LE MOLECOLE DI RNA: rrna trna mrna

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1 LE MOLECOLE DI RNA: rrna trna mrna

2 RNA polimerasi Localizzazione Prodotti Effetti dell α-amanitina I Nucleolo 25S, 17S e 5.8S rrna Nessuno II Nucleoplasma mrna, U1, U2, U4 e U5 Fortemente inibitori III classe 1 Nucleoplasma 5S rrna Inibitori ad alte concentrazioni III classe 2 Nucleoplasma trna Inibitori ad alte concentrazioni III classe 3 nucleoplasma U3, U6 e altri piccoli RNA Inibitori ad alte concentrazioni

3 Le molecole di RNA vengono chiamate in base al loro coefficiente di sedimentazione in unità Svedberg (1S = secondi) L mrna costituisce solo l 1-2% dell RNA totale di una cellula e non può essere frazionato su gradiente di saccarosio

4 La maggior parte dell RNA cellulare è rappresentato dall rrna Citoplasma Plastidio Large subunit 5S 5.8S 28S 23S 4.5S 5S Small subunit 18S 16S RNA ribosomiali (rrna)

5 trna Phe plastidiale Loop D Loop TψC I mitocondri vegetali importano alcuni trna dal citoplasma Il plastoma codifica per circa 30 trna, non necessita di importare trna citoplasmatici RNA transfer (trna)

6 In accordo con la loro origine endosimbiontica i trna plastidiali hanno caratteristiche tipiche dei procarioti, che li distinguono dai trna citoplasmatici RNA transfer (trna)

7 Le modificazioni covalenti che avvengono al 5 e al 3 dell mrna fungono da segnali che nel citoplasma indicano che il messaggero deve essere tradotto in proteina 1. Cap al 5 (7-metilguanosina) 2. Regione non tradotta al 5 3. Regione codificante 4. Regione non tradotta al 3 5. Coda di poli(a) al 3 RNA messaggeri (mrna)

8 RNA messaggeri (mrna) CAP al 5

9 (UAG, UAA o UGA) Non sempre presente (Open Reading Frame -ORF) Aggiunta nel nucleo da un complesso enzimatico che riconosce la sequenza 5 -AAUAAA-3 presente 1. Cap al 5 nel pre-mrna 2. Regione non tradotta al 5 3. Regione codificante 4. Regione non tradotta al 3 5. Coda di poli(a) al 3 (da 20 a 250 residui di adenosina) RNA messaggeri (mrna)

10 Gli mrna degli organelli sono privi sia del cap al 5 sia della coda di poli(a) al 3 e presentano un gruppo trifosfato (nei mitocondri) o monofosfato (nei plastidi) al 5 a) mrna plastidiale o mitocondriale Struttura secondaria a stelo-anello con funzione regolativa e di stabilizzazione b) mrna citoplasmaico RNA messaggeri (mrna)

11 IL PROCESSAMENTO DELL RNA: LO SPLICING

12 Caratteristiche strutturale Tipo di introne Lunghezza (nucleotidi) Sito di splicing Pre mrna nucleare >70 G GU...AG N mrna nucleari Pre-tRNA nucleare Non conservato trna nucleari Introni plastidiali e mitocondriali del gruppo I >200 U N...G N rrna e mrna plastidiali Introni plastidiali e mitocondriali del gruppo II <200 a >400 N GYGCG...AY N rrna e mrna plastidiali N: nucleotide; Y: pirimidina (U, C)

13 Branch site: UACUAAC Gli introni dei pre-mrna vegetali sono di lunghezza estremamente variabile (da 70 nt sino ad oltre le 7 kb lunghezza media nt). Sono ricchi di adenosina e uridina (nelle dicotiledoni il contenuto di A e U negli introni è di circa il 70% maggiore rispetto alla media, nelle monocotiledoni di circa il 60%) Spliciosoma: grosso complesso ribonucleoproteico contenente snrna che si assembla sul pre-mrna Lo splicing si verifica attraverso due attacchi nucleofili successi, entrambi guidati da gruppi idrossilici. Il primo attacco nucleofilo avviene tra il gruppo OH della A del branch site e il legame fosfodiestere esistente tra l esone 1 e l estremità 5 dell introne che deve essere rimosso. In seguito a questo primo attacco nucleofilo si forma una struttura ad ansa dovuta all insorgenza di un legame fosfodiestere tra la A e la G. Segue un secondo attacco nucleofilo tra il gruppo OH dell esone 1 e l inizio dell esone 2, con formazione di un legame fosfodiestre tra l esone 1 e l esone 2.

14 gruppo fosfato ciclico linearizzazione del gruppo fosfato ciclico fosforilazione del gruppo OH al 5 l RNA ligasi lega le due estremità Gli introni dei pre-trna vegetali sono corti e non sempre presenti (da 11 a 30nt) rimozione di un gruppo fosfato

15 Gli introni del gruppo I si trovano nei lieviti, nei funghi, negli rrna di certi eucarioti unicellulari e nei geni degli organelli vegetali Sono noti come RIBOZIMI Gli introni del gruppo II si trovano nei mitocondri dei funghi e nei geni degli organelli vegetali Nelle piante gli introni del gruppo II non fanno autosplicing, suggerendo la necessità di proteine, pur non essendoci uno splisosoma

16 NON SEMPRE GLI SPLICING AVVENGONO TRA ESONI PRESENTI SU UN UNICO pre-mrna: GLI EVENTI DI TRANS SPLICING

17 L EDITING DELL RNA

18 L editing dell RNA altera l ORF di alcuni mrna mitocondriali e plastidiali L editing dell RNA può avvenire per: 1. inserzione o delezione di nucleotidi..

19 2. modificazione o sostituzione di nucleotidi

20 LE RNA POLIMERASI

21 A differenza delle RNA polimerasi batteriche che possono legarsi ai promotori e dare inizio alla trascrizione in assenza di altre proteine, le RNA polimerasi eucariote devono interagire con specifiche proteine, chiamate FATTORI DI TRASCRIZIONE, per dare inizio alla trascrizione del DNA

22 Nei procarioti l RNA è prodotto da un unico tipo di RNA polimerasi Negli eucarioti il nucleo contiene tre tipi di RNA polimerasi Una T7 RNA polimerasi (blu) mentre produce una molecola di mrna (verde) a partire da uno stampo di DNA (arancione). RNA polimerasi II di lievito

23 I nuclei delle cellule eucariote contengono 3 classi di RNA polimerasi DNA-dipendenti, che si legano e iniziano la trascrizione in siti specifici del cromosoma, i PROMOTORI RNA polimerasi Localizzazione Prodotti Effetti dell α-amanitina I Nucleolo 25S, 17S e 5.8S rrna Nessuno II Nucleoplasma mrna, U1, U2, U4 e U5 Fortemente inibitori III classe 1 Nucleoplasma 5S rrna Inibitori ad alte concentrazioni III classe 2 Nucleoplasma trna Inibitori ad alte concentrazioni III classe 3 Nucleoplasma U3, U6 e altri piccoli RNA Inibitori ad alte concentrazioni Le RNA polimerasi eucarite contengono da 8 a 14 subunità (due subunità grandi una da 125 kda e l altra da 220 kda - e meno di una decina di subunità piccole). Complessivamente presentano una massa molecolare totale compresa tra i 500 e i 700 kda

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25 Unità trascrizionale della RNA polimerasi di tipo I Le unità trascrizionali di tipo I si trovano nei nucleoli dove sono presenti di centinaia di copie organizzat in tandem RNA pol I

26 RNA polimerasi I: complesso proteico costituito da 13 subunità, insensibile all α-amanitina La regione promotore CORE è localizzata tra -31 e +6 rispetto al punto d inizio della trascrizione. La sequenza UCE (Upstream Control Element) localizzata tra -187 e -107 è anch essa indispensabile per un efficiente trascrizione. CORE e UCE sono molto simili tra loro (85% d identità) e a differenza degli altri elementi regolativi sono molto ricchi in CG UCE CORE RNA pol I

27 UBF1: singola catena polipeptidica che riconosce le sequenze ricche in GC presenti nell elemento regolativo UCE e nel promotore CORE UBF1 funge da assemblatore. SL1 si lega a UBF1. SL1 è formato da quattro proteine, una delle quali è una TATAbox binding protein (TBP). Le TBP sono necessarie per l assemblaggio di tutte e tre le classi di complessi trascrizionali eucariti. SL1 è un fattore posizionale, cioè garantisce il corretto posizionamento della RNAPI al promotore, in modo da garantire il corretto inizio della trascrizione. Una volta formato il complesso UBF1/SL1, RNAP I si lega alla sequenza promotore CORE per iniziare la trascrizione. RNA pol I

28 Tutti i geni che sono trascritti ed espressi via mrna vengono trascritti dalla RNAPII. Sino a poco tempo fa si riteneva che la trascrizione avvenisse attraverso steps discreti: trascrizione, capping, tailing, splicing ed esporto dal nucleo al citoplasma per la traduzione. RNA pol II

29 RNA pol II Una visione recente suggerisce invece che molti dei fattori proteici richiesti per ognuno dei singoli step trascrizionali, interagiscano gli uni con gli altri. Questo permetterebbe alla cellula di coordinare e regolare il processo trascrizionale in modo più efficiente.

30 RNA polimerasi II: complesso multienzimatico (12 subunità in lievito), estremamente sensibile all α-amanitina (K=10-8 M). La subunità maggiore della RNAPII contiene il sito catalitico. RNAPII può utilizzare come stampo tanto molecole di dsdna quanto molecole di ssdna. L RNAPII non è in grado di iniziare da sola la trascrizione (non lega il promotore). I promotori della RNA polimerasi II presentano una struttura differente a seconda della particolare combinazione dei fattori di trascrizione che sono richiesti per costruire un complesso trascrizionalmente funzionate. Ad ogni modo queste diverse strutture possono essere viste come una combinazione di un numero relativamente limitato di specifiche sequenze. RNA pol II

31 Elementi dei promotori di classe II TATA box: localizzata a circa -25. Sequenza consenso: TATAAAA. La TATA box è più importante per determinare il corretto punto d inizio della trascrizione che come vero e proprio promotore. GC box: elemento comune in quasi tutti i promotori eucariti di classi II. Sequenza consenso: GGGCGG. Può essere presente in una o più copie normalmente localizzate tra -40 e Le GC box vengono legate dal fattore di trascrizione Sp1. CAAT box: sequenza consenso: CCAAT normalmente localizzata tra -40 e Le CAAT box vengono legate dai fattori di trascrizione CTF o NF1. RNA pol II

32 Oltre agli elementi regolativi come la TATA box, la GC box e la CAAT box, per l espressione di un gene possono essere richiesti anche gli elementi ENHANCERS. Questi elementi non fanno parte del vero e proprio promotore e possono essere localizzati tanto a valle quanto a monte del promotore, nonché essere funzionanti in entrambe le orientazioni. RNA pol II

33 Assemblaggio del complesso trascrizionale 1. TFIID riconosce e lega la TATA box. TFIID è formato da una TBP e da circa dieci TBP associated factors (TAFs). La TBP è una proteina di circa 180 aa in cui si riconoscono due domini di 66 aa molto simili tra loro separati da una breve regione formata da aa basici. Le TBP si associano al DNA nel solco minore determinando un ripiegamento del DNA di 80. TFIID è un fattore posizionale che determina il corretto legame della RNAPII al promotore. Nelle unità trascrizionali di classe II la TBP si lega direttamente al DNA 2. TFIIA si lega e stabilizza il legame TFIID 3. Assemblaggio (presumibilmente a step) della RNAPII per formare un complesso di preiniziazione. L oloenzima è formato dal complesso della RNAPII, da complessi regolatori e dai seguenti fattori di trascrizione: TFIIB (singola catena polipeptidica che si può legare tanto a valle quanto a monte della TATA box). TFIIB determina il reclutamento di TFIIF-RNAPII al complesso; TFIIE: formato da due subunità, determina il reclutamento di TFIIH; TFIIF: formato da due subunità di cui una ad attività elicasica presumibilmente coinvolta nel melting del DNA per permettere l esposizione del filamento di DNA stampo; TFIIH: formato da 9 subunità una delle quali ha attività chinasica ed è necessaria per la fosforilazione del CTD della RNAPII e quindi della clearence del promotore, e due subunità ad attività elicasica. TFIIH interviene anche nella NER (Nucleotide Excision Repair) Probabile ordine di assemblaggio: TFIID -> TFIIA -> TFIIB -> (TFIIF + RNAP II) -> TFIIE -> TFIIH RNA pol II

34 Prima che la trascrizione inizi, il CTD della RNAPII è non fosforilato e associato con i componenti del complesso di iniziazione La parziale fosforilazione del CTD durante l inizio della trascrizione determina il reclutamento degli enzimi responsabili del cap al 5 della catena di RNA nascente L ulteriore fosforilazione del CTD dopo l allontanamento dell RNAPII dal promotore determina il reclutamento del macchinario per lo splicing del pre-mrna L RNAPII raggiunge i segnali di fine della trascrizione e i fattori necessari per il taglio e la poliadenilazione al 3 si associano al CTD, quindi riconoscono specifiche sequenze sull RNA RNA pol II

35 52x(YSPTSPS) RNA pol II

36 RNAPIII: responsabili della trascrizione delle piccole molecole di RNA (es: trna, RNA 5S) Le RNAPIII sono le più grandi RNA pol note, formate in genere da 17 subunità con una MW maggiore di 700kDa. Sono moderatamente sensibili all α-amanitina. I promotori delle RNAPIII si distinguono dagli altri perché in alcuni casi si possono trovare all interno del gene che trascrivono Assemblaggio del complesso trascrizionale: la trascrizione del gene per il 5S RNA richiede tre TF, la trascrizione dei geni per i trna richiedono due TF. TFIIIA: necessario solo per la trascrizione dei geni per il 5S RNA. Singola catena polipeptidica con un motivo a Zn-finger. Agisce da proteina assemblatrice. TFIIIC: formato da 6 subunità. TFIIIC è una proteina assemblatrice necessaria per tutti i promotori di classe III. TFIIIB: formato da 3 subunità, una delle quali agisce da TBP. TFIIIB agisce da fattore posizionale. RNA pol III

37 L ESPRESSIONE GENICA: Elementi cis Elementi trans

38 Le cellule di che compongono un organismo contengono tutte il medesimo patrimonio genetico. Le differenze esistenti tra le cellule sono da ascriversi alla differente espressione del medesimo set di geni.

39 Negli anni 50 Miller e Skoog riuscirono a rigenerare una pianta intera a partire da cellule isolate di radici

40 Table 2.2 Composition of a typical plant culture medium. The medium described here is that of Murashige and Skoog (MS) Macroelementsb Concentration in Concentration stock solution (mg/l) in medium (mg/l) NH 4 NO KNO CaCl 2.2H 2 O MgSO 4.7H 2 O KH 2 PO Microelementsc KI H 3 BO MnSO 4.4H 2 O ZnSO 4.7H 2 O Na 2 MoO 4.2H 2 O CuSO 4.5H 2 O CoCl 2.6H 2 O Iron sourcec FeSO 4.7H 2 O Na 2 EDTA.2H 2 O Organic supplementc Myoinositol Nicotinic acid Pyridoxine-HCl Thiamine-HCl Glycine Carbon sourced Sucrose Added as solid

41 L espressione genica è regolata sia dallo stadio di sviluppo sia da segnali ambientali Gombert, J. et al. J. Exp. Bot :

42 ELEMENTI CIS: sequenze regolatrici di DNA presenti sulla stessa catena di DNA su cui si trova il gene che regolano. Gli elementi cis rappresentano i siti di legame dei fattori di trascrizione La TATA box è di norma localizzata a -25 nt dal sito di inizio del gene Le TATA box sono responsabili del posizionamento corretto dell RNA polimerasi II e dell efficiente trascrizione del gene. TATA box mutate possono, infatti, ancora legare l RNA polimerasi II ma la trascrizione del gene avviene in modo non efficiente

43 Elemento cis accessorio G-box G-box Elemento cis accessorio Elemento cis accessorio G-box Elemento cis accessorio G-box Elemento cis accessorio ABRE element Quando regolano geni aventi funzioni correlate, le sequenze degli elementi cis sono spesso simili. Le G-box sono caratteristiche dei geni la cui espressione è indotta dall ambiente. Mutazioni a carico della G-box compromettono la capacità del promotore di rispondere agli stimoli appropriati. Per una corretta espressione del gene oltre alle G-box è spesso necessaria la presenza di un secondo elemento cis

44 Le sequenze enhancer possono essere lunghe centinaia di basi e possono essere formate da cassette ripetute, ognuna delle quali può funzionare come elemento cis indipendente. Gli enhancer possono funzionare in entrambe le orientazioni, possono trovarsi anche a considerevole distanza dal gene che regolano, ma per definizione devono trovarsi sullo stesso filamento del gene che controllano Le sequenze enhancer mantengono la loro funzione anche al di fuori dal contesto in cui normalmente si trovano

45 ELEMENTI TRANS: detti anche fattori di trascrizione. Riconoscono e si legano a sequenze di DNA, promuovendo, grazie all interazione con l RNA polimerasi II, la corretta espressione di un gene. A differenza degli elementi cis, gli elementi trans sono codificati da geni che si trovano su di una molecola di DNA diversa da quella che contiene il gene da regolare

46 I FATTORI DI TRASCRIZIONE presentano motivi strutturali simili e vengono classificati in base a questi motivi strutturali Dominio che funge da adattatore per il legame con altri elementi trans Dominio che riconosce e lega gli elementi cis

47 Helix-turn-helix I fattori di trascrizione Helix-turn-helix legano il DNA sempre in forma di dimeri. Una α-elica per monomero è impegnata nella formazione del dimero, la seconda α-elica per monomero è impegnata nel legame con il DNA lungo il solco maggiore

48 Leucine zipper Nei fattori di trascrizione Leucine zipper ogni monomero contiene una α- elica dove ogni 7 aa si trova una Leu. Le leucine zipper legano il DNA nel solco maggiore in forma di dimeri.

49 Zinc-fingerc I fattori di trascrizione Zinc finger non formano necessariamente dei dimeri, ma legano il DNA sempre nel solco maggiore. L interazione col DNA avviene attraverso una protrusione data dallo ione Zn che è coordinato alla proteina attraverso 4 cys o attraverso una combinazione di cys e his. Una Zinc finger può presentare da 2 a 9 di queste protrusioni che interagiscono in successivi solchi maggiore del DNA

50 DNA-FOOTPRINTING DMS: dimetil solfato Nel mais il gene Adh1 presenta una regione promotore formata da molti elementi cis che regolano la trascrizione di Adh1 in risposta all ipossia. Controllo Trattato L ipossia determina il reclutamento di elementi trans che si legano ad elementi cis posizionati a -180, -130, -110 e -100

51 DNA footprinting DNA marcato ad una estremità con 32 P Proteina specifica (elemento trans) Tagli della DNasi Tagli della DNasi Frammento marcato con 32 P Profilo elettroforetico Frammento marcato con 32 P