Studio sull omeostasi dei vertebrati ectotermi del Parco Regionale del Matese attraverso indagini ematologiche

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1 I Vertebrati ectotermi del Parco Regionale del Matese, 2002 A cura di Odierna G. e Guarino F.M., pp Studio sull omeostasi dei vertebrati ectotermi del Parco Regionale del Matese attraverso indagini ematologiche CRISTINO LUIGIA, PICA ALESSANDRA, DELLA CORTE FRANCESCO Dipartimento di Biologia Evolutiva e Comparata Università degli Studi di Napoli Federico II Abstract The evaluation of the hematological parameters in the circulating blood and the study of blood-cell composition in the circulating blood and the hemopoietic organs of ectothermal vertebrates captured in the Matese area provided a valid tool for the evaluation of health conditions in the specimens living this habitat. Hemochromocytometric analysis gave values slightly higher than the standard ones in amphibians, probably depending on the altitude at which the species were sampled. In the reptilian species examined, we observed eosinophilia both in the peripheral blood and in the hemopoietic tissue, as well as a slight decrease in the number of the red blood cells; they are ascribable to infection from a protozoan of the Emoproteus type observed in the erythrocytes in all the reptilian species studied. Introduzione La determinazione dei parametri ematologici ed emopoietici rappresenta un valido strumento per valutare lo stato di salute di un organismo animale e l influenza che su di esso esercita l ambiente in cui vive. In particolare lo studio della composizione cellulare del sangue può rivelare la storia immunitaria degli animali in esame e fornire utili informazioni riguardanti l impatto con agenti patogeni ambientali. Nei Vertebrati ectotermi (Pesci, Anfibi e Rettili), più che negli omeotermi, i parametri ematologici ed emopoietici sono sensibilmente influenzati dalle condizioni ambientali come la concentrazione di O 2, la pressione atmosferica e l altitudine e, soprattutto, la temperatura e quindi la stagione e lo stadio riproduttivo. Gli animali esaminati nella presente indagine sono stati catturati nel Parco Naturale del Matese nel periodo Aprile-Luglio La determinazione dei parametri ematologici è stata eseguita prevalentemente su esemplari di specie quantitativamente più significative al momento della cattura, allo scopo di fornire dati statisticamente validi e rappresentativi della popolazione locale di quella specie. Per questo motivo sono state esaminate solo le classi degli Anfibi e dei Rettili delle seguenti specie: Rana italica e Rana synklepton esculenta

2 150 CRISTINO ET AL (Anfibi); Podarcis muralis, Podarcis sicula e Lacerta bilineata (Rettili). Le specie Rana italica e R. synklepton esculenta appartengono all ordine degli Anuri. È ampiamente noto dalla letteratura (cfr Rowley & Ratcliffe, 1988; Della Corte & D Ippolito, 1999) che, con la comparsa del midollo osseo, gli Anfibi sono i primi Vertebrati nei quali l emopoiesi si disloca progressivamente da milza, fegato e rene (organi che nei Pesci svolgono funzioni emopoietiche) al midollo osseo, eccetto nella specie Xenopus in cui l eritropoiesi persiste nella milza, nel fegato e nel rene mentre la granulocitopoiesi si svolge nel midollo osseo e la linfo- e trombocitopoiesi si svolgono nella milza. In Rana italica e Rana synklepton esculenta il midollo osseo è un importante centro emopoietico anche se restano siti funzionali nel fegato e nella milza. La dislocazione dell attività emopoietica nel midollo osseo diventa prevalente negli Anfibi Anuri adulti ma si verifica in parte già in alcuni Urodeli: sembra che soltanto nella famiglia dei pletodontidi (Pletodon glutinosus) sia presente il midollo osseo emopoietico capace però solo di granulocitopoiesi, non di eritropoiesi, che avverrebbe nella milza (Rowley & Ratcliffe, 1988). Nei Vertebrati ectotermi (Pesci, Anfibi e Rettili) i valori ematologici e l emopoiesi variano molto secondo le stagioni per cui si può dire che nei periodi di attività riproduttiva, almeno iniziale o centrale, tutto il metabolismo così come l emopoiesi è più intenso. L emopoiesi avviene nel midollo osseo, in prevalenza delle ossa lunghe, e gli elementi maturativi seguono le stesse tappe di quelli dei Mammiferi, con alcune diversità nelle tappe finali dell eritropoiesi e trombocitopoiesi. La comune struttura morfo-funzionale degli organi emopoietici è rappresentata dal tessuto reticolare costituito dalle omonime fibre nella cui trama scorrono i capillari sinusoidali provenienti dall arteria nutritiva dell osso. In particolare il tessuto reticolare del midollo osseo è costituito, oltre che da fibre reticolari, anche da fibre di collagene e cellule reticolari non emopoietiche tra cui notevole importanza rivestono le cellule reticolari fibroblastiche che fanno da sostegno alla trama cavitaria in cui giacciono le cellule emopoietiche. Queste ultime, a loro volta, circondano a gruppi i macrofagi in modo da costituire l isolotto eritroblastico o eritrone. L eritrone è l unità anatomica in cui si svolgono le fasi di amplificazione dei precursori cellulari eritroidi ed il loro differenziamento in elementi via via più maturi, a partire da una cellula staminale emopoietica totipotente (TSHC). L eritropoiesi consiste nella produzione e maturazione degli elementi della serie rossa del sangue che procede, a partire da TSHC, attraverso i seguenti stadi: (1) proeritroblasto, (2) eritroblasti: basofilo, policromatofilo, ortocromatico, (3) eritrocita (che, a differenza di quello dei Mammiferi è una cellula completa di nucleo). La granulocitopoiesi consiste nella maturazione e produzione dei granulociti polimorfonucleati, a partire da TSHC, attraverso i seguenti stadi: mieloblasto,

3 Le cellule sanguigne negli Anfibi e nei Rettili del Matese 151 promielocito, mielocito, metamielocito e granulocito. In merito al tipo di granulazione secondaria del citoplasma i granulociti si distinguono in neutrofili (50-70%), eosinofili (1-4%) e basofili (0-1%). I granulociti del primo e secondo tipo prevalgono nelle infezioni acute durante le quali si dirigono presso i focolai tissutali e, per fagocitosi, distruggono il materiale estraneo. La monocitopoiesi consiste nella produzione e maturazione dei monociti a partire dalla TSHC attraverso i seguenti stadi: (1) monoblasto, (2) promonocita, (3) monocita che dopo l immissione in circolo migra nei tessuti trasformandosi in macrofago. Come i granulociti neutrofili, anche i macrofagi svolgono fagocitosi (grazie alla presenza citoplasmatica di lisosomi primari) e con maggiore efficacia poiché sono in grado di distruggere anche grossi batteri e miceti. I monociti svolgono inoltre funzione emocateretica nella milza e nel fegato. La linfocitopoiesi consiste nella produzione e maturazione dei linfociti T e B dai rispettivi linfoblasti a partire dalla TSHC. I linfociti B si differenziano in linfociti B memoria ( responsabili dell immunità umorale) ed in plasmacellule (che producono una determinata classe di anticorpi); i linfociti T sono invece responsabili dell immunità cellulare o cellulo-mediata. La trombocitopoiesi è il processo di produzione e maturazione dei trombociti che, nei Vertebrati eterotermi svolgono le funzioni coagulative regolate delle piastrine nei Vertebrati più evoluti. Gli scopi della presente indagine sono: 1. fornire una stima dei valori ematologici ed emopoietici delle specie esaminate; 2. correlare i valori ematologici ed emopoietici con il sesso, la stagione e, quindi, lo stadio riproduttivo; 3. valutare la eventuale presenza di patologie ematologiche. Materiali e metodi Per i nostri scopi è stato prelevato sangue circolante da 18 Rane e 32 Lacertidi delle specie e del sesso di seguito specificato e midollo emopoietico da circa la metà degli esemplari; tutti gli esemplari esaminati sono adulti e sessualmente maturi. Rana italica (11 esemplari= 5 femmine e 6 maschi) Rana synklepton esculenta (7 esemplari= 7 maschi) Podarcis muralis (13 esemplari= 7 femmine e 6 maschi ) Podarcis sicula (11 esemplari= 8 femmine e 3 maschi ) Lacerta bilineata (8 esemplari= 3 femmine e 5 maschi ) Gli Anfibi della specie Rana italica (n= 11) sono stati catturati nel periodo di aprile-maggio; la lunghezza media del corpo muso-cloaca è 5 ± 0,5 cm; il peso medio per i maschi è 15 ± 1 gr e per le femmine è 10 ± 1 gr.

4 152 CRISTINO ET AL Gli esemplari di Rana synklepton esculenta (n=7) sono stati catturati nel periodo maggio-giugno e sono tutti di sesso maschile; la lunghezza media del corpo musocloaca è 4,8 ± 0,8 cm; il peso medio i è 12 ± 1 gr. I Rettili della specie Podarcis muralis (n=13) sono stati catturati nel periodo di maggio-giugno; la lunghezza media del corpo muso-cloaca è 5,5 ± 0,5 cm; il peso medio per i maschi è 6,0 ±0,5 gr e per le femmine è 5,5 ± 0,5 gr. Gli esemplari di Podarcis sicula (n=11) sono stati catturati nel periodo maggio/giugno (n=6) e luglio (n=5); la lunghezza media del corpo muso-cloaca è 5,5 ± 0,4 cm; il peso medio per i maschi è 7,0 ± 1,2 gr e per le femmine è 5,0 ± 1,0 gr. Gli esemplari di Lacerta bilineata (n=8) sono stati catturati nel periodo di maggio; la lunghezza media del corpo muso-cloaca è 12,5 ± 0,8 cm; il peso medio per i maschi è 25,0 ± 1,2 gr e per le femmine è 20 ± 1 gr. Gli animali sono stati anestetizzati con vapori di etere prima di essere sottoposti al prelievo di sangue e del midollo osseo femorale. Il prelievo di sangue è stato eseguito dal vaso femorale negli Anuri e caudale nei Lacertidi mediante aspirazione con siringhe da insulina dotate di soluzione di anticoagulante EDTA-3K (Etilendiamintetracetato) nella dose 20 µl al 2% per ml di sangue raccolto. Una quantità di 0,5 ml di sangue è stata prelevata da ciascun animale. Il midollo emopoietico è stato prelevato dal femore degli esemplari sacrificati. Il sangue è stato impiegato per eseguire l esame emocromocitometrico e l esame morfologico mediante la tecnica degli strisci con la colorazione di May Grünwald- Giemsa (M.G.G.) e la reazione alla benzidina-perossidasi sec. Lepehne per l evidenziamento delle cellule eritroidi. Il midollo osseo è stato utilizzato per eseguire apposizioni a fresco di cellule in toto per lo studio morfologico degli elementi cellulari, mediante la colorazione di M.G.G. Esame emocromocitometrico Consiste nella determinazione dei seguenti parametri: - ematocrito (Ht), - concentrazione di emoglobina (Hb), - conteggio degli elementi figurati (numero di globuli rossi=rbc, numero dei globuli bianchi=wbc e numero dei trombociti=tbc), - formula leucocitaria su striscio. L ematocrito esprime il rapporto in % tra la frazione corpuscolata del sangue ed il plasma; è stato eseguito in microcapillari di vetro previa centrifugazione per 5 minuti a 3000 rpm. La concentrazione dell emoglobina (gr/dl) è stata calcolata con il metodo spettrofotometrico alla cianmetaemoglobina diluendo il campione con il reattivo

5 Le cellule sanguigne negli Anfibi e nei Rettili del Matese 153 di Drabkin, confrontando l estinzione del campione con quella dello standard e moltiplicando per il fattore di diluizione appropriato. Il conteggio degli elementi figurati è stato eseguito mediante il metodo della conta diretta con emocitometri tipo Bürker. La diluizione è stata eseguita nelle pipette di Thoma impiegando soluzione fisiologica, per i globuli rossi, e liquido di Türk (soluzione al 2% di acido acetico e 0,3% di violetto di genziana in H 2 O distillata) per la diluizione dei globuli bianchi, nella proporzione di 1:200 Il numero complessivo degli elementi figurati di ciascun tipo è stato calcolato moltiplicando rispettivamente per il numero medio dei globuli rossi contenuti in 20 rettangoli D della camera di Bürker, per 2000 il numero medio dei bianchi contenuti in 4 quadrati A e per 2000 quello dei trombociti presenti in 4 rettangoli D. La formula leucocitaria esprime la concentrazione in % o in numero/µl delle varie classi di leucociti presenti sullo striscio di sangue colorato con il metodo M.G.G. Colorazioni morfologiche di strisici ed apposizioni a) Colorazione di May-Grünwald Giemsa (M.G.G.): b) Colorazione di Lepehne: l impiego dell omonimo reattivo (soluzione allo 0,6% di benzidina-base in alcool etilico 96 e di perossido d idrogeno al 10% in alcool etilico 70 ) secondo Undritz (1953) fornisce una tipica colorazione giallo-bruna dell Hb degli elementi immaturi della serie rossa che tende al bruno-verde oliva nelle cellule più mature; i proeritroblasti, che non contengono ancora emoglobina, sono negativi. Risultati e osservazioni Anfibi I risultati dell esame emocromocitometrico sono riassunti nelle tabelle 1A ed 1B rispettivamente per le specie Rana italica ed R. synklepton esculenta distinte per sesso e mese di cattura. Sono riportati i valori medi calcolati sulla popolazione (distinta tra i due sessi) ± la media della deviazione standard (SDM). La formula leucocitaria non comprende i trombociti. Sesso Ht (%) Hb (g/dl) WBC TBC RBC n cellule/µl n cellule /µl n cellule /µl M (n=6) 13,6±0,4 6,5±0, ± ± ± 550 F (n=5) 10,7±0,7 4,8±0, ± ± ±640 Tab. 1A: Rana italica (Aprile-Maggio)

6 CRISTINO ET AL 154 Sesso M (n=7) Ht (%) 13,0±0,6 Hb (g/dl) 7,5±0,2 WBC TBC RBC n cellule/µl n cellule /µl n cellule /µl 9.500± ± ±750 Tab. 1B: Rana synklepton esculenta (Maggio-Giugno) Fig. 1: Microfotografie degli elementi corpuscolati di strisci di sangue periferico di Rana italica colorati con M.G.G. in A: eritrociti maturi (EM), un linfocita di piccole dimensioni (L) ed un eritroblasto basofilo (Eb); B: si osservino due eritroblasti acidofili (Ea), un monocita (M) ed un linfocita (L); C: granulocita neutrofilo trilobato (in alto) e bilobato (in basso) (Gr.N); D: granulocita quadrilobato (Gr.N); E: granulocita eosinofilo (Gr.E); F: granulocita basofilo (Gr.B); G: Granulocita basofilo degranulante (Gr.B). Scale bar in G=10 µm come A-F.

7 Le cellule sanguigne negli Anfibi e nei Rettili del Matese 155 Gli eritrociti circolanti maturi di Rana italica ed R. synklepton esculenta hanno forma ellittica, sono grandi (Ø =22x14 µm), hanno il nucleo centrale e sferico ed il citoplasma pieno di emoglobina con pochi organuli citoplasmatici (Fig. 1, A). Dalla formula leucocitaria risulta che i granulociti neutrofili (Fig. 1, C e D) sono grandi (Ø=12-14 µm), il nucleo è plurilobato ed il citoplasma pieno di granuli positivi alla perossidasi. Frequente è la presenza di residui di fagociti sottoforma di grossi granuli densi chiari nel citoplasma dei neutrofili. I granulociti eosinofili (Ø =14 µm) sono sempre meno numerosi dei neutrofili in condizioni normali, presentano i granuli più grossi, spesso allungati, e negativi alla perossidasi (Fig. 1, E). I granulociti basofili sono rari (1-2%), hanno grossi granuli blu-scuro, tipicamente metacromatici al M.G.G (Fig. 1, F e G). I monociti sono rotondeggianti (Ø =14x16 µm) con grosso nucleo indentato o reniforme, ampio citoplasma con fini granuli azzurrofili, sempre positivi alla perossidasi, a differenza dei linfociti, e spesso presentano pseudopodi (Fig. 1, B). Tra i linfociti sono molto abbondanti quelli di medie (Ø =8µm) e grandi dimensioni (Ø =12µm) (Fig. 1, A e B) essi, in molti esemplari, presentano piccoli granuli azzurrofili. Si trovano talvolta anche rari plasmociti. La conta eritroblastica eseguita sulle apposizioni di midollo osseo colorate con la perossidasi è un utile indice dell attività eritropoietica; essa ha evidenziato eritroblasti a vari stadi maturativi le cui percentuali sono riassunte in tabella 2: Specie N Eritroblasti basobili (%) Eritroblasti acidofili (%) Eritrociti maturi (%) Rana 7 4,2±0,002 9,26±0,003 86,5±0,18 italica Rana 11 3,4±0,009 27±0,1 69,6±0,11 esculenta Tab. 2: Conta eritroblastica Negli strisci di sangue colorati con perossidasi si indicano come eritroblasti basofili (Eb) elementi debolmente positivi alla perossidasi ma di forma sferica e con citoplasma blu intenso con M.G.G.; si indicano invece scome eritroblasti acidofili (Ea) quelli più intensamente positivi alla perossidasi dei precedenti e con citoplasma tendente al giallo-grigio con M.G.G. e, soprattutto, di forma ellissoidale o ovoidale ma più piccoli rispetto agli ertirociti maturi (Em). Rettili I risultati dell esame emocromocitometrico sono riassunti nelle tabelle 3A, 3B (1 e 2) e 3C rispettivamente per le specie di Podarcis muralis, sicula e Lacerta bilineata

8 156 CRISTINO ET AL distinte per sesso e mese di cattura. Sono riportati i valori medi calcolati sulla popolazione (distinta tra i due sessi) ± la media della deviazione standard (SDM). La formula leucocitaria non comprende i trombociti. Sesso Ht (%) Hb (g/dl) WBC TBC RBC n cellule/µl n cellule /µl n cellule /µl M (n=6) 23,0±1,0 8,9±0, ± ± ± F (n=7) 20,0±0,8 7,9±0, ± ± ± Tab. 3A: Podarcis muralis (maggio-giugno) Sesso Ht (%) Hb (g/dl) WBC TBC RBC n cellule/µl n cellule /µl n cellule /µl M (n=3) 32,3±2,1 9,3±1, ± ± ± F (n=3) 30,6±1,9 8,4±0, ± ± ± Tab. 3B1: Podarcis sicula (maggio-giugno) Sesso Ht (%) Hb (g/dl) WBC TBC RBC n cellule/µl n cellule /µl n cellule /µl F (n=5) 28,0±1,7 7,2±0, ± ± ± Tab. 3B2: Podarcis sicula (luglio) Sesso Ht (%) Hb (g/dl) WBC TBC RBC n cellule/µl n cellule /µl n cellule /µl M (n=5) 29,0±1,2 12,6±0, ± ± ± F (n=3) 26,0±1,3 11,6±0, ± ± ± Tab. 3C: Lacerta bilineata (maggio-giugno) Gli eritrociti maturi delle specie esaminate hanno sempre forma ellittica e sono nucleati; le dimensioni sono in media 13x7 µm (Fig. 2, A). La quantità di globuli rossi e, parallelamente, la concentrazione di emoglobina si riducono notevolmente in autunno-inverno, così come l ematocrito. Da strisci di sangue periferico colorati con M.G.G. si è osservato che una percentuale considerevole di esemplari Lacerta bilineata (62,5%), e in misura minore di

9 Le cellule sanguigne negli Anfibi e nei Rettili del Matese 157 Fig. 2: Microfotografie degli elementi corpuscolati di strisci di sangue periferico di Podarcis muralis colorati con M.G.G. In A un eritrocita maturo (EM), due linfociti (L), un granulocita eosinofilo rotto ed uno intero (Gr.E), tre trombociti (T); B: un eritrocita parassitato (Ep), un monocita (M) ed un granulocita neutrofilo (G.neu.). Scale bar in B=10 µm come in A Podarcis muralis (30%) e Podarcis sicula (18%) era infetta da parassiti intraeritrocitari. La conta del numero di emazie parassitate è stata eseguita su strisci colorati con M.G.G su1000 emazie per animale. La percentuale di emazie parassitate ammontava tra il 5-10% per ciascun esemplare. Diversi stadi morfologici di sviluppo del parassita sono stati riscontrati nello stesso animale; essi erano simili tra le varie specie parassitate facendo ragionevolmente pensare allo stesso genere di agente infettivo. Le emazie parassitate erano ipertrofiche rispetto al normale (Ø =18x12 µm rispetto ai 13x7 µm ) e ciascuna di esse presentava il materiale nucleare stipato, a forma di virgola, alla periferia del citoplasma cellulare che a sua volta appariva scarsamente acidofilo e ridotto ad un alone intorno alla struttura del parassita (Fig. 3, A-H). Una leggera anemia si riscontra costantemente negli strisci degli animali parassitati (Fig. 1, E). Nella formula leucocitaria i linfociti sono molto numerosi, dal 45 all 80% (Fig. 2, A); gli eterofili (neutrofili) ammontano al 15%, hanno il nucleo bi o trilobato, e si presentano con due aspetti: piccolo (Ø = 8µm) e grande (Ø = 16 µm). I basofili ammontano al 2% (Ø = 9 µm) e spesso risultano più piccoli negli strisci perché si distendono meno bene a causa dei loro grossi granuli blu scuro e metacromatici al M.G.G. I monociti rappresentano il 10-15% degli elementi circolanti (Ø = µm), con nucleo tondo e poco inciso, un ampio citoplasma lievemente basofilo con pochi fini granuli azzurrofili. I trombociti hanno forma allungata (7x5 µm) con nucleo anch esso allungato e citoplasma lievemente basofilo. La concentrazio-

10 158 CRISTINO ET AL ne degli eosinofili riscontrata nel sangue periferico degli esemplari di ciascuna delle tre specie non infettate è del 16-18% (Ø =14x12µm) e risulta significativamente più bassa rispetto a quella degli esemplari infettati della stessa specie (2830%); queste cellule appaiono spesso degranulanti e con pochi grossi granuli (Fig. 2, A e B). La conta eritroblastica degli esemplari non infetti (n=21) è stata eseguita sulle apposizioni di midollo osseo colorate con Lepehne; essa ha rivelato le percentuali dei vari stadi maturativi eritropoietici riassunti in tabella 4: Fig. 3: Microfotografie di eritrociti parassitati in strisci di sangue periferico di Lacerta bilineata colorati con M.G.G. Scale bar in Fig. H=10 µm come in A-G.

11 Le cellule sanguigne negli Anfibi e nei Rettili del Matese 159 Specie Numero esemplari Eritroblasti basofili Eritroblasti acidofili Eritrociti maturi (%) (%) (%) Podarcis n=9 1,5±0,0002 5,10±0, ,4±0,22 muralis (maggio/giugno) n=5 3,4±0,009 27±0,1 69,6±0,11 Podarcis (maggio/giugno) sicula n=4 2,9±0,005 20±0,08 77,1±0,13 (luglio) Lacerta n=3 6,25±0,003 7,35±0,002 82,45±0,52 bilineata (maggio) Tab. 4: Conta eritroblastica In generale dalle osservazioni sulle apposizioni di midollo colorate con Lepehne delle tre specie di lacertidi, si osservano numerosi eritroblasti in vario stadio maturativo, in particolare nella specie Podarcis sicula; sono abbondanti inoltre anche i mieloblasti, i promielociti e mielociti soprattutto della linea eosinofila (Fig. 4, A-D). La conta eritroblastica degli esemplari non infetti (n=21), eseguita sulle apposizioni di midollo emopoietico colorate con Lepehne, ha rivelato, rispetto agli animali sani, un aumento della percentuale delle forme eritroblastiche immature mentre l ematocrito non è significativamente diverso tra i due campioni (Tab. 5). GRUPPI INFETTATI NON INFETTATI Podarcis muralis n=4 n=9 Parametri ematologici irbc (percentuale) 23,5 ± 2,9 3,5 ± 0,002 Emoglobina (Hb=gr/dl) 8,5 ± 0,8 9,3 ± 0,9 Ematoctrito (Ht=%) 17 ± 2,5 20 ± 2,6 RBC (x10 3 / mm 3 ) 930,5 ± 87,9 902,9 ± 98,6 Podarcis sicula n=2 n=9 Parametri ematologici irbc (percentuale) 48,8 ± 2,7 30,4 ± 3,1 Emoglobina (Hb=gr/dl) 20 ± 2,1 22 ± 2,2 Ematoctrito (Ht=%) 21 ± 1,3 19,5 ± 1,9 RBC (x10 3 / mm 3 ) 120,0 ± 13,9 1343,3 ± 120,8 Lacerta bilineata n=5 n=3 Parametri ematologici irbc (percentuale) 37,4 ± 0,14 13,6 ± 0,11 Emoglobina (Hb=gr/dl) 11 ± 0,003 7,77 ± 0,05 Ematoctrito (Ht=%) 37,2 ± 0,12 28,3 ± 1,43 RBC (x10 3 / mm 3 ) 133,0 ±21,3 127,3 ± 20,7 Tab. 5. Confronto tra i parametri ematologici delle specie infettate e non infettate

12 160 CRISTINO ET AL Conclusioni Anfibi Le osservazioni ematologiche ed emopoietiche eseguite sulle specie Rana italica ed R. synklepton esculenta consentono di concludere, in accordo con quanto riportato in letteratura (cfr Rowley & Ratcliffe, 1988; Della Corte & D Ippolito, 1999) che l eritropoiesi si svolge nel midollo osseo in cui avvengono anche la granulocitopoiesi e la linfocitopoiesi. L emopoiesi risulta particolarmente attiva nel periodo esaminato (aprile, maggio) negli esemplari di entrambi i sessi. L esame emocromocitometrico fornisce valori concordi con quelli tipici delle varie specie con differenze scarsamente significative relative ad Ht, Hb ed RBC che risultano, nelle specie esaminate, leggermente superiori alla norma, molto probabilmente in relazione all altitudine cui è stato eseguito il loro campionamento. Rettili Le osservazioni ematologiche ed emopoietiche condotte sulle specie Podarcis sicula, P. muralis e Lacerta bilineata consentono di concludere, in accordo con quanto riportato in letteratura (cfr Rowley & Ratcliffe, 1988; Della Corte & D Ippolito, 1999) che l eritropiesi e la mielopoiesi si svolgono nel midollo osseo. In accordo a quanto osservato da Pica et al. (1986), su specie di Podarcis sicula della Campania, anche nelle analoghe specie del Matese e, più in generale in tutte le tre classi di Rettili esaminate, l emoglobina è al suo livello massimo nel periodo di aprile-maggio e resta più o meno tale per tutta l estate. Contrariamente ai dati bibliografici in merito (Della Corte & D Ippolito, 1999), negli esemplari esaminati la concentrazione degli eosinofili riscontrata sia nel sangue periferico che nelle apposizioni di midollo osseo di ciascuna delle tre specie esaminate è significativamente più alta rispetto ai valori riferiti in queste specie (dati osservati: 28-30% di granulociti eosinofili rispetto al 17% da noi osservato e confermato della letteratura riferita al medesimo periodo stagionale, indipendentemente dal sesso). Questi dati, insieme alla leggera anemia riscontrata in queste specie, sono ragionevolmente riconducibili alla presenza di un processo infettivo in atto, registrato a carico di un consistente numero di esemplari delle tre specie i Rettili ed in particolare di Podarcis muralis. Le ossevazioni morfologiche su strisci di sangue periferico colorati con M.G.G confermano i sospetti di un processo infettivo in corso dovuto ad un protozoo, che microscopicamente si riscontra all interno del citoplasma del 5-10% delle emazie di circa un terzo del campione di lacertidi esaminato (35% ). In accordo con i dati presenti in letteratura (cfr Ricci, 1954; Ayala, 1977) è possibile concludere che infezioni da parassiti appartenenti ai taxa degli emoprotozoi

13 Le cellule sanguigne negli Anfibi e nei Rettili del Matese 161 Fig. 4: Microfotografie degli elementi corpuscolati di apposizioni di midollo emopoietico di i Lacerta bilineata colorati con M.G.G. In A: abbondanza di elementi mieloidi a vari stadi maturativi: si notino un Promielocita (Prom.) ed un mielocita (Miel.). In B-C: elementi mieloidi ed eritroblasti; in D vari Eritroblasti basofili (Eb). Scale bar in D=10 µm come in A-C.

14 162 CRISTINO ET AL come Haemoproteus o Plasmodium sono frequenti tra i lacertidi in cui sono considerate generalmente benigne ed accompagnate solo a leggere anemie ed eosinofilie; inoltre la riduzione dell apporto di ossigeno ai tessuti potrebbe provocare alterazioni della fisiologia e del comportamento dell animale soprattutto in merito ad una riduzione della velocità di scatto nella corsa, sovente riscontrata (Levine & Campbell, 1971; Bennett & Putnam, 1982). La distribuzione del parassita nell ecosistema da noi esaminato prescinde dalla stagione e dal sesso dell animale ed è sostanzialmente simile sia nei periodi primaverili che estivi come verificato dal fatto che specie catturate nelle due stagioni, di entrambi i sessi, non mostrano differenze nell entità dell infezione. Ringraziamenti Lavoro finanziato dalla Regione Campania. Esemplari catturati con autorizzazione del 1/06/2000 n. SCN/2D/2000/9213 del Ministero dell Ambiente. Riassunto La valutazione dei parametri ematologici su sangue circolante e lo studio della composizione cellulare ematica nel sangue circolante e negli organi emopoietici eseguita sulle specie di Vertebrati ectotermi reperite nella zona del Matese ha fornito uno strumento di valutazione dello stato di salute degli esemplari di questo habitat. L esame emocromocitometrico ha fornito valori lievemente superiori a quelli normali degli Anfibi, molto probabilmente in relazione all altitudine alla quale sono state campionate le specie. Nelle specie di Rettili esaminate è stata riscontrata eosinofilia sia nel sangue periferico che nel tessuto emopoietico e lieve diminuzione del numero di globuli rossi, ascrivibili alla infezione da protozoo del tipo Emoproteus osservato in sede intraeritrocitaria in tutte le specie di Rettili studiate. Bibliografia Ayala S. C., Haematological Protozoa. In: Kreier J.P. (ed), Parasitic Protozoa, Academic Press, New York. Bennet A. F., Putnam R. W., Lizards infected with Malaria: Physiological and Behavioral consequences. Science, 217: Della Corte F., D Ippolito S., Fondamenti di ematologia umana e comparata. Ed. Liguori, Napoli. Levin N. D., Campbell G. R., A check-list of the species of genus Haemoproteus (Apia, Plasmodiidae). J. Protozool., 18: Pica A., Grimaldi M. C., Della Corte F., D Ippolito S., The blood cells of the common lizard (Podarcis s. sicula Raf.): morphocytochemistry, DNA amount of red cells and hemopoiesis. Ital. J. Anat. Embr., 91: Ricci M., Biogeografia di Zannone. Emoparasiti di Lacerta sicula patrizii. Rend. Ist. Sup. Sanità, 17 : Rowley A. F., Ratcliffe N. A., Vertebrate blood cells. Cambridge University Press. Undritz K., Tavole Ematologiche Sandoz. Ed. Sandoz S.A., Basilea.