La trascrizione negli eucarioti. Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie

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1 La trascrizione negli eucarioti

2 Il promotore eucariotico L inizio della trascrizione negli eucarioti necessita della RNA polimerasi e dei fattori di trascrizione. Qualsiasi proteina sia necessaria per l inizio della trascrizione, ma non sia parte della polimerasi, è un fattore di trascrizione L inizio della trascrizione necessita di un gran numero di questi fattori, che legano varie sequenze cis-agenti. Il promotore eucariotico è l insieme di tutti questi siti di legame; la polimerasi si lega solo vicino al sito di inizio, non contatta le regioni a monte del promotore. Qunidi sono i fattori di trascrizione che riconoscono il promotore e creano una struttura riconosciuta dall enzima. fattori generici di trascrizione Le sequenze che costituiscono il promotore sono localizzate vicino al sito di inizio e sono necessarie per l inizio stesso. La presenza dei siti intensificatori (enhancer) invece stimola l inizio. Queste sequenze si possono trovare anche a grande distanza dal sito di inizio, e sono il bersaglio per la regolazione dell espressione tessuto specifica o temporale. La regolazione negli eucarioti è positiva.

3 Le RNA polimerasi eucariotiche Distinte sulla base della sensibilità all octapeptide biciclico α-amanitina: RNA polimerasi I (trascrizione dello rrna ribosomale): non è inibita; RNA polimerasi II (trascrizione dei geni strutturali): inibita a basse concentrazioni; RNA polimerasi III (trascrizione dei piccoli RNA): inibita da alte concentrazioni. Tutte e tre sono enzimi di dimensioni notevoli (>500 kd, 12 subunità). Sono in grado di effettuare sintesi di RNA dipendente da stampo, ma non sono in grado di iniziare in maniera seletiva al promotore. β β α Composizione della RNA pol. II di S. cerevisiae. Le subunità più grandi sono omologhe a β e β. Tre subunità sono comuni alle altre due polimerasi Il dominio carbossi-terminale (CTD) è unico della RNA polimerasi II E formato da ripetizioni multiple di una sequenza consenso di 7 amminoacidi. Può essere fosforilato su serina e treonina durante la reazione di inizio.

4 Il promotore è definito con l analisi mutazionale e con la tecnica dell impronta Il primo stadio nella caratterizzazione di un promotore è la definizione delle sue dimensioni minime. il frammento di DNA che contiene tutti gli elementi cis-agenti necessari per il corretto funzionamento. I sistemi usati sono gli ovociti di X. laevis; la trasfezione; gli animali transgenici; i sistemi in vitro. E necessario cambiare solo il promotore. Siccome la terminazione non avviene in maniera accurata nei sistemi artificiali, si taglia lo stampo così da produrre un trascritto di lunghezza definita.

5 Il promotore è definito con l analisi mutazionale e con la tecnica dell impronta Si comincia con un frammento di DNA in grado di far iniziare la trascrizione in uno dei sistemi sopra descritti. Poi le estremità del promotore vengono definite riducendo le dimensioni da ciascuna delle estremità, fino a quando il promotore cessa di essere attivo. Una volta che le regioni più importanti sono state definite in maniera grossolana, si può effettuare un analisi più fine introducendo mutazioni puntiformi. Questi approcci hanno riservato grosse sorprese nella definizione dei promotori della RNA polimerasi III.

6 Il promotore della RNA polimerasi I Composto da due sequenze da -45 a +20: sufficiente per l inizio; ricca in GC, tranne una sequenza ricca in AT vicina all inizio; vi si lega un fattore formato da 4 proteine (core pr.) una è TBP (vedi dopo) da -180 a -107: stimola l inizio, anche questa ricca in GC; vi si lega la proteina UBF. La distanza tra le due sequenze è importante per la fase. Il legame della proteina UBF (che avviene per primo) facilita il legame dell altro fattore, al quale si lega poi la polimerasi I.

7 I promotori della RNA polimerasi III I promotori dei geni dell RNA ribosomale 5S e dei trna sono interni per il gene dell RNA ribosomale 5S il promotore si estende da +55 a +80. Questo è stato determinato mediante analisi di delezione. Successive analisi mutazionali hanno identificato due sottotipi tipo 1, contenente box A e box C; tipo 2, contenente box A e box B. Il promotore del piccolo RNA nucleare U6 ha una struttura più canonica tipo 3, contenente tre elementi conservati, Oct, PSE e TATA nella regione a monte.

8 Il promotore 1 della RNA polimerasi III TF III A si lega per primo membro della classe di proteine a dito di Zinco TF III A aiuta TF III C a legare box C. La contemporanea presenza di TF III A e TF III C permette a TF III B di legarsi al sito di inizio. TF III B recluta la RNA polimerasi III. Una volta che TF III B si è legato, TF III A e TF III C possono anche essere rimossi fattori di assemblaggio TF III B resta legato al sito di inizio e la sua presenza è sufficiente per permettere alla polimerasi III di legarsi. I promotori di tipo 1 si trovano solo nei geni per l RNA ribosomale 5S.

9 I promotori 2 e 3 della RNA polimerasi III TF III C lega sia box A che box B TFIIC è un complesso di 6 subunità, di dimensioni (> 500 kd) comparabili alla RNA polimerasi III Questo permette a TF III B di legarsi al sito di inizio e, in seguito, di reclutare la polimerasi Il fattore di posizionamento TF III B è formato da 3 subunità: TBP, presente anche in TF II D (vedi dopo); Bfr, omologo di TF II B (vedi dopo); B contribuisce alla bolla di trascrizione I promotori di tipo 3 assemblano un complesso di pre-inizio che recluta la pol III. L elemento di sequenza TATA (l unico essenziale) serve per il posizionamento della polimerasi III.

10 Il promotore della RNA polimerasi II Ci sono due regioni in cui la sequenza è conservata nei promotori della pol II: il sito di inizio - la forma più essenziale del promotore la sequenza TATA (TATA box) La procedura di associazione comincia con il legame del fattore generico di posizionamento TF II D alla TATA box. TF II D è formato da due classi di polipeptidi la TBP (TATA binding protein) è una piccola proteina (30 kd) che lega la TATA box; i TAF (TBP associated factors), con pesi molecolari tra i 30 e i 250 kd. TF II D raggiunge le dimensioni di 800 kd, essendo formato da TBP e da circa 11 TAF.

11 La TBP è presente in tutti i fattori di posizionamento Nei promotori della RNA polimerasi III TF III B (che contiene la TBP) si lega a TF III C. Nei promotori della RNA polimerasi I il fattore di legame al core (che contiene la TBP) è facilitato nel legame al DNA dalla presenza di UBF1. Nei promotori della RNA polimerasi II TBP lega direttamente la sequenza TATA per gli altri promotori il legame al DNA è compito di altre proteine. Compito della TBP è, in maniera diretta o indiretta, il posizionamento della RNA polimerasi (I, II o III) sul sito di inizio.

12 La TBP lega il DNA in maniera atipica La TBP lega il DNA nel solco secondario (minore) tipicamente le proteine che legano il DNA contattano la doppia elica nel solco principale (maggiore). La TBP contatta la doppie elica da un lato. La superficie interna della TBP lega la doppia elica, mentre la più ampia superficie esterna è disponibile per l interazione con altre proteine. La regione di legame al DNA è il C-terminale, che è conservato tra le specie (80% tra uomo e lievito). TBP si lega nel solco secondario e piega il DNA di 80 ; la TATA box si piega verso il solco maggiore, allargando il solco minore. La curvatura del DNA permette agli altri fattori di trascrizione ed alla RNA polimerasi di contattare il DNA in maniera più intima di quanto non sarebbe possibile con una molecola lineare. La presenza della TBP nel solco secondario e di altre proteine nel solco principale crea un alta densità di contatti proteina-dna: il legame di TF II D protegge il DNA da -45 a -10.

13 Il complesso di inizio L assemblamento del complesso di inizio procede a stadi seguendo una determinata sequenza. Il primo evento è il legame di TF II D alla TATA. Il legame di TF II A aumenta la regione di DNA contattata da TF II D. Poi si lega TF II B. TF II B contatta il solco secondario a valle della TATA box (proteggendo il DNA da -10 a +10) ed il solco principale a monte della TATA. TF II B probabilmente fornisce la superficie che sarà contattata dalla polimerasi, posizionandola correttamente.

14 Il complesso di inizio Il fattore TF II F è un eterotetramero composto da due tipi di subunità RAP74 è una elicasi ATP-dipendente potrebbe aprire i due filamenti di DNA RAP38 è simile alla parte del fattore σ che lega la RNA polimerasi batterica lega fortemente la RNA polimerasi II. TF II F probabilmente recluta la RNA polimerasi II nel complesso di inizio. Il legame della polimerasi protegge il DNA fino alla posizione +20. Nella sequenza di assemblaggio, i fattori fino a TF II F hanno il compito di portare la RNA polimerasi II sul promotore. I fattori successivi hanno il compito di far iniziare la trascrizione alla polimerasi. Il primo dei fattori che entra in gioco dopo il legame della polimerasi è TF II E.

15 L inizio della trascrizione Dopo TF II E si legano TF II H e TF II J. TF II H ha varie attività enzimatiche ATPasi (fonte di energia); elicasi (per separare i due filamenti di DNA); chinasi (fosforila il CTD dalla polimerasi II). TF II E e TF II H, usando idrolisi di ATP, aprono in due filamenti di DNA e permettono alla RNA polimerasi II di iniziare la trascrizione la polimerasi sintetizza il primo legame fosfodiestere tra i primi due nucleotidi A questo punto l attività chinasica di TF II H fosforila il CTD, e questo permette alla polimerasi di iniziare la fase di elongazione. La maggior parte dei fattori di trascrizione si staccano e possono iniziare un nuovo ciclo di inizio su un altro promotore.

16 TF II H è coinvolto anche nella riparazione del DNA Il filamento stampo di un gene trascritto è riparato prefernzialmente in seguito a danno UV. TF II H, oltre che nell inizio della trascrizione, è coinvolto nella riparazione del DNA. Il fattore esiste in forme diverse a seconda della funzione che deve svolgere. La forma base di di TF II H è un core composto da 5 subunità. Nella forma di attiva nella trascrizione, il core è associato ad un complesso che ha attività chinasica fosforila il CTD della polimerasi. In una forma alternativa, il core è associato ad un gruppo di proteine coinvolte nella riparazione XPC riconosce il DNA danneggiato, quando la polimerasi si ferma a causa di un danno riparazione preferenziale del filamento stampo XPG e XPF: endonucleasi. Il complesso chinasico e quello della riparazione possono associarsi e dissociarsi reversibilmente TFIIH si dissocia dopo 50 bp di trascrizione, e si riassocia a siti danneggiati. Xeroderma pigmentoso e sindrome di Cockayne.