De Leo - Fasano - Ginelli Biologia e Genetica, II Ed. Capitolo 4

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1 LA TRASCRIZIONE

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4 La velocità della reazione è di ~40 nt/sec a 37 C (per la RNA pol batterica); molto più lenta di quella di replicazione del DNA (800 bp/sec) De Leo - Fasano - Ginelli Biologia e Genetica, II Ed. Capitolo 4

5 Nomenclatura la coding strand (Sense strand) del DNA ha la stessa sequenza del mrna la antisense strand (Template strand) è quella che funge da template per la sintesi del mrna. RNA polymerases sono enzimi che sintetizzano RNA usando DNA come template. Un promoter è una regione di DNA dove la RNA polimerasi si lega per iniziare la trascrizione. Startpoint (Startsite) si riferisce alla posizione sul DNA che corrisponde alla prima base incorporata nel RNA A terminator è una sequenza di DNA fa terminare la trascrizione alla RNA polymerase. A transcription unit è la distanza tra i siti di iniziazione e di terminazione della RNA polymerase; può includere più di un gene. Upstream = a monte. Downstream = a valle. A primary transcript è il prodotto di RNA non modificato che corrisponde ad una unità di trascrizione.

6 Trascrizione La trascrizione produce un filamento di RNA complementare ad un filamento di DNA Esistono vari tipi di RNA

7 la sequenza codificante del DNA è uguale a quella del messaggero

8 Promotore De Leo - Fasano - Ginelli Biologia batterico e Genetica, II Ed. Capitolo I 4 Un promotore è definito dalla presenza di una corta sequenza consenso in una localizzazione specifica. La sequenza consenso del promotore consiste in una purina al punto di inizio, l esamero TATAAT a 10, ed un altro esamero a 35. I diversi promotori di solito differiscono dal consenso in una o più posizioni. Un promotore è una sequenza particolare di DNA che è riconosciuta dalla RNA polimerasi. Ogni promotore deve includere questa sequenza e nel genoma batterico la sequenza minima che da un segnale adeguato è di 12 bp. Consenso e spaziatura

9 Promotore batterico II Un putativo sito di riconoscimento del DNA può essere definito come una sequenza ideale che rappresenta la basi più spesso trovate in ogni posizione. Una sequenza consenso è definita dall allineamento di tutti gli esempi noti così da massimizzare la loro omologia. Ci sono quattro caratteristiche conservate in un promotore batterico: Il punto di inizio (startpoint) La sequenza 10; La sequenza 35; La distanza tra le sequenze 10 e 35; L elemento UP (qualche volta)

10 promotore: sequenza De Leo - Fasano - presente Ginelli Biologia a e monte Genetica, II di Ed. tutti Capitolo i geni, 4 riconosciuta dal fattore sigma dell RNA polimerasi, necessaria per l inizio della trascrizione. La sequenza è conservata promotori riconosciuti dal fattore sigma-70 di E. coli

11 TTGACa TAtAaT lettera maiuscola = basi più conservate (presenti in quella posizione rispetto al +1 in quasi tutti i casi lettera minuscola = basi presenti in molti casi ma non sempre mutazioni down : diminuisce l efficienza del promotore

12 Startpoint Lo startpoint è di solito (>90% delle volte) una purina. Spesso è la base centrale della sequenza CAT.

13 La sequenza -10 la regione di 6 bp è riconoscibile in quasi tutti i promotori. Il centro dell esamero è generalmente circa 10 bp a monte dello startpoint, ma la distanza varia da -18 a -9. L esamero è spesso chiamato la sequenza -10 sequence. Il consenso è TATAAT, e può essere indicato nella forma T 80 A 95 T 45 A 60 A 50 T 96 dove il pedice indica la percentuale dell occorrenza della base più comune, che varia 45-96%. (dove non c è evidente preferenza si usa una N). La basi più importanti sembrano essere le più conservate: la TA iniziale e la T finale.

14 La sequenza -35 Un altro esamero conservato è centrato ~35 bp a monte dello startpoint. È chiamata la sequenza -35. Il consenso è TTGACA; in forma più dettagliata T 82 T 84 G 78 A 65 C 54 A 45

15 Distanza 10 / -35 La distanza che separa i siti 35 e 10 è tra bp nel 90% dei promotori; ma può essere fino a 15 o 20 bp. La sequenza nella regione non è importante, ma la distanza è critica per tenere i due siti nella geometria corretta per il legame al promotore.

16 Elemento UP Alcuni promotori hanno una sequenza ricca di A-T localizzata ancora più a monte. E denominata elemento UP. Interagisce con la subunità della RNA polimerasi. La si trova tipicamente nei promotori che sono molto espressi, quali quelli dei geni per rrna. E riconosciuto dal dominio C- terminale della subunità alfa ( CTD)

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19 regolazione dell espressione genica mediante l intervento di fattori sigma alternativi geni heat-shock : CCCCCC - 15/17 basi - CCCC promotore riconosciuto dal fattore sigma32 attivato solo in caso di aumento della temperatura. I geni che hanno questo promotore vengono espressi (trascritti) SOLO IN PRESENZA DI QUESTO SPECIFICO FATTORE SIGMA geni spo in B. subtilis sono silenti e vengono trascritti solo durante la sporulazione per la presenza di fattori sigma specificamente attivati in sporulazione

20 De Leo - Fasano - Ginelli Biologia e Genetica, II Ed. Capitolo 4 La RNA polimerasi batterica è fatta da subunità multiple L oloenzyme (enzima completo) è un complesso di 5 subunità che comprende il core enzyme ( 2 e il factor che è competente per l inizio della trascrizione batterica. RNA core polimerasi batteriche sono ~500 kd complessi multisubunità con la struttura generale 2. Negli eubatteri un solo tipo di RNA polimerasi è responsabile della sintesi di tutti i RNA (mrna, rrna e trna)

21 RNA polimerasi batterica Le subunità and insieme fanno il centro catalitico. La subunità è necessaria per assemblaggio del core enzyme. La subunità è interessata specificamente con il riconoscimento del promotore Mg =blue = viola = giallo e verde

22 De Leo - Fasano - Ginelli regolazione Biologia e Genetica, II dell espressione Ed. Capitolo 4 genica mediante l intervento di fattori sigma alternativi geni heat-shock : CCCCCC - 15/17 basi - CCCC promotore riconosciuto dal fattore sigma32 attivato solo in caso di aumento della temperatura. I geni che hanno questo promotore vengono espressi (trascritti) SOLO IN PRESENZA DI QUESTO SPECIFICO FATTORE SIGMA geni spo in B. subtilis sono silenti e vengono trascritti solo durante la sporulazione per la presenza di fattori sigma specificamente attivati in sporulazione

23 De Leo - Fasano Fattori - Ginelli Biologia sigma e Genetica, II Ed. Capitolo 4 E. coli ha diversi sigma factors, ognuno dei quali fa sì che la RNA polimerasi inizi a dei promotori definiti da specifiche sequenze 35 e 10. I promotori per ogni enzima hanno tutti la stessa dimensione e localizzazione relativa allo startpoint, ed hanno sequenze conservate solo intorno ai siti 35 e 10.

24 Legame al DNA Il DNA binding domain del fattore sigma è helix-turn-helix che riconosce il sito 35 Il sito 10 è riconosciuto dalla subunità alfa. Ha amino acidi aromatici che aiutano l apertura del DNA La forza di un promotore è collegata alla affinità di legame ed alla capacità di evadere dal promotore

25 La RNA pol La distanza tra i siti

26 La trascrizione avviene con l appaiamento di basi in una bolla" di DNA RNA pol separa i due filamenti di DNA in una bolla transient ed usa un filamento come template per la sintesi di una sequenza di RNA complementare. La bolla è lunga ~12-14 bp, e la lunghezza dell ibrido RNA-DNA è di ~8-9 bp. La velocità della reazione è di ~40 nt/sec a 37 C (per la RNA pol batterica); che è simile alla velocità di traduzione (15 amino acidi/sec), ma molto più lenta di quella di replicazione del DNA (800 bp/sec)

27 La reazione De Leo - Fasano di - Ginelli trascrizione Biologia e Genetica, II Ed. Capitolo 4 ha tre passaggi Iniziazione descrive il passaggio fino alla sintesi del primo legame del RNA. Include il legame della RNA polimerasi al promotore ed il melting di una corta regione di DNA in singolo filamento. Elongazione è il passaggio nella reazione di sintesi della macromolecola (per la replicazione, trascrizione, o traduzione) quando la catena nucleotidica o peptidica si allunga per l aggiunta della subunità. Terminazione è il passaggio che termina la sintesi della macromolecola bloccando l addizione delle subunità, e generalmente causando la dissoluzione dell apparato di sintesi

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29 Tensione De Leo - Fasano - Ginelli superelica- Biologia e Genetica, II Ed. DNA Capitolo 4 supercoiling

30 La De Leo -terminazione Fasano - Ginelli Biologia e Genetica, II Ed. nei Capitolo batteri 4 La terminazione è sempre letta sulla sequenza di DNA trascritta, non su DNA Ci sono due tipi di terminatori: Rho-indipendenti: una sequenza invertita (palindromica) di 20 nt seguita da circa 8 nt A-T Rho-dipendenti: reclutano la proteina rho, una ATPasi ad anello che separa il RNA dallo stampo. Circa 40 nt ricchi di C.

31 Terminatore forte o rhoindipendente: -struttura secondaria stabile e forte per la presenza di molte G e C nello stem - sequenza di tante U al 3 della struttura secondaria (che facilita la separazione dell ibrido DNA/RNA) Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare Piccin Nuova Libraria S.p.A.

32 De Leo Rho-indipendenti - Fasano - Ginelli Biologia e Genetica, II Ed. Capitolo 4 La responsabilità della terminazione sta nella sequenza già trascritta dalla RNA polimerasi I terminatori rhoindipendenti richiedono la formazione di una forcina nella struttura secondaria seguita da una sequenza di A (>8)

33 Rho factor Il fattore Rho è una proteina terminatore che si lega al RNA nascente si muove fino a una sequenza che è ricca in C e povera di G che precede il sito di terminazione. È ~275 kd esamero di Rho subunità identiche, della famiglia delle elicasi ATPdipendenti che funzionano passando l acido nucleico nel foro dell esamero. I terminatori Rho-dipendenti sono la metà dei terminatori di E. coli.

34 Terminatore debole o rho-dipendente

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37 Le RNA polimerasi eucariotiche sono composte da piu di 10 subunità

38 Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare Piccin Nuova Libraria S.p.A.

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42 TATA BOX BINDING PROTEIN TBP Saddle-like domain TATA BOX DNA BINDING

43 TAF5 stabilizes TAFs interaction, specially histonelike ones (TAF6, TAF9) TAF1: Acetyl transferase activity Interaction with TFIIF TAF6 TAF11 TAF4 TAF12 TAF9 TAF13 TAF3 TAF12 TAF8 TAF4 TAF10 TBP TAF7 TAF5 TAF5 TAF11 TAF8 TAF3 TATA BOX TAF13 TAF6 TAF9TAF10

44 DNA BENDING

45 TFIID

46 HETEROTRIMER (A, B, C SUBUNITS) BINDS PROMOTER REGION WITH TFIID De Leo - Fasano - Ginelli Biologia e Genetica, II Ed. Capitolo 4 TFIIA DAB TFIID TFIIB TWO DOMAIN: N-TERMINAL Zn-RIBBON AND TFIIF CORE DOMAIN HETEROTETRAMER (RAP30) 2 (RAP74) 2 (RAP30) 2 BINDS RNA POL II AND TFIIB. RAP74 INTERACTS WITH DNA. TFIIF STABILIZES THE INTERACTION OF RNA POLII WITH PROMOTER AND STIMULATES ELONGATION RATE TFIIE TFIIH TFIIB INTERACTS WITH SADDLE-LIKE DOMAIN OF TBP AND WITH BENDED DNA ON SIDES OF TATA BOX. TBP/TFIIB COMPLEX RECRUITS RNA POLII AND OTHER GTF P TFIIE MODULATES THE HELICASE AND KINASE ACTIVITIESOF TFIIH BY STIMULATING CTD DOMAIN RNA POLII PHOSPHORYLATION TFIIH STIMULATES PROMOTER MELTING AND PHOSPHORYLATION IT OF RNA HAS KINASE POLII CTD STIMULATES ACTIVITY AGAINST PROMOTER MELTING AND RNA POL II TRANSCRIPTION START

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58 The carboxy-terminal domain (CTD) of the De Leo - Fasano - Ginelli Biologia e Genetica, II Ed. Capitolo 4 polymerase comprises repeats of a seven-aminoacid motif and undergoes reversible modification by phosphorylation. In particular, phosphorylation of a serine amino acid at position 2 in each repeat increases as the polymerase moves along the mrna. b, Kim et al. have found that the Rtt103 protein binds a CTD peptide carrying the serine 2 phosphorylation, and also associates with the exonuclease Rat1 (Xrn2 in humans) and its cofactor Rai1. Thus, Rat1 may be recruited to the nascent mrna via Rtt103 bound to the polymerase CTD, and by an independent system that involves Rai1. Following cleavage of the poly(a) site, Rat1 binds and eats away at the free end of the RNA, halting transcription when it catches the polymerase (c).

59 The newly synthesized human -globin mrna will be cut at two positions: at the normal site of poly(a) addition and within the co-transcriptional cleavage (CoTC) site, showed to be self-cleaving. This allows the entry of Xrn2 (the human Rat1 counterpart), which again eats away at the mrna until it catches up with the RNA polymerase.

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64 Cappuccio Funzioni: protezione al 5 ; esportazione; traduzione De Leo - Fasano - Ginelli Biologia e Genetica, II Ed. Capitolo 4 Aggiunta di guanina al 1 nt trascritto dopo la trascrizione di nt.; legame 5-5 trifosfato Metil transferasi aggunge CH 3 al 7 di G; anche i primi 2 nt sono metilati Struttura del cappuccio

65 I cleavage factors (CF) e i cleavage and polyadenilation factors (CPF) consentono alla poli(a) polimerasi (PAP) di riconoscere il sito di taglio. La PAP aggiunge solo una decina di A. Questa corta coda viene riconosciuta dalla polya binding protein (PABII) che la allunga fino ad arrivare a 200 A.

67 Splicing Rimozione di un introne attraverso due reazioni sequenziali di trasferimento di fosfato, note come transesterificazioni. Queste uniscono due esoni rimuovendo l introne come un cappio

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77 Trasporto dell mrna dal nucleo al citoplasma Complesso di carico: Proteina cargo, Ran+GTP, Esportina1, Procarioti trascrizione e traduzione avvengono contemporaneamente nel citoplasma NLS Eucarioti NES Ran+GD P Ran+GT P

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79 Structure of eukaryotic mrna 5 Cap 7mGppp 5 untranslated region initiation AUG translated region 3 untranslated region UGA termination polyadenylation signal AAUAAA (A) ~200 poly(a) tail 3 all mrnas have a 5 cap and all mrnas (with the exception of the histone mrnas) contain a poly(a) tail the 5 cap and 3 poly(a) tail prevent mrna degradation loss of the cap and poly(a) tail results in mrna degradation

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82 Gli snrna creano assieme alla coilina uno scaffold proteico (corpi di Cajal). Questi RNA vengono da introni di mrna (non codificanti per proteine; e.g., UHG). Si legano nel nucleolo alla fibrillarina. Hanno regioni complementari agli rrna 18s e 28s.

83 La modificazione dell uracile in pseudouracile è ad opera della Ψ-sintasi

84 De Leo Modificazioni - Fasano - Ginelli post-trascrizionali Biologia e Genetica, II Ed. trna Capitolo 4 3 CCA trascritto in E.C. Nei trna precursori vengono eliminati gli spaziatori, delle sequenze al 5 e 3, ed in alcune specie, un introne (splicing canonico). Modificazione delle basi: ipoxantina, pseudouracile Aggiunta al 3 della sequenza CCA, comune a tutti i trna, grazie all azione dell enzima trna nucleotidil transferasi

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