ed infine da quelle della zona inferiore Sistema riproduttivo modificato per la produzione di seme ibrido

10 Wilson (1968) ha suggerito che la natura della fioritura nel frumento indica che l impollinazione incrociata era prevalente nelle forme ancestrali e può essere ancora operativa nelle forme attuali. E probabile, tuttavia, che durante l era moderna del miglioramento del frumento ci sia stata una pressione selettiva contro le strutture fiorali che favorivano l impollinazione incrociata (Johnson et al., 1967). Per il successo dell impollinazione incrociata ad opera del vento nel frumento si devono verificare tre condizioni: le antere devono essere deiscenti e il rilascio di polline abbondante (Knox et al., 1986); il polline deve possedere le caratteristiche idonee a facilitare il trasporto fino al genitore femminile (Niklas, 1985); lo stigma deve fuoriuscire dalle glumelle (De Vries, 1971). Complessivamente il sistema riproduttivo modificato richiede perché avvenga l impollinazione incrociata che: il fiore sia aperto; lo stigma sia esposto e recettivo; l antera rilasci il polline fuori dal fiore; il vento sia sufficiente per il trasporto del polline; il polline sia facilmente trasportabile. 1.4 POLLINE DEL FRUMENTO E FECONDAZIONE INCROCIATA

11 Sebbene un granulo pollinico per ogni stigma sia sufficiente a compiere la fecondazione, secondo Ottaviano et al. (1989), la percentuale di allegagione in diverse specie (calcolata come rapporto tra la produzione di seme ottenuta dal maschiosterile e quella del controllo fertile) è positivamente correlata con il numero di granuli pollinici che arrivano sullo stigma (tab. 2) Principi fisici dell impollinazione nel frumento La struttura del granulo pollinico varia al variare delle condizioni ambientali e influenza l'efficienza dell'impollinazione incrociata; ad esempio, l'idratazione del polline cambia prima, durante e dopo l'antesi alterando il trasporto a distanza. Dopo la deiscenza dell'antera si possono distinguere tre fasi: l'entrata del granulo pollinico nella corrente d'aria; il trasporto del granulo pollinico nella corrente d'aria; l'impatto del granulo pollinico con lo stigma del genitore femminile. Secondo Gregory (1973), Niklas (1985), e Crane (1986) la distanza di trasporto del polline del frumento e l'efficienza della fecondazione incrociata sono controllati da fattori biofisici. Uno studio sull'aerodinamica del granulo pollinico del frumento ha evidenziato una velocità di caduta sulla stigma di cm/sec.

12 Tale velocità risulta molto alta soprattutto se viene confrontata con quella del polline di altre specie ad impollinazione incrociata naturale, ad esempio per l'erba è di 3 cm/sec (Dowding, 1987). Tale autore suggerisce inoltre che il polline del frumento non presenti caratteristiche ideali per l impollinazione incrociata su larga scala Distanza di dispersione del polline La distanza di dispersione del polline è influenzata dalla dimensione, densità e caratteristiche di superficie dei granuli (Stanley et al., 1974), e dalle condizioni climatiche che prevalgono all'antesi. La maggior parte del polline rimane intorno alle piante di origine, entro 10 metri, anche se ci sono evidenze di trasporto a distanze considerevoli, fino a 60 metri. Le allegagioni più elevate, vicine all'80%, sono state ottenute quando i genitori femminili erano sottovento rispetto agli impollinatori (Pickett, 1987).

13 1.4.3 Effetti del clima Le condizioni climatiche ottimali per la disponibilità del polline secondo Liem (1967) sono quelle di tempo secco e soleggiato con vento debole. Le condizioni ambientali possono determinare variazioni annuali considerevoli nella quantità di polline prodotta e dispersa, come risulta da uno studio condotto sulle graminacee da Andersen (1980). Secondo Emecz (1962) tale influenza può essere addirittura superiore a quella del genotipo. Lo stesso autore sottolinea l'importanza, durante l antesi, delle relazioni acquose (scambi di acqua del granulo pollinico con la pianta madre e con l aria) della temperatura dell'aria, dell'intensità luminosa e del vento Relazioni acquose I livelli di umidità sono importanti per il rilascio, il trasporto e la successiva germinazione del granulo pollinico (Heslop et al., 1979a; 1987). La pioggia è una delle maggiori cause di variabilità nella fecondazione incrociata; in particolare, Wilson (1984) afferma che l'estrusione dell'antera è un fenomeno molto suscettibile agli stress idrici. Anche l'estensione del filamento dello stame dipende dalla

14 quantità di acqua disponibile (Heslop et al., 1979a) e può essere ridotta se il contenuto idrico è basso (Schmid, 1976). Secondo Heslop et al. (1979a) il grado di idratazione delle piante immediatamente prima dell'antesi influenza il contenuto idrico del granulo pollinico. Questi autori affermano che il polline e l'antera sono secchi alla deiscenza in seguito alla perdita di acqua che si verifica nelle ore che precedono l'antesi. La perdita di umidità continua rapidamente mentre il polline è trasportato dalla corrente d'aria e il suo grado di disseccamento dipende dalla temperatura e dall U.R. dell'aria come è stato mostrato per il polline del mais da Barnabàs et al. (1976). Una carenza di U.R. nell'aria porta ad un polline più leggero per l'effetto del disseccamento, migliora quindi l'aereodinamica e il trasporto tuttavia determina anche una perdita di vitalità e una riduzione della germinazione (Heslop et al., 1979b). Come risulta da studi condotti da Emecz (1962), la pioggia tende a far ritardare l'antesi, a ridurre l'estrusione delle antere, a diminuire la vitalità e il trasporto del polline e determina quindi una diminuzione dell impollinazione incrociata. L'acqua è essenziale per la reidratazione e successiva germinazione del granulo pollinico (Heslop et al., 1979b). Infatti la reidratazione avviene mediante il trasferimento di acqua dallo stigma al granulo pollinico; fenomeno che si verifica molto rapidamente e la cui velocità aumenta con il grado di disseccamento del polline. Il frumento, essendo

15 autogamo, non è stato selezionato per la tolleranza alle condizioni sfavorevoli durante la fioritura Temperatura La temperatura ha un'influenza sul periodo e sulla durata della fioritura (Emecz, 1962). Le temperature elevate hanno un effetto disseccante sul polline; accelerano il periodo di fioritura e la crescita del tubetto pollinico; inoltre secondo studi condotti sul mais da Schoper et al. (1987) le alte temperature riducono l'estrusione delle antere e la germinazione del polline. In condizioni asciutte viene ridotta anche la vitalità del polline (Lucken, 1986). Le basse temperature sono nocive per il regolare sviluppo del polline e impediscono l'estrusione delle antere. La temperatura controlla anche il momento del giorno in cui viene rilasciata la maggior quantità di polline; ad esempio, in Olanda, De Vries (1972) ha evidenziato due picchi giornalieri del rilascio del polline, il primo, più abbondante tra le 8 e le 11 e il secondo meno pronunciato tra le 15 e le 18 (fig. 4) Intensità luminosa