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1 TRASCRIZIONE

2 LA TRASCRIZIONE E IL PROCESSO ATTRAVERSO CUI SI PASSA DAL LINGUAGGIO DESOSSIRIBONUCLEOTIDICO DEL DNA A QUELLO RIBONUCLEOTIDICO DELL RNA

3 ATTRAVERSO LA TRASCRIZIONE NON VENGONO SINTETIZZATI SOLO GLI RNA CHE CODIFICANO PROTEINE (mrna), MA ANCHE SVARIATI ALTRI TIPI DI RNA (trna; rrna; E PICCOLI RNA NON CODIFICANTI QUALI: snrna; snorna; scrna; mirna etc ) CHE SVOLGONO FUNZIONI CHIAVE NELLA FISIOLOGIA DELLA CELLULA.

4 IN GENERALE IL PRODOTTO (RNA) DELLA TRASCRIZIONE PRENDE NOME DI TRASCRITTO. L INSIEME DI MOLECOLE DI RNA (CLASSICAMENTE mrna) ALL INTERNO DI UN BEN PRECISO MOMENTO DELLA VITA DI UNA SPECIFICA CELLULA, COSTITUISCONO IL SUO TRASCRITTOMA.

5 GENE EXPRESSION FLOWCHART

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8 Il primo passo attraverso cui una cella inizia ad interpretare le sue istruzioni genetiche è copiare una particolare porzione della sua sequenza nucleotidica del DNA, un gene, in una sequenza nucleotidica di RNA. L informazione in RNA, sebbene copiata in un'altra forma chimica, viene comunque scritta essenzialmente nella stessa lingua del DNA attraverso il linguaggio di una sequenza nucleotidica. Da qui il nome di trascrizione.

9 5 3

10 RNA chain is extended by one nucleotide at a time in the 5 -to-3 direction. The substrates are nucleoside triphosphates (ATP, CTP, UTP, and GTP); as in DNA replication, the hydrolysis of high-energy bonds provides the energy needed to drive the reaction forward.

11 GENERALMENTE SOLO UNA DELLE DUE ELICHE DI DNA VIENE COPIATA COME RNA. IL FILAMENTO CHE FUNGE DA STAMPO E DETTO FILAMENTO SENSO, MENTRE L ALTRO FILAMENTO (CHE AVRA SEQUENZA IDENTICA ALL RNA DI NEOSINTESI, A MENO DELLA T IN LUOGO DELL U), E DETTO ANTISENSO (O NON SENSO). UNO STESSO FILAMENTO PUO ESSERE SENSO IN ALCUNI TRATTI ED ANTISENSO IN ALTRI! LA DIREZIONE DI SINTESI DELL RNA AVVIENE SEMPRE SECONDO L ANDAMENTO 5-3!

12 RNA polymerase transcribes the longest known mammalian genes, containing 2 X 10 6 base pairs, without dissociating from the DNA template or releasing the nascent RNA. Since RNA synthesis occurs at a rate of about 1000 nucleotides per minute at 37 C, the elongation complex must remain intact for more than 24 hours to assure continuous RNA synthesis. DNA is transcribed by the enzyme RNA polymerase BRUCO DI GEOMETRIDE When RNA polymerase molecules follow hard on each other s heels in this way, each moving at about 20 nucleotides per second (the speed in eucaryotes), over a thousand transcripts can be synthesized in an hour from a single gene.

13 Although RNA polymerase catalyzes essentially the same chemical reaction as DNA polymerase, there are some important differences between the activities of the two enzymes: 1) First, and most obviously, RNA polymerase catalyzes the linkage of ribonucleotides, not deoxyribonucleotides; 2)Second, unlike the DNA polymerases involved in DNA replication, RNA polymerases can start an RNA chain without a primer. 3) Unlike DNA, RNA does not permanently store genetic information in cells. RNA polymerases make about one mistake for every 10 4 nucleotides copied into RNA (compared with an error rate for direct copying by DNA polymerase of about one in 10 7 nucleotides), and the consequences of an error in RNA transcription are much less significant than that in DNA replication.

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16 PROBLEMA TOPOLOGICO

17 TOPOISOMERASI I RISOLVE IL SUPERAVVOLGIMENTO POSITIVO E NEGATIVO (NEGLI EUCARIOTI) O SOLO NEGATIVO (NEI PROCARIOTI) OPERANDO UNA ROTTURA A SINGOLO FILAMENTO NEL DNA NON C è CONSUMO DI ATP!

18 TOPOISOMERASI II RISOLVONO IL SUPERAVVOLGIMENTO POSITIVO E NEGATIVO OPERANDO UNA ROTTURA A DOPPIO FILAMENTO NEL DNA C è CONSUMO DI ATP! NEI BATTERI LA GIRASI 1 è UNA TOPOISOMERASI II CHE INTRODUCE SUPERAVVOLGIMENTI NEGATIVI PER FAVORIRE TRANSIZIONI STRUTTURALI (ES.:APERTURA DELLA DOPPIA ELICA AD INIZIO TRASCRIZIONE O DUPLICAZIONE). 1 LA DNA GIRASI DI E.coli E UN TETRAMERO COSTITUITO DA DUE SUBUNITA OGNUNA DELLE QUALI BERSAGLIO DI ANTIBIOTICI GyrA, SU CUI AGISCE L AC. NALIDIXICO (ANTIBIOTICO CHINOLONICO USATO PER INFEZIONI VIE URINARIE); GyrB, SU CUI AGISCE LA NOVOBIOCINA (VALIDO CONTRO LE INFEZIONI CAUSATE DA BATTERI COCCHI GRAM POSITIVI (ENTEROCOCCO, STRAFILOCOCCO E PNEUMOCOCCO))

19 TRANSCRIPTION IN PROCARYOTES APOENZIMA (core) OLOENZIMA (esistono diverse subunità σ)

20 Bacterial RNA polymerases are composed of two related large subunits (β and β), two copies of a smaller subunit (α), and one copy of a fifth subunit (ω) that is not essential for transcription or cell viability but stabilizes the enzyme and assists in the assembly of its subunits.

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23 Initiation RNA polymerase 4 core subunits Sigma factor (σ) determines promoter specificity Core + σ = holoenzyme Binds promoter sequence Catalyzes open complex and transcription of DNA to RNA

24 RNAP binds specific promoter sequences Sigma factors recognize consensus -10 and -35 sequences

25 A consensus nucleotide sequence is derived by comparing many sequences with the same basic function and tallying up the most common nucleotide found at each position The promoters are characterized by two hexameric DNA sequences, the 35 sequence and the 10 sequence named for their approximate location relative to the start point of transcription (designated +1).

26 RNA polymerase promoters TTGACA TATAAT Deviation from consensus -10, -35 sequence leads to weaker gene expression

27 Bacterial sigma factors Sigma factors are transcription factors Different sigma factors bind RNAP and recognize specific -10,-35 sequences Helps melt DNA to expose transcriptional start site Most bacteria have major and alternate sigma factors Promote broad changes in gene expression E. coli 7 sigma factors B. subtilis 18 sigma factors Generally, bacteria that live in more varied environments have more sigma factors

28 Sigma factors Sigma subunit Type of gene controlled # of genes controlled s 70 s 54 s S s S s F s 32 RpoD Growth/housekeeping ~1000 RpoN N2; stress response ~15 RpoS Stationary phase, virulence ~100 RpoH Heat shock ~40 RpoF Flagella-chemotaxis ~40 RpoE Extreme? heat shock, unfolded proteins ~5 FecI Ferric citrate transport ~5 E. coli can choose between 7 sigma factors and about 350 transcription factors to fine tune its transcriptional output An Rev Micro Vol. 57: T. M. Gruber

29 σ 54 differisce dagli altri fattori σ perché è in grado di legare il promotore anche in assenza del core enzimatico (alpha/beta)

30 What regulates sigma factors Number of copies per cell (σ 70 more than alternate) Anti-sigma factors (bind/sequester sigma factors) Levels of effector molecules Transcription factors

31 Bacterial RNAP numbers In log-phase E. coli: ~4000 genes ~2000 core RNA polymerase molecules ~2/3 (1300) are active at a time ~1/3 (650) can bind σ subunits. Competition of σ for core determines much of a cell s protein content.

32 Enhancers IN ALCUNI CASI L RNA POLIMERASI HA BISOGNO DI ATTIVATORI PER POTER ESSERE SALDAMENTE ANCORATA Al PROMOTORE (RECRUITMENT). ES: CAP (CATABOLITE ACTIVATOR PROTEIN) IN OPERON Lac.

33 Rho-independent termination Termination sequence has 2 features: Series of U residues GC-rich self-complimenting region GC-rich sequences bind forming stem-loop Stem-loop causes RNAP to pause U residues unstable, permit release of RNA chain

34 Rho-dependent termination Rho is hexameric protein base segment of RNA wraps around Rho has ATPase activity, moves along RNA until site of RNAP, unwinds DNA/RNA hybrid Termination seems to depend on Rho s ability to catch up to RNAP No obvious sequence similarities, relatively rare

35 SEQUENZA PALINDROMICA TERMINATORE ρ INDIPENDENTE (O INTRINSECO): 1) Forcina nella struttura secondaria dell RNA; 2) Serie di ca. 6 U all estremo finale dell unità.

36 TERMINATORE ρ DIPENDENTE LE SEQUENZE NECESSARIE PER LA TERMINAZIONE RHO-DIPENDENTE SONO LUNGHE BASI (RICCHE IN C E POVERE IN G) E SI TROVANO A MONTE DEL TERMINATORE.

37 RHO è UNA PROTEINA DI 46KD CHE ESAMERIZZA (275KD) ED HA ATTIVITA ATP-asica! RHO INTERAGISCE CON L RNA DIRETTAMENTE (RICONOSCENDO SEQ. SPECIFICHE QUINDI INSEGUE (MODELLO DELL INSEGUIMENTO) LA RNA-POLIMERASI FINO A RAGGIUNGERE LA SEQUENZA DI TERMINAZIONE E MEDIANTE ATTIVITà ELICASICA PERMETTE LA SEPARAZIONE DELL IBRIDO RNA/DNA ED IL CONSEGUENTE DISTACCO DELLA MOLECOLA DI RNA

38 IN E. coli il DNA possiede sette copie di tratti di DNA ciascuno dei quali possiede seq. per rrna 16S, 23S e 5S, oltre a sequenze per trna vari. IN ALCUNI trna di ARCHEA E CIANOBATTERI SONO STATE IDENTIFICATE DELLE SEQ. INTRONICHE CHE FUNGONO DA RIBOZIMI E SONO IN GRADO DI AUTOELIMINARSI (SELF-SPLICING) SPLICING)

39 VIDEO TRASCRIZIONE IN PROCARIOTI

40 TRANSCRIPTION IN EUCARYOTES 3 RNA-POLIMERASI, COSTITUITE DA UN CORE ENZIMATICO E DA FATTORI GENERALI DI TRASCRIZIONE O GTF. I GTFs DELLA POLII SONO ALMENO 7: TFIIA; TFIIB; TFIID; TFIIE; TFIIF; TFIIH; TFIIJ. NOME RNA POL I RNA POL II RNA POL III LOCAL. CELL. TIPO RNA Nucleolo 45S (28S; 18S; 5.8S rrna) Nucleoplasma Nucleoplasma mrna; snrna; snorna; mirna trna; 5S rrna; scrna; alcuni snrna SENSIBILITA a-amanitina

41 RNA POLIMERASI II SOMIGLIANZA STRUTTURALE DELLA POL II EUCARIOTICA CON LA POLIMERASI BATTERICA. LA POL II E PIU GRANDE DELLA POLIMERASI PROCARIOTICA (12 SUBUNITà A FRONTE DI 5)

42 GENE CODIFICANTE PROTEINE EUCARIOTICO Promotore geni codificanti proteine!

43 STRUTTURA DEL PROMOTER DEI GENI EUCARIOTICI CODIFICANTI PROTEINE NOTA: ESISTONO ANCHE PROMOTERS TATA LESS

44 TATA-BOX CONSENSUS SEQUENCE

45 LA TATA BOX NON E L UNICA SEQUENZA CHE SEGNALA L INIZIO DELLA TRASCRIZIONE MA PER MOLTI PROMOTORI DELLA POLII E LA PIU IMPORTANTE!

46 TBP SI ASSOCIA INSIEME CON ALTRI 8-12 FATTORI GENERALI DI TRACRIZIONE (GTFs) A FORMARE IL TFIID BENDING

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48 TATA BOX BINDING PROTEIN TBP Saddle-like domain TATA BOX DNA BINDING

49 TAF5 stabilizes TAFs interaction, specially histone- like ones (TAF6, TAF9) TAF1: Acetyl transferase activity Interaction with TFIIF TAF3 TAF12 TAF8 TAF4 TAF4 TAF10 TBP TAF7 TAF6TAF11TAF11 TAF5 TAF5 TAF9TAF13 TAF13 TAF12 TAF11 TAF8 TATA BOX TAF13 TAF6 TAF9 TAF10 TAF3

50 DNA BENDING

51 TFIID

52 HETEROTRIMER (A, B, C SUBUNITS) BINDS PROMOTER REGION WITH TFIID TFIIA DAB TFIID TFIIB TWO DOMAIN: N-TERMINAL Zn-RIBBON AND TFIIF CORE DOMAIN HETEROTETRAMER (RAP30) 2 (RAP74) 2 (RAP30) 2 BINDS RNA POL II AND TFIIB. RAP74 INTERACTS WITH DNA. TFIIF STABILIZES THE INTERACTION OF RNA POLII WITH PROMOTER AND STIMULATES ELONGATION RATE TFIIE TFIIH TFIIB INTERACTS WITH SADDLE-LIKE LIKE DOMAIN OF TBP AND WITH BENDED DNA ON SIDES OF TATA BOX. TBP/TFIIB COMPLEX RECRUITS RNA POLII AND OTHER GTF P TFIIE MODULATES THE HELICASE AND KINASE ACTIVITIESOF TFIIH BY STIMULATING CTD DOMAIN RNA POLII PHOSPHORYLATION TFIIH STIMULATES PROMOTER PHOSPHORYLATION OF MELTING AND IT RNA POLII CTD HAS KINASE STIMULATES PROMOTER ACTIVITY AGAINST RNA MELTING AND POL II TRANSCRIPTION START NOTE: TFIIH HAS BOTH HELICASE AND KINASE ACTIVITIES

53 VIDEO

54 UNA VOLTA CHE LA POLII HA INIZIATO AD ALLUNGARE IL TRASCRITTO DI RNA LA MAGGIORPARTE DEI GTF VIENE RILASCIATA DAL DNA COSI DA DIVENTARE DISPONIBILE PER INIZIARE UN NUOVO CICLO DI TRASCRIZIONE CON UNA NUOVA MOLECOLA DI RNA POL!

55 LA FOSFORILAZIONE DEL DOMINIO C-TERMINALE (CTD) DELLA POLII DETERMINA UN CAMBIAMENTO CONFORMAZIONALE TALE CHE SULLA POLII VENGONO CARICATE COMPONENTI DEL MACCHINARIO DI MODIFICAZIONE DELL RNA CHE COSI INIZIA AD ESSERE MODIFICATO GIA DAL MOMENTO IN CUI VIENE SINTETIZZATO!

56 STEPWISE MODEL vs HOLOENZYME MODEL A stepwise assembly model for transcription initiation

57 A pre-assembly model

58 ENHANCER È IL TERMINE USATO PER DEFINIRE SPECIFICHE SEQUENZE DI DNA IN GRADO DI AUMENTARE L'EFFICACIA DEI PROMOTORI NELL'ATTIVAZIONE DELLA TRASCRIZIONE. GLI ENHANCER SVOLGONO IL LORO RUOLO ATTRAVERSO L'ASSOCIAZIONE CON DIVERSE PROTEINE, TRA CUI DIVERSI FATTORI COINVOLTI NELL'AVVIO DELLA TRASCRIZIONE STESSA. NEI GENI DEGLI EUCARIOTI GLI ENHANCERS POSSONO DISTARE DALLA REGIONE CODIFICANTE ANCHE PIÙ DI 50 KB.

59 IL SILENCER È UNA SEQUENZA DI DNA IN GRADO DI LEGARE DEI FATTORI DI TRASCRIZIONE DETTI REPRESSORI. QUANDO IL SILENCER È LEGATO DAL REPRESSORE, L RNA POLIMERASI NON È IN GRADO DI INIZIARE LA TRASCRIZIONE. ATTRAVERSO IL RICONOSCIMENTO DI SITI SPECIFICI, I FATTORI DI TRASCRIZIONE SPECIFICI (STFs) POSSONO PERMETTERE LA ATTIVAZIONE/REPRESSIONE DI GENI IN MANIERA TESSUTO-SPECIFICA SPECIFICA O A SEGUITO DI SPECIFICI CAMBIAMENTI DELL AMBIENTE INTRA OD EXTRACELLULARE!

60 ATTRAVERSO IL RICONOSCIMENTO DI SITI SPECIFICI, I FATTORI DI TRASCRIZIONE SPECIFICI (STFs) POSSONO PERMETTERE LA TTIVAZIONE/REPRESSIONE DI GENI IN MANIERA TESSUTO- SPECIFICA O A SEGUITO DI SPECIFICI CAMBIAMENTI DELL AMBIENTE INTRA OD EXTRACELLULARE!

61 IL MEDIATORE The human Mediator complex is a large, multi-subunit protein assembly that exists in 2 major forms: a core complex that contains 26 subunits and is 1.2 MDa in size, and a CDK8-Mediator complex that contains 29 subunits (25 shared with the core Mediator complex) and is approximately 1.8 MDa in size.

62 IL MEDIATORE The core complex (typically referred to as Mediator) binds the RNA polymerase II (pol II) enzyme and generally serves to activate gene expression; by contrast, the CDK8-Mediator complex cannot bind pol II. Mediator is present from yeast to human, but the amino acid sequence of each individual Mediator subunit has diverged considerably throughout evolution, in part in response to increasingly diverse transcriptional regulatory factors. Because proper regulation of transcription is so critical throughout development, and to prevent tumor formation and a host of other potential disorders, humans have evolved elaborate mechanisms by which the spatial and temporal patterns of gene expression are controlled.

63 IL MEDIATORE Despite the structural and functional diversity of this regulatory machinery, only a select few components polpol II, TFIIH, and Mediator are are considered master regulators of transcription. It is also evident that Mediator acts as a scaffold around which the human Pre-Initiation Complex (PIC) assembles. This central structural role for Mediator can at once explain its general requirement for transcription, its ability to regulate the function of other PIC factors, and its ability to regulate different stages of the transcription cycle (e.g. initiation and elongation).

64 Workman's lab also recently had discovered the most powerful molecular character involved in unwinding a gene, an enzyme called "SWI/SNF" (pronounced "switch-sniff"). SWI/SNF breaks the grip of the histone proteins in the core of the nucleosome spool, liberating the gene on that stretch of DNA so it can unwind far enough to be accessible to another molecule, the "Transcription Enzyme," whose job is to move along the gene's length coping its code. Other molecules then use this copy to make proteins, which do the work specified by the gene.

65 TERMINAZIONE DELLA TRASCRIZIONE NEI GENI EUCARIOTICI DUE PROTEINE (CstF Fattore di stimolazione del taglio F; CPSF Fattore di specificità del taglio e della poliadenilazione) SONO PARTICOLARMENTE IMPORTANTI. ENTRAMBE SONO TRASPORTATE CON LA CODA DELLA RNA POLIMERASI E SONO TRASFERITE ALL ESTREMITà 3 DELLA CATENA DI RNA NASCENTE.

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67 L mrna SUBISCE MOLTE MODIFICHE PRIMA DI ESSERE ESPORTATO DAL NUCLEO AL CITOPLASMA. TALI MODIFICHE SONO ESSENZIALI PER IL SUO TRASPORTO NEL CITOSOL E PER LA SUA SUCCESSIVA TRADUZIONE

68 LEGAME 5-5

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70 IL CAPPING AL 5 E IMPORTANTE PER: 1) ESPORTAZIONE DELL mrna ATTRAVERSO I PORI NUCLEARI; 2) PROTEZIONE DALLA RIBONUCLEASI CITOSOLICHE; 3) CONTROLLO POSITIVO DELL INIZIO DELLA TRADUZIONE

71 SPLICING PROCESSO ATTRAVERSO CUI VENGONO ELIMINATI GLI INTRONI 2 REAZIONI DI TRANSESTERIFICAZIONE. IL COMPLESSO RIBONUCLEOPROTEICO (FATTO DA snrna + PROTEINE, A FORMARE LE snrnps) ADIBITO AL CONTROLLO DELLO SPLICING PRENDE NOME DI SPLICEOSOMA (5 molecole di snrna + 50 proteine) PROCESSO ATTIVO, CHE PREVEDE CONSUMO DI ATP!

72 PUO SEMBRARE UNO SPRECO ELIMINARE GLI INTRONI: IN REALTA GLI INTRONI SONO ELEMENTI NECESSARI PERCHè ATTRAVERSO L INCREMENTO DELLE RICOMBINAZIONI, ESSI FACILITANO INDIRETTAMENTE L EXON SHUFFLING!

73 1 STEP: UN NUCLEOTIDE ADENINICO SPECIFICO DELLA SEQ INTRONICA ATTACCA IL SITO DI SPLICING AL 5 E TAGLIA L OSSATURA ZUCCHERO- FOSFATO DELL RNA IN QUEL PUNTO. 2 STEP: L ESTREMITA 3 -OH LIBERA DELL ESONE REAGISCE CON L INIZIO DELLA SEQUENZA ESONICA SUCCESSIVA, UNENDO I DUE ESONI E RILASCIANDO L INTRONE COME UNA STRUTTURA A CAPPIO (O LARIAT) CHE VERRA POI DEGRADATA.

74 LA SEQUENZA CONSENSO GU AG

75 1) IL BRANCH POINT VIENE DAPPRIMA RICONOSCIUTO DALLE PROTEINE BBP ED U2AF; 2) SUCCESSIVAMENTE snrnp U2 SPOSTA BBP ED U2AF MENTRE snrnp U1 SI LEGA ALL ESTREMITA 5 DELL INTRONE; 3) LA TRIPLA snrnp U4/U6/U5 INFINE CONSENTE LE DUE SUCCESSIVE REAZIONI DI TRANSESTERIFICAZIONE. NOTA: LA ROTTURA E RIUNIONE DEI NUCLEOTIDI SONO DOVUTE ALL ATTIVITA DEGLI snrna CHE AGISCONO DA RIBOZIMI.

76 LO SPLICING E UN PROCESSO ORDINATO 1 EVENTO: L EVENTO DI SPLICING AVVIENE COLINEARMENTE ALLA SINTESI DELL RNA (CHE, AVVENENDO IN DIREZIONE 5-3, CONSENTE DI FAR RICONO= SCERE IN MANIERA ORDINATA I SITI DI SPLICING AL 5 ED AL 3, SECONDO UN BEN PRECISO ORDINE); 2 EVENTO: IPOTESI DI DEFINIZIONE DEGLI ESONI (COMPLESSI DI PROTEINE SR (SERINE RICH) LEGANO GLI ESONI MENTRE COMPLESSI hnrnp LEGANO SPECIFICA= TAMENTE GLI INTRONI. CIO PERMETTE ALLO SPLICEOSOMA DI DISTINGUERE SEQ INTRONICHE ED ESONICHE!

77 LA SEQUENZA CONSENSO AT AC AT AC (EUCARIOTI PIU COMPLESSI QUALI MOSCHE, MAMMIFERI E VEGETALI) NELL UOMO SI STIMA CHE LO 0.1% DEGLI INTRONI SIA RIMOSSO DA SPLICEOSOMA AT-AC AC snrnas U4 AT-AC, AC, U6 AT-AC, AC, U11 E U12 FORMANO PARTE DELLO SPLICEOSOMA MINORE CHE PROCESSA I RARI INTRONI AU-AC AC

78 IL TRANS-SPLICING ( SPLICING (TRIPANOSOMI UNICELLULARI, NEMATODI) ESONI DI DUE TRASCRITTI SEPARATI SONO UNITI INSIEME A FORMARE UNA UNICA MOLECOLA DI RNA MATURO. DI NORMA UN SINGOLO ESONE AL 5 VIENE UNITO A TUTTI (TRIPANOSOMI) O AD ALCUNI (NEMATODI) mrna.

79 ESISTONO ANCHE ALTRI TIPI DI INTRONI IL SELF SPLICING VIENE RICHIESTA UNA G ESTERNA 1) INTRONI DI GRUPPO I (SI TROVANO FONDAMENTALMENTE NEI GENI CHE CODIFICANO PER rrna NEI NUCLEI DEGLI EUCARIOTI INFERIORI Tetrahymena thermophila UN CILIATO- E Physarum polycephalum UNA MUFFA MUCILLAGINOSA-, OLTRE CHE IN 3 GENI FAGO T4 SPECIFICI ED IN ALCUNI BATTERI) 2) INTRONI DI GRUPPO II (SI TROVANO PRINCIPALMENTE ALL INTERNO DI GENI PER mrna MITOCONDRIALI) S E L F S P L I C I N G STESSO MECC. DI SPLICING PRINCIPALE

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81 SPLICING ALTERNATIVO Insieme a: uso di promoters alternativi e segnali di poliadenil. alternativi permette di formare diversi mrna maturi da uno stesso gene

82 POLIADENILAZIONE LA PROTEINA PAP (POLI-A POLIMERASI) E RESPONSABILE DELL AGGIUNTA DI UNA SERIE DI A (CA. 200) A VALLE DEL SITO DI TAGLIO DELL mrna.

83 STRUTTURA DELL mrna MATURO 5 Cap 7mGppp 5 untranslated region initiation AUG translated region 3 untranslated region UGA termination polyadenylation signal AAUAAA (A) ~200 poly(a) tail 3

84 GENI DI CLASSE I 1) SONO I GENI CHE CODIFICANO PER GLI rrna 28S; 18S E 5.8S; 2) SONO ORGANIZZATI IN CLUSTER CHE SPESSO SI RIPETONO IN TANDEM; 3) CITOGENETICAMENTE SONO DI= SPOSTI IN REGIONI CROMOSOMALI SPECIFICHE CHE CONVERGONO IN UNA SUB-STRUTTURA NUCLEARE NOTA COME NUCLEOLO

85 PROMOTERS DEI GENI DI CLASSE I I PROMOTERS DEI GENI DI CLASSE I : PRESENTANO SCARSA VARIABILITA ; COSISTONO IN UNA SEQUENZA BIPARTITA NELLA REGIONE CHE PRECEDE IL PUNTO DI INIZIO: SI DISTINGUONO UN NUCLEO DEL PROMOTER (-45/+20) ED UN UCE (UPSTREAM CONTROL ELEMENT) (-180/-107); ENTRAMBE LE REGIONI SONO PARTICOLARMENTE RICCHE IN GC; PERCHE LA TRASCRIZIONE INIZI, DAPPRIMA SI LEGANO DUE FATTORI: UBF1 ED SL1 (TBP + 3TAFs) E SOLO DOPO SI LEGA LA POL I

86 PROMOTER DI GENI DI CLASSE I: PIC

87 MATURAZIONE DEGLI rrna EUCARIOTICI LA SINTESI DEL PRECURSORE DEGLI rrna 28S, 18S E 5.8S È UNA GRANDE MOLECOLA (PRE-rRNA 45S) TRASCRITTA DALLA RNA POL I NEL NUCLEOLO. ANCHE LA MATURAZIONE AVVIENE NEL NUCLEOLO. NUMEROSI PICCOLI RNA NUCLEOLARI (snorna) PARTECIPANO AL PROCESSO

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89 GENI DI CLASSE III 1) CODIFICANO PER I trna; PER L rrna 5S E PER VARI snrna; 2) POSSONO PRESENTARE DEI PROMOTERS INTERNI (ICR); 3) PRIMA DI INIZIARE A TRASCRIVERE LA POL III NECESSI= TA DI TFIII (IN PARTICOLARE DEL FATTORE DI POSIZIONAMENTO TFIIIB)

90 PIC DELLA RNA POLIII trna; rrna5s snrna TFIIIB È COSTITUITO DA TBP E DA ALMENO UN TAF3

91 MATURAZIONE DEI trna MODIFICAZIONI POST-TRASCRIZIONALI DEI TRNA ELIMINAZIONE DELLA SEQUENZA AL 5 (LEADER) ED AL 3 (TRAILER) AGGIUNTA DI CCA AL 3 MODIFICAZIONE DI ALCUNE BASI AZOTATE IN ALCUNI trna ELIMINAZIONE DI UN PICCOLO INTRONE (PRESENTE SOLO NEI trna DEGLI AA. Tyr; Phe; Trp; Lys; Ser; Leu ed Ile) NOTA: IL PROCESSAMENTO AVVIENE NEL NUCLEO DELLE CELL. EUCARIOTICHE, SICCHE NEL CITOPLASMA SI TROVA SOLO trna MATURO

92 CA. 40 DEI 400 GENI NUCLEARI DI trna SONO INTERROTTI CIACUNO DA UN SINGOLO INTRONE. NON ESIST. SEQ. CONSENSO CHE POTREBBERO ESSERE RICONOSCIUTE DAGLI ENZIMI DI SPLICING. STESSE REGOLE GENERALI VALGONO PER trna DI VEGETALI; ANFIBI E MAMMIFERI. LO SPLICING AVVIENE ATTRAV. PROCESSI DI TAGLIO E RIUN.

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94 SOLO IL 4% DEI TRASCRITTI E TRADOTTO!